方法論記事

吸引脂肪から採取した脂肪由来間質細胞を使用したクリティカル·サイズの頭蓋冠欠損モデルの修復

DOI：

10.3791/4221

⸱

2012年10月31日

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1Department of Surgery, Stanford University , 2Department of Surgery, Duke University , 3Department of Surgery, Saint Joseph Mercy Hospital, 4School of Medicine, University of California, San Francisco , 5School of Dentistry, University of California, Los Angeles

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

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このプロトコルは、吸引脂肪や骨格再生を評価するための重要な4ミリメートルサイズの頭蓋冠欠損の作成から脂肪由来の間質細胞の単離を説明します。

要約

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頭蓋顔面骨格の修復および再生には、幹細胞を用いた細胞ベースのアプローチによるde novoの組織形成の約束を提供しています。脂肪由来間質細胞（ASC）は、骨形成軟骨、脂肪細胞、筋原性と分化を受けることができる多能性幹細胞の豊富な供給源であることが証明された。多くの研究では、細胞送達のための様々な足場生体材料の使用により、生体内でのこれらの細胞の骨形成能を検討されている。それが実証されている骨伝導性ハイドロキシアパタイトでコーティングされたポリ（乳酸-co-グリコール酸）（HA-PLGA）のASCと足場シード、臨界サイズの頭蓋冠欠損、自発受けすることができない点で定義されている欠陥を利用することにより、動物の生涯にわたり癒し、効果的に堅牢な骨再生を表示することができます。 in vivoモデルこれは、骨組織を再生することを目的としたトランスレーショナルアプローチの根拠を示しています-携帯コンポーネントおよび生物学的マトリックス。このメソッドは、特定の組織の欠損の修復に向けた前駆細胞の究極的な臨床応用のためのモデルとして機能します。

プロトコル

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1。細胞分離および増殖

  1. すべての患者の同意と実験プロトコルはスタンフォード大学の治験審査委員会（プロトコル＃2188と＃9999）によって検討され、承認された。
  2. 一般的/局所麻酔下での選択科目lipoaspiration手続きからヒト皮下脂肪組織を取得します。
  3. 吸引脂肪の2つの層（ 図1A）があるでしょう。上清は、処理細胞物質の大半が含まれています。底層は、主に生理食塩水が注入される。 脂肪由来間質細胞は、いずれかの層から採取したが、収量は清からはるかに大きいことができます。
  4. 間質血管画分（SVF）を分離し、1Xの等量で広範囲に脂肪吸引を洗うベタジンずに1×PBS（x1）と等量のに続いて2.5％ベタジン（x2）を含む生理食塩水（PBS）、リン酸緩衝。沈殿に洗浄を可能にします。
  5. 滅菌TEを維持するように注意してください処理されたヒト組織による汚染が起こることができるようにプロセス全体chnique。
  6. 底層を吸引除去し、各洗浄後に破棄します。
  7. 50ミリリットルBDファルコンコニカルチューブに脂肪組織のアリコート15ミリリットル。
  8. 37℃ハンクス液でフィルタリング0.075%タイプIIコラゲナーゼの等量（15ml）中（HBSS）℃の水浴中で60分間一定の攪拌下（約180 /分を振る）と脂肪組織を消化 - 各チューブに15分....

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ディスカッション

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吸引脂肪から脂肪由来の間質細胞の単離2は 、これらの細胞は、細胞系統の多種多様に分化してきた。脂肪組織は中胚葉起源からであり、したがって、多能性脂肪由来間質細胞は、中胚葉系統に向かって可能性が高いアプリケーションで最も効果的であろう。骨格組織を生成する能力は、感染症、拒絶反応、および時間3以上の破壊を含む自家移植と合成材料の固有の限界のためにドナー部位の不足与えられた特に重要です。脂肪由来間質細胞は、外科収穫あたりの比較的大きな降伏4との潜在的な自家多能性細胞株を提供する。

間質血管画分と脂肪組織を処理しているときに、それは優れた滅菌技術を維持することが重要です。 lipoaのバルクの性質を与えられた初代培養の汚染の大きなリスクがあります無菌細胞培養フード外の手順で洗浄、消化、遠心分離の複数のステップと組み合わせるspirate。ペレットを皿の上にめっきされたら、表示されているセルの大半はeyrthrocytesなります。脂肪由来間質細胞がプレートに付着した場合や赤血球の溶解緩衝液を添加することができると、これらは無.......

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開示事項

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特別な利害関係は宣言されません。

謝辞

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我々は、我々の研究の支援とコラボレーションのための博士ジョージ·コモンズ博士とディーンVistnesに感謝したいと思います。セントジョセフマーシー病院GMEによってサポートされているこの作品は、歯科および頭蓋顔面研究助成1 R21はDE019274-01、R01EB009689およびRC2 DE020771-02、MTL博士ヒョンに小児再生医療のためのオーク財団とHagey研究所の国立研究所によってサポートされています。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
試薬の名称： 会社 カタログ番号 コメント（オプション）
収穫を脂肪吸引
PBS ギブコ 10010-023
ハンクス液 Cellgro 21から023-CV
コラゲナーゼシグマ C6885-500mgの
セルストレーナーは100μm BDファルコン 352360
0.22μmのフィルター絆創膏トップ500ミリリットルミリポア SCGPT05RE
頭蓋冠の欠陥
Z500ブラシレスMicromotorsUM50C 日本精工 NSKZ500
円形のナイフ4.0ミリメートル Xemax外科 CK40

参考文献

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  1. Levi, B., James, A. W., Nelson, E. R. Human adipose-derived stromal cells heal critical size mouse calvarial defect. PLoS One. 5, (2010).
  2. Zuk, P. A., Zhu, M., Ashjia, P. Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells. Mol. Biol. Cell. 13, 42....

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