使用したラット腎移植後の急性拒絶反応の非侵襲的イメージング<sup&gt; 18</sup&gt; F-FDG PET

Alexander Grabner; Dominik Kentrup; Uta Schnöckel; Gert Gabriëls; Rita Schröter; Hermann Pavenstädt; Otmar Schober; Eberhard Schlatter; Michael Schäfers; Stefan Reuter

doi:10.3791/4240

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方法論記事

使用したラット腎移植後の急性拒絶反応の非侵襲的イメージング

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DOI:

10.3791/4240

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2013年4月28日

Alexander Grabner^*¹ , Dominik Kentrup^*¹ , Uta Schnöckel² , Gert Gabriëls¹ , Rita Schröter¹ , Hermann Pavenstädt¹ , Otmar Schober² , Eberhard Schlatter¹ , Michael Schäfers^*³ , Stefan Reuter^*¹

¹Department of Internal Medicine D, Experimental Nephrology, University of Münster, ²Department of Nuclear Medicine, University of Münster, ³European Institute for Molecular Imaging, University of Münster

^* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

我々はここに非侵襲的に18F-フルオロデオキシと陽電子放射断層撮影法を用いた急性同種移植片拒絶反応を評価するために、ラット腎移植モデルを提示する。

要約

末期腎疾患の患者の数、腎同種移植レシピエントの数が増加し続ける。急性細胞の同種移植片拒絶反応（AR）のエピソードは、長期的な同種移植片生存のための負の予後因子であり、そのタイムリーな診断は、同種移植片機能¹のために極めて重要である。現時点では、ARのみ間違い侵襲的な方法として、移植傷害あるいは損失の重大なリスクをむく、コア針生検によって診断することができる。また、生検は、抗凝固薬を服用した患者で実現不可能であり、ARが焦点または斑状である場合は、この手法の限られたサンプリングサイトは偽陰性の結果になることがあります。結果として、これはしばしば、様々な移植モデルの使用を含む動物に行わなければならない新しいAR検出方法に対する継続的な検索をもたらした。

60代前半ラット腎移植はexaminための十分に確立された実験的な方法であるため、AR ² ATIONと分析。さらに小動物陽電子放射断層撮影（PET）が同種片側腎摘出ラット腎移植モデルでARを評価し、非侵襲的に、特定のための新たな選択肢として移植FDG-PETイメージングを提案する¹⁸ F-フルオロデオキシグルコース（FDG）を使用して、我々はここに存在し人間の状況³にもARのと早期診断。さらに、この方法は、移植片拒絶⁴の監視を改善するためのフォローアップのために適用することができる。

プロトコル

1。ドナー臓器の回復

定位顕微鏡、8-10週齢ラットの記録量（ドナーとレシピエントの体重が一致している必要があります）を設定します。
酸素/イソフルラン吸入を（イソフルラン4％/ 2 L /分の酸素）を使用して、ドナーラット（ルイスブラウンノルウェーF1、LBN F1）を麻酔。 2から2.5パーセントにイソフルラン下げることで麻酔を維持します。
手術パッド上麻酔ラットを置きます。パッド上に粘着テープで、ラットの四肢を固定し、ラットの目に眼軟膏（Bepanthen、バイエル）を適用。
剃るとラットの腹部を消毒し、恥骨から肝臓の尾国境に腹側正中切開を行います。慎重に右側に腸を動かすことにより左腎とその血管を公開します。左腎上のガーゼの薄いシートを置き、乾燥を防ぐために温めておいた等張食塩水でそれを湿ら。
慎重に（デュモンアングルティップ鉗子で脂肪組織を解剖デュモンSS-45鉗子イノックス医療、ファイン科学ツール、カタログ番号11203から25）、左尿管を包む。尿管との直接の接触を避け、代わりに、十分な周囲の脂肪組織でそれを動員する。
デュモン斜めヒントピンセットを用いて腎動脈から左腎静脈を分離。両方の血管からすべての脂肪と結合組織を削除して、副腎や精巣血管を焼灼する。
それぞれ、左腎動脈と静脈との接合部の上下大動脈と下大静脈（IVC）を解剖すると、すべての発信動脈を焼灼。
上腸間膜動脈にできるだけ近くに、左腎動脈上顕微クランプ（マイクロSerrefines、ファイン科学ツール、カタログ番号18055から04まで）と副腎大動脈をクランプ。外科絹（5-0、Vömel、アートなし。14739）左腎動脈下約5mmを使って大動脈大動脈を連結。
外科絹（5-0、Vömel）で大動脈IVCを連結し、副腎IVCをクランプ顕微クランプ付き（マイクロSerrefines、ファイン科学ツール、カタログ番号18055から03）。
細かいハサミを（ - ToughCutストレート11.5センチメートル、ファイン科学ツール、カタログ番号14058から11アイリスはさみ）を使用してできるだけ近くIVCに腎静脈を切った。
ゆっくり大動脈大動脈カニューレ（Microlance 3 27G¾、BD、カタログ番号302200）を挿入して2ミリリットルの氷冷HTK灌流液（CUSTODIOL HTK、博士はフランツ·ケーラーChemie社）とその場で腎臓灌流。腎臓の色の変化（現在はオリーブ彩色）ことを確認してください。
まず、最終的に大動脈大動脈と膀胱にできるだけ近い尿管その後、副腎大動脈を横断する。
氷の上でHTK灌流液中尿管や店舗とともに腎臓とその血管供給を削除します。
麻酔下で心臓の血管のクランプと連続した切除を除去することにより、ドナーラットを安楽死させる。

2。受信者の準備とTransplantaる

定位顕微鏡、記録、ラットの体重を設定します。
イソフルラン4％を使用したレシピエントラット（ルイス）を麻酔。 2から2.5パーセントにイソフルラン下げることで麻酔を維持します。
手術パッド上麻酔ラットを置きます。パッド上に粘着テープで、ラットの四肢を固定し、ラットの `sの目に眼軟膏を適用します。直腸温度センサ加温パッドを使用して監視および制御中核体温。手術中に繰り返し温度、呼吸や動物の心拍数を制御します。
剃ると腹部を消毒し、恥骨から肝臓の尾国境に腹側正中切開を行います。皮膚の外傷を最小限にするためにメスforcuttingのスキンを使用。右側に腸を動かすことにより左腎とその血管を公開します。
注意深くデュモン斜めヒント鉗子や綿棒を使って腎カプセルを削除します。
腎近左腎動脈、静脈と尿管を閉塞手術糸を（4-0 Mersilene、エチコン、カタログ番号EH6732H）を使用して2つのライゲーションと門。物品だけ腎門を残して腎臓の大部分は、。綿棒で切断面をきれいにし、出血を確認してください。必要に応じて別の字を追加します。
慎重に綿棒と尾サイトに大動脈大動脈と大静脈をカバーする結合組織を通してぶっきらぼうに解剖する。
デュモン斜めヒントピンセットを用いて大動脈大動脈と大静脈からの目に見える神経を分離。
最初精巣血管の分岐下、および総腸骨血管の分岐上記の2番目の1：慎重に2〜4ミリメートルの長さの2つの開口部を形成し、大動脈大動脈と大静脈の間に結合組織シートを解剖する。間に腸腰動脈と静脈を焼灼。
二つの開口部のそれぞれを通して、シングル手術糸（エチコン、猫no.EH6665E。Mersilene 0）を描画します。これらのスレッドを使用すると、大動脈を引っ張るそっと背サイトに分岐血管へのアクセスを得るための動物の右側に大動脈と大静脈。二つの開口部の間にこれらの血管のいずれかを焼灼し、その後手術のスレッドを削除します。
次に、大動脈と上部開口部から始まり、上部開口（マイクロSerrefinesで下大静脈で終わる4顕微クランプ（マイクロSerrefines、ファイン科学ツール、カタログ番号18055から04）を時計回りに、アプリケーションによって大動脈とIVCを閉塞、ファイン科学ツール、カタログ番号18055から03）。
その後慎重に穴を開ける針で大動脈の孤立部分の上部エンディング（Microlance 3 27G¾、BD、カタログ番号302200）は、細かい春のはさみ（Vannasスプリングはさみの下刃を挿入する - 3ミリメートルブレード、ファイン穿刺開口を通して科学ツール、cat.no 15000から00）と短い縦切開を行います。残りの血液を除去するために氷冷HTK灌流液で孤立大動脈をフラッシュします。
同様に、慎重に穴を開ける針で静脈の隔離部の下部結末は、穿刺口から細かい春のはさみの下刃を挿入し、まもなく大動脈切開下に終わる縦切開を行います。繰り返しになりますが、残りの血液を除去するために容器をフラッシュします。
ストレージソリューションから腎臓移植を削除します。左腎の元の位置の下に配置し、それが正しい方向であることを確認します。
移植腎動脈の向きを確認し、ねじれがないことを確認。その後、移植上のガーゼの薄いシートを配置し、それを冷却するために氷のように冷たいHTK灌流液でそれを湿らせて、乾燥を防ぐために。
アッパーで最初の、その後の下端 - 移植の腎動脈が、手術糸（。Ethilon 9-0、エチコン、猫なし2809G）とに開口する大動脈部分の副腎部の開口部を固定大動脈切開。手術糸を使用して連続縫合で時計回りに切開を閉じ（Ethilon 9-0）、デュモン斜めヒント鉗子と湾曲Castroviejo針ホルダ（ファイン科学ツール、カタログ番号12061から01）。その後、反時計回りに第2の連続縫合糸を通して結合組織を持つ最初の縫合糸をカバーしています。さて、グラフトの大動脈部分の唯一の下部には、閉鎖されていない。定期的に氷のように冷たいHTK灌流液で移植片を冷却する。
縫合糸の気密性と整合性の検証、ならびに移植片の残りの血液を除去グラフトの大動脈片の開放端に挿入された鈍針を通して氷冷灌流HTK溶液1mlで移植片を灌流する。その後、外科絹（5-0、Vömel）と大動脈の部分の開放端を連結。
移植腎静脈の向きを確認し、ねじれがないことを確認。
大静脈に切開の下端にその後、アッパーで最初の - 手術糸（Ethilon 9-0）とグラフトの静脈の開口部を固定。切開を閉じ手術糸（Ethilon 9-0）、デュモン斜めヒント鉗子と湾曲Castroviejo針ホルダーを用いて連続縫合で時計回りに。定期的に氷のように冷たいHTK灌流液で移植片を冷却する。
最大静脈クランプで始まる、顕微クランプを取り外し反時計回り。最後の大動脈クランプを除去した後、慎重に綿棒で、最終的に軽度の出血を止める。数秒後に移植はバラ色の彩色になり、そしてuretric収縮が表示されるはずです。
受信者の `sの膀胱に移植尿管の挿入は慎重Vannasスプリングシザー（学生Vannasスプリングシザーストレート、ファイン科学ツール、カタログ番号91500から09を使用して膀胱の上部にある筋肉の小さなパッチを削除するための）。その後、デュモン角度の先端鉗子を使用して移植尿管から周囲の組織（主に脂肪）を取り外します。したがって、慎重に尿管の先端をつかむと、優しく周囲の脂肪、結合組織を分離し、埋め込まれた血管あちこち反対方向にそれらを引っ張ることによってそれをメートル。手術糸（PROLENE 6-0、エチコン、カタログ番号8697H）の末尾uretric先端を固定し、付属の針で膀胱の予め準備上部を穿孔。膀胱を通して尿管を引いて、第二の穿孔を介してベースでそれを終了します。
手術糸（Ethilon 9-0）で膀胱の上部にある組織を分離した尿管から以前にこだわる。添付された手術糸と尿管の先端を切って静かに下から押して、膀胱に戻し尿管を引っ張る。その後、手術糸（Ethilon 9-0）と第二膀胱穿刺を閉じます。
手術用縫合糸（Mersilene 0）を使用して、連続する二つの独立したが、縫合によって腹壁と皮膚を閉じます。 Pividonヨウ素を使用して傷を消毒し、傷の痛みを制御するために、手術後三日間ブプレノルフィン量（kg / BW /入札当たり0.1 mg）を皮下投与する。

3。イメージング同種移植の拒絶

イソフルラン2から2.5パーセントを使用して非空腹ラットを麻酔。
30 MBqのFDG（0.1ミリリットル0.9％NaCl中30 MBqのFDG）が24 Gカテーテル（ブラウン、Introcan、4252500から01）を使用して、横方向の尾静脈をcatheterizing介して静脈内投与する。その後、0.9ミリリットル0.9％NaCl溶液でカテーテルをパージ。
毎時0.9％NaCl溶液1mlを静脈注射により動物のスキャンの開始とハイドまで麻酔なしで拘束ラットのままにしておきます。
スキャンが開始される直前にイソフルラン2％を使用してラットの再麻酔。
高解像度のマルチワイヤ室ベースの動物PETカメラquadHIDAC（オックスフォード陽電子システムズ株式会社、オックスフォード、英国）で開催麻酔ラット。 PETスキャナの空間分解能が1.0mmで、全FOV（直径165ミリメートル、軸方向長さ280 mm）の上で一定である。パルスオキシメータと直腸温度センサーと制御麻酔を使用してスキャン中にモニタと制御体温。
60メートルの動的取得を開始FDGの腎排泄に起因する腎臓でトレーサーの蓄積を減らすためにFDG-注入後180分を開始した。
¹⁸ F-フッ化物IVの5 MBqのを適用し、腎実質の識別のために^、18 F-クリアランス⁵の計算のためのスキャナでラットの位置を移動することなくすぐに60分間^、18 F-フッ化物注射後に別のPETスキャンを実行します。両方のスキャンから画像を再構成する。手動で2分腎皮質の周りに¹⁸ F-フッ化物注射液（灌流相）後に再構成された画像上で関心体積（VOI）をトレースし、FDG画像にVOIを転送します。慎重にVOIから腎盂を除外します。両方のスキャンから画像を再構成して、手動で腎皮質の周り関心体積（VOI）をトレース。リストモードデータは0.4×0.4×0.4ミリメートル³のボクセルサイズで画像に再構成された。慎重にVOIから腎盂を除外します。
比OによるFDG集積を計算fの合計数と量と注入された投与量（％ID）の割合を計算します。私たちは、画像解析のためのMATLAB（バージョンR2011b、MathWorks社、ナティック、MA、USA）と断層画像（TIM）バージョン2.8を使用していました。