フローサイトメトリーによる胸腺正と負の選択の検討

Summary

我々は、T細胞の発達を調べるためにフローサイトメトリーベースの方法を提示する野生型またはT細胞受容体トランスジェニック背景に遺伝子操作されたマウスを用いた。

Abstract

健康な免疫システムは、自己抗原に対する寛容を維持しながら、T細胞は外来抗原に反応している必要があります。 T細胞受容体（TCR）αおよびβ遺伝子座のランダム再配置は、自己と外国の両方に、抗原特異性の広大な多様性を有するT細胞レパートリーを生成します。胸腺での開発時にレパートリーの選択は、安全で有用なT細胞を生成するために重要です。胸腺選択の欠陥は、自己免疫疾患および免疫不全疾患^1-4の発展に貢献しています。

T細胞の前駆細胞は、CD4またはCD8コレセプターを発現していないダブルネガティブ（DN）の胸腺細胞として胸腺を入力します。 αβTCRと両方共受容体の発現は、ダブルポジティブ（DP）の段階で発生します。胸腺細胞によって提示された自己ペプチド - MHCとαβTCR（pMHC複合）との相互作用は、DP胸腺細胞の運命を決定する。高親和性相互作用負の選択と消去又はにつながる自己反応性胸腺細胞のる。 CD4または自己MHCによって提示された⁵外来抗原を認識することができるCD8シングルポジティブ（SP）はT細胞の正の選択と開発における低親和性の相互作用の結果。

ポジティブセレクションは、成熟T細胞の生成を観察することによって、ポリクローナル（野生型）TCRレパートリーを持つマウスで検討することができます。しかし、彼らは小さな抗原特異的集団の削除を伴う負の選択の研究のために理想的ではありません。多くのモデル系は、負の選択を検討するが、生理学的事象^6を再現する能力に変化させるために使用されてきた。外来抗原の投与が胸腺細胞^7-9の非特異的欠失につながることができますたとえば、胸腺細胞のin vitroで刺激すると 、親密に選定に関与している胸腺環境を欠いている。現在、 生体ネガティブセレクションで勉強するための最良のツールはtransgを表現するマウスである自己抗原内因用enic TCRの特定。しかし、多くの古典的なTCRトランスジェニックモデルは時期尚早の負の選択で、その結果、DNの段階でトランスジェニックTCRα鎖の早期の発現によって特徴付けられる。私たちの研究室では^、10野生型マウスで発生する負の選択がSP遷移にDPの中に発生することができ、トランスジェニックHYTCRαが条件付きでDPステージで表現されたHYの^CD4モデルを開発しました。

ここでは、HYの^CD4マウスモデルにおける胸腺の正と負の選択を検討するために、フローサイトメトリーベースのプロトコルを記述します。 HYの^CD4マウスにおける負の選択は非常に生理的であるが、これらの方法は、他のTCRトランスジェニックモデルに適用することができます。我々はまた、遺伝子操作されたマウスに適用ポリクローナルレパートリーに正の選択を分析するための一般的な戦略を提示します。

Protocol

実験プロトコルの全体的なスキームについては図1を参照してください。

1。解剖

1. 60×15ミリメートルペトリ皿に置き、無菌スチールメッシュスクリーン。 1単位は、組織サンプルあたり必要とされている。
2. 各皿にハンクス平衡塩溶液（HBSS）5mlを加える。氷の上で料理をしてください。
3. CO ₂とマウスを安楽死させる。
4. 解剖表面へのセキュアなマウス、上向きに腹側。スプレーは殺菌のため70％エタノールでマウスや毛皮がダウンつや消しされていることを確認する。
5. 手術用のハサミを使用して、ちょうど性器上腹部皮膚に腹切開を行うことで、解剖を開始します。あごに切開を上向きに伸びる。
6. 正中線から、すべての手足に沿って切開を下に拡張します。たるんだ皮膚を引いて、切開面にそれを突き止める。
7. 胸腺の収穫：
   1. 切開を作るために胸骨の下部先端を持ち上げます。
   2. 肝臓を避けて、胸郭をデタッチし、各側に胸郭をカットするダイアフラムを切った。肺と心臓を避けるように注意しながら、それぞれの側に胸郭を上方にカットします。
   3. 胸郭バックピンセットで慎重に引き抜いてください。胸腺は心臓の上方に位置する白、両葉性臓器である。ローブの底を把握するために鉗子の平らなエッジを使用して、静かに胸腺を引き、メッシュスクリーンの上に置きます。
8. 脾臓を回収します。
   1. 脾臓は肝臓下マウスの腹腔内の左側にある赤い、サーフボード形をした臓器です。
   2. 腹腔内に切開を加えます。優しく結合組織を離れていじめるために第2のペアを使用して、鉗子の1ペアで脾臓を引き出します。別のメッシュスクリーンで脾臓を置きます。

2。細胞調製

1. 3 mlのシリンジからプランジャーを使用して、挽く唯一の結合組織と脂肪が残るまでメッシュスクリーンに臓器。皿三回からHBSSでメッシュをすすぐ。各組織試料のための新しいプランジャーを使用しています。
   1. 組織を均質化するためのその他のオプションについては、このメソッドの代わりに使用することができます。
2. 血球計数器を用いて細胞をカウントする。
3. 4℃で5分間、335×gで℃で遠心分離により細胞をペレット化
4. 室温で10分間、ACK溶解緩衝液（0.15M NH _{4 Clを} 、10mMのKHC0 _3、0.1mMののNa ₂ EDTA、pH7.2）を500μlの脾細胞を再懸濁します。 FACS緩衝液中で20×10 ⁶細胞/ ml（PBS、1％FCS、0.02％アジ化ナトリウム）での胸腺細胞を再懸濁し、氷上に置いておきます。
5. HBSS 5mlを加えて等張性に脾細胞を返します。 FACS緩衝液中で20×10 ⁶細胞/ mlで再懸濁し、遠心分離によってペレットは脾。細胞は無菌を維持する必要がある場合は、滅菌したRPMI +10％FCSを使用することができます。

3。フローサイトメトリー用の細胞の染色

このプロトコルの目的は、野生型（WT）とHYの^CD4マウス^を用いた正と負の選択を分析するための戦略を概説することです。フローサイトメトリー実験のデザイン、収集、および分析に関する一般的な考慮事項については、我々は董らによる優れたレビューに読者を¹¹ 参照

1. アリコート4×10 96ウェルプレートの各ウェルに、フローサイトメトリー試料につき⁶胸腺細胞、ならびに補償制御当たり1×10 ⁶ WT脾。トランスジェニックマウスを用いた場合は、実験のコントロールとして、WTマウスを含める必要があります。
2. 氷上で10分間anti-CD16/32（クローン2.4G2）で細胞をインキュベートすることにより、Fc受容体をブロックします。
3. 5分間、4℃で335 xgで皿回しをする。蓋を外し、一度プレートをフリックして井戸から液体を払拭する、シンクに伏せ。 FACS緩衝液200μlの各ウェルを再懸濁します。洗浄を繰り返します。
4. 下記のようにウェル当たりのFACS緩衝液200μlに希釈に基づいて、各抗体の最適濃度を用いて、抗体カクテルを準備します。各抗体の最適濃度は、正と負の集団の最大の分離を与えるために必要な最低濃度として定義されています。所与の抗体には陰性集団が存在しない場合は、アイソタイプ抗体が含まれるべきである。必要に応じて、ウェルあたり総量（ウェルあたり100μlまでなど ）に縮小することができます。
   1. WT胸腺：抗TCRβ、抗CD4、抗CD8、抗CD69または抗CD5、抗CD24
   2. 胸腺HYの^CD4：抗HY TCR（T3.70）、抗CD4、抗CD8、抗CD69または抗CD5、抗CD24
      CD69 ^loと胸腺細胞におけるCD69 ^ハイテク集団のより良い分離を得るためには、続いて、ビオチン化抗CD69一次抗体を使用することが推奨される二次的な蛍光標識ストレプトアビジンを含む染色。私達はuCD5染色のためのSEが同じ戦略。
5. 暗闇の中で氷上で30分間、FACSバッファーで抗体カクテル200μlで細胞をインキュベートします。
6. 抗体カクテル染色と同時に、単一蛍光標識抗体を用いて、各補償制御を染色。理想的には、補償染色は、抗体カクテルで使用したものと同じ抗体を含んでいる。多くの抗原がアッセイされたときしかし、個々の抗原を染色すると、大きな実験用可能でないかもしれません。したがって、抗CD4または抗CD8のどちらかに染色が高いこれらの抗原の発現、または補償ビーズの使用に起因することをお勧めします。暗闇の中で氷上で30分間FACS緩衝液で染色。 1補償制御は、汚れのないままにしておきます。
7. FACS緩衝液で細胞を2回洗浄します。
8. FACS緩衝液およびFACSチューブへの転送中に細胞を再懸濁します。
9. フローサイトメーターでサンプルを取得。 FSC認証の取得とするFSC-Wを含むダブレット識別のためLLOW。

4。フローサイトメトリーデータの解析 - 非TCRトランスジェニックマウス

我々は、フローサイトメトリーデータ分析のためFlowJoを使用しています。非TCRトランスジェニックマウスのゲーティング戦略のために図2Aを参照してください。

1. SSCは、 "リンパ球"人口で電子的にゲートによって、FSC使用。
2. "リンパ球"集団の中では、FSC-W ^loの人口は、細胞のダブレットとaggregratesを除外するために電子的にゲートにFSC-Wで、FSC使用。これは、 "一"の門です。
3. "一重"ゲートは、CD4、CD8、プロット内のイベントを使用します。 DN、DP ^鈍い 、DP ^明るい 、CD4 ⁺ CD8 ^LO、CD4SPとCD8SP集団、図2Bに示されるようにするためのゲートを描画します。
4. CD4SPとCD8SPゲートの下では、CD24のプロットによってTCRβを作成します。 図2Cに示すように、ゲートを描画する象限·ゲーティング·ツールを使用します。
5. NEを作成"一重"ゲートからwプロット：CD69によってTCRβ。ゲートA、B、C、Dは、 図2Dに示すように描画します。
6. CD5によってTCRβ： "シングレット"ゲートから別のプロットを作成します。 図2Eに示すように、ゲートI、II、III、IVを描きますこれは正の選択を調べるためのもう一つの戦略です。
7. ゲートI、II、III、IV、A、B、C、D（ 図2D、E）に"一"の下からDN、DP ^鈍い 、DP ^明るい 、CD4 ^int型、CD4SPとCD8SPゲートを適用します。
8. あなたのターゲット人口に到達するまで、後続の各ゲートの周波数によって臓器の細胞数を乗じて特定のサブセット内のセルの数を計算します。たとえば、TCRβ ^ハイテク CD69-CD8SP胸腺細胞の数は、 胸腺細胞数×％、TCR BHIによって決定されるであろうCD69-（画分D）×％のCD8SP。
   1. 生細胞と死細胞は、いわゆる "lymphocが含まれていませんすでにカウントすることを考慮に入れあなたの計算でyte "ゲート。

5。フローサイトメトリーデータの解析 - TCRトランスジェニックマウス

TCRトランスジェニックマウスのゲーティング戦略のために図3Aを参照してください。

1. 前節と手順4.1と4.2に従ってください。
2. "一重"ゲートの下で、T3.70のSSCプロットとゲートでT3.70を作成⁺細胞集団を抗原特異的T細胞（ 図3B）を分析する。いくつかの状況では、それは非抗原特異的（T3.70-）T細胞集団に、この集団を比較するために興味があるかもしれません。
3. T3.70 ⁺集団内では、ドローのDN、DP CD4SPとCD8SPゲート（ 図3C）。
   1. WTコントロールサンプルは、 "一重"ゲートの下、これらのゲートを描くか、非常に少数のT3.70 ⁺細胞が存在するとしてT3.70ゲートを作成します。
4. CD8SPゲートの下に、作成CD24のプロットによってT3.70。 4つの集団（ 図3F）にセルを分割する象限·ゲーティング·ツールを使用します。
5. WTマウスとHYの^CD4マウス^の T3.70 ⁺ DPコンパートメント（ 図4A）のDPコンパートメント内のCD69発現を描いオーバーレイヒストグラムを作成します。 CD5発現（ 図4B）を調べることを繰り返します。
6. 4.8のように、目的の各サブセット内の細胞の絶対数を計算します。

Results

生理的TCRトランスジェニックモデルとWTマウスでは、正の選択は、抗原遭遇の後、DP ^鈍い段階に移る前に、DP ^明るい段階から始まります。 DP胸腺細胞^鈍いその後CD4SPまたはCD8SP胸腺細胞（ 図2B）になる前に、過渡的CD4 ⁺ CD8 ^loの段階^に入る。成熟したSPの胸腺細胞は、高いTCR発現およびCD24（ 図2C）の損失によって特徴付けられる。更新CD69またはCD5によってTCRβを調べ、正の選択の欠陥を明らかにすることができ、CD4によるCD8は、欠陥がどこにあるさらなる洞察を提供することができます。 CD69とCD5の両方がこれらのマーカーのより高い発現を駆動する強い相互作用で、TCR刺激後にアップレギュレートされる。

CD69プロットによってTCRβで、ゲート^（TCRβLO CD69-）を事前選択DP胸腺細胞の人口を表し、ゲート^B...

Discussion

ここで紹介するプロトコルは、非トランスジェニックTCRおよびTCRトランスジェニックマウスにおける正と負の選択を調べるために使用することができます。このプロトコルは、表面抗原の染色を説明します。分子メカニズムの更なる分析のために、それはしばしば細胞内染色を行う必要がある。我々は、ほとんどの細胞内タンパク質と転写因子のBDバイオサイエンスのFoxp3の染色キット用BD Biosciences社Cytofix / Cytopermキットを使用しています。私たちは通常、直ちに染色後に我々のサンプルを取得する。しかし、サンプルは4℃で1％ホルムアルデヒド℃の暗所でCとFACS緩衝液中で一晩保存することができます。いくつかの蛍光色素と抗体が固定と互換性がない可能性があることに注意してください。

正の選択の分析のために、私たちは、負の中間、高発現個体群の良好な分離（ 図2）を提供するために、ビオチン化抗CD69または抗CD5の使用をお勧めします。代表的な結果で述べたように、このゲーティング戦略は、2つの異なったフォローアップを必要とする可能性がありますので、系...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
試薬の名称	会社	カタログ番号	コメント（オプション）
Hyclone社ハンクス平衡塩溶液	サーモサイエンティフィック	SH30030.02
メタルメッシュスクリーン	Cedarlane	CX-0080-J-01
ペトリ皿（60×15ミリメートル）	フィッシャー·サイエンティフィック	877221
シリンジ（3ミリリットル）	BD Biosciences社	309657
コニカルチューブ（15ml）を	ザルスタット	62.554.205
顕微鏡	ツァイス - プリモスター	415500-00XX-000
血球計	Hausser科学的	3110
96ウェルプレート	ザルスタット	82.1582.001
マルチチャンネルピペット	Fisherbrand	21-377-829
ウシ胎仔血清	PAA	A15-701
リン酸緩衝生理食塩水	フィッシャー·サイエンティフィック	SH3025802
アジ化ナトリウム	ITベイカーケミカル株式会社	V015-05
FcRブロッキング試薬			クローン2.4G2
抗マウスHY TCR	eBioscience社	XX-9930-YY *	クローンT3.70
抗マウスCD4	eBioscience社	XX-0042-YY *	クローンRM4-5
ANTI-マウスCD8α	eBioscience社	XX-0081-YY *	クローン53から6.7
抗マウスCD24	eBioscience社	XX-0242-YY *	クローンM1/69
抗マウスTCRβ	eBioscience社	XX-5961-YY *	クローンH57-597
抗マウスCD69ビオチン化	eBioscience社	13から0691-YY *	クローンH1.2F3
抗マウスCD5ビオチン化	eBioscience社	13から0051-YY *	クローン53から7.3
ストレプトアビジン	eBioscience社	XX-4217-YY *
フローサイトメーター	BD Biosciences社 - FACS Cantoの	338962
FACSチューブ	BD Biosciences社	352052
フローサイトメトリー解析ソフトウェア	TreeStar - Flowjo	FlowJo V7 / 9
Hyclone社RPMI - 1640培地	サーモサイエンティフィック	SH30027.01
			* XXは、蛍光色素とYYバイアルサイズによって異なりによって異なります。