マウスモデルにおける腸のティッシュエンジニアリング

サマリー

この記事とそれに付随するビデオはオルガノイドユニットオン足場のアプローチを使用して、マウスにおける組織工学腸を生成するための我々のプロトコルを提示します。

要約

組織工学小腸（TESI）が正常に40日以内に術前の重みに戻り、その結果、大量の小腸切除後のルイスラットを救出するために使用されてきました。ヒトでは^1、巨大小腸切除は、短腸症候群になる可能性があり、機能的な吸収不良非経口栄養依存性、肝不全や肝硬変、multivisceral臓器移植の必要性を含む重要な罹患率、死亡率、医療費を付与する^。2本論文では状態、我々はマウスモデルにおける組織工学腸を作成するための我々のプロトコルを記述し、文書化多細胞オルガノイドユニットオン足場アプローチ。オルガノイドユニットは粘膜と間葉の両方の要素を含む腸由来の多細胞集合体^、3腸管幹細胞ニッチを維持している間に関係があります。進行中および今後の研究では^4日に私たちの技術の変遷マウスは、この種で利用可能なトランスジェニックのツールを利用することによってTESI形成の間に関与するプロセスの調査が可能になります。免疫不全マウス系統の⁵可用性はまた、私たちは人間の腸組織への技術を適用し、人間のTESIの形成を最適化することを許可しますヒトへの移行前にマウス異種移植。我々の手法は、すでに人間の患者での使用が承認された適正製造基準（GMP）の試薬および材料を採用していますので、脱細胞化された動物の組織に頼るのアプローチに比べて大きな利点を提供しています。このメソッドの究極の目標は、短腸症候群に対する再生医療の治療戦略としてのヒトへの翻訳である。

プロトコル

1。オルガノイドユニットの準備

1. マウスの解剖（はさみや鉗子）のための適切なインスツルは、オートクレーブにより滅菌しなければならない。
2. 人道的に地元の動物実験委員会のプロトコルに従ってドナーマウスを安楽死させる。動物が進む前に死んでいることを確認してください。
3. 腹膜腔へのアクセスを得るために正中切開を行います。露出を改善するために必要なスキンフラップは反映させることができます。
4. 小腸を骨抜きとトライツ靱帯のすぐ遠位で割ります。シャープで優しい鈍的切開を使用して、その腸間膜から小腸を分離します。回盲部を識別し、これに近位小腸5ミリメートルを分割します。
5. はさみを使用して、（インビトロジェン、アンチアンチ）10ミリリットル4℃、無菌ハンクス緩衝生理食塩水（HBSS、インビトロジェン、カールスバッド、カリフォルニア州）/ 1X抗生物質抗真菌薬でシャーレに腸間膜反対側縁に沿って長手方向にソリューションを腸を開きます。で開かれ、腸から糞便をクリア穏やかに撹拌し、次に4の10ミリリットル℃、滅菌HBSS / 1X抗抗15ミリリットル遠心チューブに開いた小腸を転送します。
6. 4の10ミリリットル℃、試験管内抗抗滅菌HBSS / 1Xで開か腸を3回洗浄します。各洗浄は30秒間、15ミリリットル管の軽度の揺れを用いて行うことができる。振とう後、腸組織はチューブの底に沈む。間葉系デブリである浮遊物質を、捨ててください。ピペットで慎重に洗浄溶液を除去します。
7. 4の10ミリリットル℃、はさみを使用して1mm未満正方形片に抗抗滅菌HBSS / 1Xとペトリ皿の中で洗浄した腸にミンチ。自動ピペットでミンチ材料を集め、試験管に入れます。
8. 8分間500rpmでチューブを遠心分離します。脂肪と間充織含む上清を捨てる。
9. 滅菌HBSS / 1X抗抗プラス0.125 mg / mlのディスパーゼ（Invitrogen）および800単位/ mの10mlでみじん切り、洗浄した物質を消化リットルコラゲナーゼタイプ1（ワージントン、レイクウッドニュージャージー州）。消化溶液40mlを準備するには、ディスパーゼ、コラゲナーゼの142 mgを5 mgを秤量し、40mlの体積に滅菌HBSSを加算します。新たに各時間オルガノイドユニットが用意されているこの溶液を調製し、使い4℃まで、準備完了状態に保つ。ステップ1.8からペレットに直接消化溶液を追加します。
10. 20分間37℃で消化液でみじん切り、洗浄材料を含有する試験管をインキュベートする。
11. 試験管を取り出し、さらに10mlのピペットを用いて磨砕することによって消化された組織を混乱させる。均一な外観が得られるまで、20から50回の間で繰り返します。
12. 800 rpmで5分間試験管を遠心分離します。単一細胞を含む上清を捨てる。
13. 4℃、滅菌したダルベッコ改変イーグル培地（DMEM、Invitrogen）にプラス10％（v / v）の熱不活化ウシ胎児血清（HI-FBS、Invitrogen）を10mlの消化反応を停止します。ペレを再懸濁しトンとチューブを横に振る。
14. 800 rpmで5分間試験管を遠心分離します。最後の数滴まで、自動ピペットで注意深く上清を取り除きます。ペレットを再懸濁し避けるために最後の数滴のための使い捨てのプラスチックピペットを使用しています。

2。ポリグリコール酸の足場のロード

1. 不織布、ポリグリコール酸（2mmの板厚、60mgのcm-3の嵩密度、気孔率> 95％、コンコルディア繊維、コベントリー、RI）からフォームが2 mm長、5 mmの外径が円筒形の足場文献に記載されているよう。 4。
2. 蒸留水に70％エタノールを用いて調製し、ハサミで転倒使い捨て千マイクロピペットの先端2mmをトリムします。
3. 4ウェル培養プレートに足場を置きます。第1のルーメンにしてから、外側の表面に、1000マイクロリットルピペットで足場上オルガノイドユニットをロード。内腔の被覆を確実にするためにピンセットを使用しています。妨害したり、ポリマーの円筒形状を開いて壊してはいけません。

3。ホストマウスへの移植

1. 可能な場合はドナーと同じ背景に同系宿主マウスを使用してください。それ以外の場合は、（ジャクソン研究所、サクラメントカリフォルニア州）、免疫不全非肥満糖尿病/重症複合免疫不全またはNOD / SCID動物を採用しています。
2. イソフルランで全身麻酔を誘導する。 、prepを剃るとマウスの腹部をドレープ。
3. 腹膜腔への入り口を得るために5ミリメートル正中切開を行います。識別し、慎重に大網を骨抜きにする。大網上にロードされたポリマーを置き、ティッシュで包んでください。大網が破れないようにしてください。
4. 5から0 monocryl縫合糸で大網にポリマーを固定します。そっとその解剖学的位置に包まれたポリマーと大網を交換してください。
5. 4から0ビクリル縫合糸を使用して、レイヤーで腹部切開を閉じます。筋肉の閉鎖を実行し、切開下腹部内臓を傷つけないように注意してください。肌のために中断された縫合糸を使用して、。
6. 切開に隣接皮下膨疹として滅菌水で2 mg / kgのケトプロフェン（Ketofen、フォートダッジ·アニマルヘルス）による術後鎮痛を管理します。動物を毎日評価されるべきであり、動物が痛みや苦痛の徴候を実証されている場合は、ケトプロフェンの追加投与は術後2日目に投与してもよい。術後3日目までに、動物は完全に痛みや苦痛の証拠なしで回復されるべきである。痛みや苦痛は、術後3日目に続く場合は、これは異常とみなされ、動物実験委員会及び動物飼育施設のプロトコールに従って対処すべきである。
7. 静養するには、マウスや組織工学腸が4週間にわたって成長させる。 Septra 200ミリグラム/ 1:100希釈で5ミリリットル当たり40ミリグラム（ハイテクPharmacal、アミティニューヨーク州）とげっ歯類（ラボダイエット5001、PMIニュートリション、セントルイス、ミズーリ州）と水に動物の不断のアクセス権を与えます。

4。収穫

1. フーマーnely 4週間注入した後、宿主動物を安楽死させる。
2. 元の切開をもう一度開いて、腹膜腔へのアクセスを容易にするために頭の方にスキンが反映されています。
3. 筋層を開き、組織の地球儀として組織工学構築物を識別します。
4. 鋭い解剖を用いて腹腔内内臓からコンストラクトに癒着を降ろす。
5. 取り付け後パラフィンホルマリンでコンストラクトを修正するか、そのようなリアルタイムPCRまたはタンパク質の単離などの生化学的アッセイのための新鮮な組織を使用しています。

結果

図1は、ここに記載されたプロトコルの全体的なスキーマを示しています。このプロトコルの最終的な結果は、地球やルーメン、粘膜、粘膜下組織と組織工学マウス小腸の球状の構造になっており、筋図2Aを囲むと、原料ポリマー足場と比較して、典型的な地球を、 図2（b）は、同じ構造を表示します急激にその内腔を明らかにするためにbivalved 図3は培養4週間後の典型的な成功したコンストラクトのヘマトキシリン/エオシン染色したパラフィンマウント断面を示しています。献。 4、我々は時間の首尾よく89％（44インプラントの39アウト）組織工学腸を作り出すことができました。

失敗したコンストラクトはない粘膜の形態の一つである。それは、地球が最後の組織学的分析で粘膜を持っているかどうかの収穫時の肉眼的形態に基づいて判断することは不可能である。したがって生化学的アッセイはperformeある場合新鮮なコンストラクト組織上のdは、それぞれ地球の半分が固定し、パラフィンは、粘膜...

ディスカッション

我々はオルガノイドユニットオン足場のアプローチを用いて、マウスにおける組織工学腸を製造するためのプロトコルを提示。最も重要なステップは、オルガノイドユニットの準備のものです。ケアを十分に清掃し、機械的に組織を処理するために注意しなければなりませんが、消化が行われた後、平等なケアを行う（ステップ1.11）オルガノイドユニットをover​​digestまたはovertriturateないように注意する必要があります。これが完了しているなら、オルガノイドユニットがステップ1.12の上清中に失われる可能性がある単一の細胞に減少し、組織工学腸を生成するために生き残る可能性は低いことができ、腸の幹細胞ニッチとして、この中に保存されないケース。

マウスのサイズが小さいことは、それが直接、生体内でその機能をテストするために宿主動物の腸に構築する組織工学吻合することに挑戦することができます。あるいは、ラットは 、in vivo で吻合容易TESIの成長のための大きいモデルを表しており、既にこのような理由¹のために実行されてい...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
試薬の名称	会社	カタログ番号	コメント（オプション）
HBSS	ギブコ	114170-112
抗生物質抗真菌100X	インビトロジェン	15240-062
ディスパーゼ	ギブコ	17105-041
コラゲナーゼタイプ1	ワージントン	LS004194
DMEM高グルコース1X	ギブコ	11995-065
熱不活性化FBS	インビトロジェン	16140-071
Biofelt 100パーセントのPGA	コンコルディアメディカル	FELT01-1005	献などのポリマーを調製するための。4
ポリ-L-乳酸	Durect	B6002-1	献などのポリマーを調製するための。 4
I型コラーゲン、ラットの尾を入力	シグマアルドリッチ	C3867-1VL	献などのポリマーを調製するための。 4
ケトプロフェン100 mg / mlの	フォートダッジ·アニマルヘルス	71-KETOI-100から50
LabDiet 5001げっ歯類	LabDiet	5001
Septra 200ミリグラム/ 5ミリリットル、USPあたり40ミリグラム	ハイテクPharmacal	50383-824-16
イソフルランは、USP	フェニックス医薬品	57319-507-06