軟骨細胞による軟骨細胞外基質の生合成は、機械的刺激を印加することによって影響を受けることができます。このメソッドは、3Dコンストラクトおよび軟骨代謝の誘導された変化の評価にカプセル化された軟骨細胞への動的圧縮歪みを適用する方法について説明します。
このコンテンツを表示するには、JoVEへの購読が必要です。 または、無料トライアルをお申し込みください。
この記事について
サマリー
要約
機械的傷害や変形性関節症などの疾患による劣化によって破損時の関節軟骨は、限られた修復能力に苦しんでいる。この欠点を改善するために、いくつかの医療介入が開発されている。そのような方法の一つは、組織工学軟骨損傷した領域を再浮上することですが、設計された組織は、典型的には、長期的な存続可能性に疑問を投げかけ、ネイティブ軟骨の生化学的特性と耐久性を欠いている。これは、注入材料を保護するために、周囲の組織に頼らず、小焦点欠陥の修理に軟骨組織工学の応用を制限します。開発組織の特性を改善するために、機械的な刺激は、軟骨細胞外マトリックスの合成と同様に設計された組織の結果として得られる機械的特性を向上させるために利用される一般的な手法です。機械的な刺激は、組織への力は、生体内で経験したものと類似の構築に適用されます。この機械的な環境は、部分的には、天然組織1,2の開発と保守を調節していることを前提としている。軟骨組織工学における機械的刺激の最も一般的に適用されたフォームは1Hz 1,3の周波数で約5〜20％の生理的な歪みにおける動的圧縮です。いくつかの研究では、動的圧縮の影響を調査して、それが最終的に開発された4月8日組織の機能的特性に影響を与える、軟骨細胞代謝と生合成にプラスの効果を有することが示されています。本稿では、機械的に、動的圧縮下で軟骨細胞 - アガロースハイドロゲル構造体を刺激し、生化学的および放射性同位体のアッセイを通じて生合成の変化を分析するための方法を示す。また、この方法は容易に機械的刺激の結果として細胞応答におけるどんな潜在的に誘発された変化を評価するために変更することができます。
プロトコル
1。プライマリ関節軟骨細胞の単離
動物の関節の関節面から収穫10月15日全層軟骨スライス（ローカルabbatoirから得られた骨格成熟した牛の中手·指関節など ）。
- 37℃で2時間、ハムF-12（w / v）の中の0.5％プロテアーゼ20mlの100mmペトリ皿とインキュベート℃の場所軟骨スライスハムF-12培地で3回リンスした後、0.15％コラゲナーゼ20mlで37℃で一晩インキュベートハムF-12培地（℃）
- きれいな皿に200メッシュのスクリーンフィルタを介して細胞懸濁液をろ過する。ハムF-12 5mlでフィルターを洗って皿に追加します。 50 mlコニカルチューブに細胞懸濁液を移す。ハムF-12 10mlのペトリ皿を洗い、コニカルチューブに追加します。
- 室温で6から8分間600から800 rcfでチューブを遠心分離します。
- 目を動かさないように確保し、上清を吸引し電子細胞ペレットとハムF-12培地40mlに再懸濁する。
- 6月8日分の600から800 rcfでチューブを遠心分離します。
- 合計3回の手順1.4と1.5を2回以上繰り返します。前に三回目の遠心分離に、攪拌を介してペレットを再懸濁し、細胞をカウントするための500μlのアリコートを得る。
- 血球計および倒立光学顕微鏡とトリパンブルー排除法9を使用....
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
ディスカッション
細胞播種アガロースヒドロゲルへの制御された機械的刺激を加えるための記載された方法は、軟骨代謝に及ぼす動的圧縮力の影響への直接調査を行うことが可能。保持リングと一緒にカスタム·テスト·リグを使用することによって、サンプルの転倒の潜在的な問題を回避するための構成体の横方向の制約を提供した。セットのクルーによって保護死ん加重ローディングプラテンを使用することによって、サンプルの高さの潜在的な違いにもかかわらず、構造物との直接の接触を確実にします。刺激後の細胞の生合成を測定するために放射性同位元素標識法は、動的機械刺激の複数の用途に利用される単一のテスト·リグを考慮して、汚染の可能性を低減します。この方法は簡単に別の機械的負荷モード（ 例えばせん断1,4、緊張1,2）の効果を調べるために、または特定のメカノトランスダクション経路が責任を解明するために適合させることができます。
ove_content ">代表的な結果は、約35％の細胞死少量のコンストラクト細胞性15から17に影響を及ぼしていない機械的な刺.......アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
開示事項
特別な利害関係は宣言されません。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 試薬や機器の名称 | 会社 | カタログ番号 | コメント（オプション） |
| ハムF-12 | サーモフィッシャーサイエンティフィック | SH3001002 | |
| コラゲナーゼ | シグマアルドリッチジャパン（株） | C0130 | |
| プロテアーゼ | シグマアルドリッチジャパン（株） | P5147 | |
| ウシ胎仔血清 | シグマアルドリッチジャパン（株） | F1051 | |
| アスコルビン酸塩 | シグマアルドリッチジャパン（株） | A4034 | |
| 抗生物質/抗真菌薬 | シグマアルドリッチジャパン（株） | A5955 | |
| HEPES | Bioshopカナダ株式会社 | HEP001 | |
| トリパンブルー | シグマアルドリッチジャパン（株） | 93595 | |
| ライヘルトブライトライン 血球計 | Hausser科学 | 1490 | |
| クワント-iTのピコグリーン | インビトロジェン | P7589 | |
| パパイヤラテックスからのパパイン | シグマアルドリッチジャパン（株） | P3125 | |
| 酢酸アンモニウム | シグマアルドリッチジャパン（株） | A1542 | |
| Ethyldiaminetetraacetic酸 | シグマアルドリッチジャパン（株） | E9884 | |
| DL-ジチオスレイトール | シグマアルドリッチジャパン（株） | 43819 | |
| 低融点アガロース、VII型 | シグマアルドリッチジャパン（株） | A9045 | |
| メッシュスクリーン（200）フィルタ | シグマアルドリッチジャパン（株） | S4145 | |
| マッハ1マイクロメカニカルテスター | Biomomentum株式会社 | V500cs | |
| 圧縮ローディングジグ | 特注の | 同様の製品はBiomomentum社によって供給することができる | |
| ファルコン24ウェル培養プレート | サーモフィッシャーサイエンティフィック | B353047 | |
| β - 液体シンチレーションカウンター | ベックマン·コールター | LS6500 | |
| [3H]プロリン | パーキンエルマー | NET323005MC | |
| [35S]硫黄 | パーキンエルマー | NEX041005MC |
参考文献
- Grodzinsky, A. J. Cartilage tissue remodeling in response to mechanical forces. Annual Review of Biomedical Engineering. 2, 691-713 (2000).
- Kuettner, K. E. Biochemistry of articular cartilage in health and disease. Clinical Biochemistry. 25
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
再版と許可
