シナプス接続されたニューロンをトレースする方法が記載されている。我々は、目的の細胞集団は遺伝的に定義された種類の細胞からシナプス入力を受け取るかどうかを調べるために上流の細胞のTVAの特異性を利用する。
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この記事について
サマリー
要約
神経回路を研究するための古典的な方法は、かなり低いスループットです。特に経シナプスウイルス、仮性（PRV）と狂犬病ウイルス（RABV）、そして最近では、水疱性口内炎ウイルス（VSV）、回路を研究するために、ますます人気が高まっています。これらのより高いスループット方法は順行性または逆行どちらの方向でもニューロン間の送信、ウイルスを使用しています。
最近では、単シナプス逆行トレースのために修飾されたRABVが開発されました。 （ 図1A）。この方法では、糖タンパク質（G）遺伝子はウイルスゲノムから削除され、標的ニューロンでのみ補給。感染特異性はASLV-糖タンパク質と正常RABV-G1用RABV-G（/ RG）の細胞質ドメインの細胞外ドメインから成るキメラGを代入することによって達成される。このキメラGは具体的にTVAの受容体1を発現している細胞に感染します。をコードする遺伝子TVAはdきできます様々な方法で2月8日 elivered。 TVA発現ニューロンのRABV-Gの感染後、RABVはTVAの受容体との共同配信された、独自のGの性質によって逆方向に他の、シナプス接続されたニューロンに信号を送ることができます。この手法は、定義されたスターター細胞型へのすべての入力のサンプリングを提供し、定義された細胞型への入力の数が比較的多い（5-10％）2にラベルを付けます 。
我々は最近、経シナプストレーサー9としてVSVを使用するには、この手法を変更しました。 VSVのは、遺伝子発現の迅速性など、いくつかの利点があります。ここでは、詳細解像度を上げると超小型回路をプロービングするための有用なVSVを使用して、新しいウイルストレースシステムを。ウィッカーシャムらによるオリジナルの公表戦略。4 Whileとバイエルら TVA発現細胞に感染した当初は上に任意のニューロンと、そのプロジェクトの9許可の標識は、ここにVSVをテレビにのみ送信するように設計されました発現細胞（ 図1B）。ウイルスは最初TVA発現ニューロンのニューロンの下流の感染を可能にするためにRABV-Gでシューされています。細胞のこの第一の集団を感染させた後、リリースされたウイルスは、TVA-発現細胞に感染することができます。経シナプスウイルスの拡散がTVA発現細胞に限られているため、定義された種類の細胞からの接続の有無の存在は、高分解能で調べることができます。これらの実験の実験のフローチャートを図2に示します。ここでは、マウス網膜で方向選択性のあること、モデル回路を示しています。我々は、網膜神経節細胞に星形アマクリン細胞（SACの）（のRGC）の接続性を検証する。
プロトコル
1。 cDNAからウイルスを作る：cDNAを用いワク-T7システム10からVSVの回復
- 実験の前にある日、DMEM + 10％FBSを含む60ミリメートル皿にBsrT7セルを分割する。皿当たり種子2E6細胞。 BsrT7細胞はBHK21、またはベビーハムスター腎臓細胞に由来する。
- 1mM塩化マグネシウムと37から1 mMのカルシウム℃で温PBS
- 少量vTF7-3、T7ポリメラーゼを発現するワクシニアウイルス、室温に解凍を取得します。 vTF7-3 T7ポリメラーゼ11を発現している感染ワクシニアウイルスであり、生物学的安全性レベル2の封じ込めにのみ使用する必要があります。この発現系は、ステップ1.9にトランスフェクションしたプラスミドから目的の転写産物の最大レベルを生成するために使用されています。最高速度で30秒間ボルテックスウイルス。室温で水浴中で2分間卓上ソニケーターで超音波洗浄します。 Vortexは再び30秒間は、ウイルス塊を壊したりすることができます。
- BSRT7細胞からメディアを取り出します。
- 11.7μlのvTF7-3を追加マグネシウムとカルシウムと600μlのPBSへと細胞上に混合物を追加します。
- 5％CO 2で34℃のインキュベーターにプレートを移動します。一度優しくロックプレート10分毎。
- ....
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ディスカッション
神経回路を研究するためにウイルスを使用すると、接続されたニューロンの分析の比較的ハイスループットな方法である。しかし、VSVとRABVビリオンの両方を生成することは簡単ではありません。 cDNAからウイルスを救出するために、上記のプロトコルが用意されていますが、それはまだ低確率イベントです。 N、P、およびLプラスミドのそれぞれのレベルは細かく調整する必要があり、多くの試練とは、ウイルス複製し救助を確保するために実行する必要があります。フルVSVのゲノムRNAを組み込んリボ粒子の形成は、低確率事象であるため、いくつかの試みがかかる場合があります。この手法は、最適化のための時間を必要とするかもしれない、しかし、一度それがウイルスを救出するがはるかに簡単ですが、最適化されています。
RGCの樹アーバー（ すなわち、 図 4A）、重複していないときに、個々のRGCからウイルス伝播の分析は、最善に行われます。ウイルス注入し、注入座標の量が最適な感染症のために調整することができます。また、t彼は注射の場所は、標識されたR.......
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開示事項
特別な利害関係は宣言されません。
謝辞
我々は、技術支援のための組換えVSVの変種を救出の支援のためのショーン·ウィーラン、とDIDEMゴズとライアンChrenekを承認したいと思います。この作品はハワードヒューズ（CLC）、および＃NS068012-01（KTB）によってサポートされていました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 組織培養 | |||
| ベビーハムスター腎臓 (BSRT7) 細胞 | 要望に応じて提供可能 | ||
| ワクシニアウイルス (vTF7-3) | 要望に応じて提供可能 | ||
| pN, pP, pl プラスミド | 要望に応じて提供可能 | ||
| 塩化カルシウム | Sigma | C1016 | |
| 塩化マグネシウム | Sigma | M8266 | |
| HEK 293T 細胞 | Open Biosystems | HCL4517 | |
| 60 mm TC処理済み培養ディッシュ | Corning | 430166 | |
| 75 cm2 通気性キャップ付き矩形傾斜ネック細胞培養フラスコ | Corning | 430641 | |
| 培地：DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) | Invitrogen | 12491-015 | |
| 1 M HEPES pH 7.4 | Gibo | 15630-080 | |
| FBS：ウシ胎児血清 | Gibco | 10437-028 | |
| PKS | Invitrogen | 15140-163 | |
| Lipofectamine 2,000 トランスフェクション試薬 | Invitrogen | 11668-019 | |
| シリンジ：5 ml ルアーロックシリンジ | Sigma | Z248010-1PAK | |
| シリンジフィルター | Nalgene | 190-2520 | |
| PEI：高活性線状PEI | Polysciences | 23966 | |
| ウイルス遠心分離 | |||
| Corning 150 ml チューブトップ真空フィルターシステム、孔径 0.45 μm | Corning | 430314 | |
| 薄壁、超高透明、38.5 ml、25 x 89 mm 超遠心機用チューブ | Beckman-Coulter | 344058 | |
| 超遠心機 | Beckman-Coulter | optima XL-80K | |
| SW28 超遠心機用ローター | Beckman-Coulter | 342207 | |
| マウスへの注入 | |||
| キャピラリーマイクロピペット | Drummond | 5-000-2005 | |
| 脳定位固定装置 | Narishige | SR-5M | |
| マイクロマニピュレーター | Narishige | SM-15 | |
| UMP インジェクター | World Precision Instruments | Sys-Micro4 | |
| 4チャンネルマイクロコントローラー | World Precision Instruments | UMP3 | |
| M.TXB ベンチモーター (C.EMX-1 ダイヤル制御、115 V) | Foredom | M.TXB-EM | |
| H.10 ハンドピース (クイックチェンジ) | Foredom | H.10 | |
| ステップドリル (0.5 mm) | Foredom | A-58005P | |
| マイクロ–電極ホルダー | World Precision Instruments | MEH2S | |
| ケタミン | Henry Schein | 995-2949 | |
| キシラジン | Henry Schein | 4015809TV | |
| ブプレノルフィン | Henry Schein | 1118217 | |
| 1 ml シリンジ | Becton-Dickinson | 309628 | |
| 30ゲージ注入針 | Becton-Dickinson | 305106 | |
| 眼保護用軟膏 | Doctors Foster and Smith | 9N-014748 | |
| エタノール | Sigma | 493511 | |
| ヨウ素 | Sigma | PVP1 | |
| 手術および解剖器具 | |||
| はさみ | Fine Science Tools | 91402-12 | |
| 標準ピンセット | Fine Science Tools | 11000-12 | |
| 微細ピンセット | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| Vannasバネ式はさみ | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| メスハンドル | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| メス刃 | Fine Science Tools | 10015-00 | |
| 縫合糸 | Robbins Instruments | 20.SK640 | |
| 解剖および抗体染色 | |||
| パラホルムアルデヒド | Sigma | P6148 | |
| リン酸緩衝生理食塩水 | Sigma | P4417 | |
| Triton X-100 | Sigma | T9284 | |
| ドンキー血清 | Jackson Immunoresearch | 017-000-121 | |
| 抗体 | |||
| 抗体 | millipore | AB144P | |
| 抗GFP抗体 | Abcam | ab13970 | |
| ドンキー抗ニワトリ Dylight 488 抗体 | Jackson immunoresearch | 703-545-155 | |
| ドンキー抗ニワトリ Alexa Fluor 647 抗体 | Jackson immunoresearch | 705-605-147 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| 組織のマウント | |||
| Superfrost plus 顕微鏡スライドグラス | Fisher | 12-550-100 | |
| カバーガラス 22 x 22, 厚さ 0 | Electron Microscopy Sciences | 72198-10 | |
| シリコンエラストマー | Rogers Corp | HT-6220 | |
| 透明マニキュア | Electron Microscopy Sciences | 72180 | |
| Prolong Gold 退色防止試薬 | Invitrogen | P36930 | |
|
参考文献
- Wickersham, I. R. Monosynaptic restriction of transsynaptic tracing from single, genetically targeted neurons. Neuron. 53, 639-647 (2007).
- Marshel, J. H., Mori, T., Nielsen, K. J., Callaway, E. M. Targeting single neuronal networks for gene expression and ....
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再版と許可
