の飼育とインジェクション<em&gt;たばこスズメガ</em細菌毒性を評価するための&gt;幼虫

サマリー

ここで説明する方法は、血体腔に昆虫病原細菌の直接注入を利用たばこスズメガ昆虫の幼虫。 M sexta市販されており、よく研究された昆虫です。したがって、この方法は、1つまたは両方のパートナーの視点からホスト細菌の相互作用を分析する簡単な方法を表しています。

要約

一般的にタバコイモムシとして知られているたばこスズメガは 、タバコやトマトなど、ナス科の植物を食べ、重要な農業害虫と見なされます。 Mの感受性昆虫病原性細菌種の多様^1-5、ならびに昆虫の免疫系^6から8に関して入手可能な情報の富、および保留中のゲノム配列^9〜sextaの幼虫は宿主-微生物相互作用を研究に使用するための優れたモデル生物作る発病時。さらに、M. sextaの幼虫は他の感受性の昆虫種に実験室での相対的に操作し、維持するために比較的大きいと簡単です。それらの大きなサイズも、感染に対する宿主応答の解析のための効率的な組織/体液抽出が容易になります。

ここで紹介する方法は、Mの血体腔内細菌の直接注入（血液空洞）を記述するsextaの幼虫。このアプローチ単に注射後に昆虫の死までの時間を監視することによって、様々な細菌種、株、または変異体の毒性の特性を分析し、比較するために使用できます。このメソッドは、通常、昆虫へのエントリを取得するための手段として、線虫ベクトルと関連付けるXenorhabdusとPhotorhabdus種の病原性を研究するために開発されました。昆虫病原性線虫は、通常、天然の消化器や呼吸器の開口部を介して幼虫に感染し、昆虫の体液（血液）、その後すぐに¹⁰にその共生細菌の内容物を放出する。ここで説明した注入法は、このように昆虫に細菌や線虫の影響を脱共役、線虫のベクトルの必要を回避します。この方法は、ニッキング¹¹と経口毒性アッセイ^12を含むentomopathogenesisを分析するための他の既存の方法を使用しては不可能である種菌内感染性物質の正確な列挙型（細胞やタンパク質）を可能にここで説明したように直接注入法の有用性は、昆虫死亡率を監視することにより、細菌の病原性を解析することである。しかし、この方法は簡単にMに感染の影響を研究に使用するために拡張することができますsexta免疫システム。昆虫は体液性および細胞性応答の両方を介して感染に応答します。体液性応答は細菌関連パターンの認識や各種抗菌ペプチドのその後の生産^7を含み、これらのペプチドをコードする遺伝子の発現をRNA抽出と定量PCR ^13を介して直接感染後に監視することができます。感染に対する細胞応答は根粒形成、カプセル化、および血球⁶による感染性病原体の食作用を伴う13,14により可視化することができます。

プロトコル

1。虫卵の殺菌と飼育

1. 900-1,000 mlのH _{2 O}で提供寒天の最初のオートクレーブ15グラムで食事を準備します直後によく研究室ブレンダーで166グラムの小麦胚芽食とブレンドしたオートクレーブ、ミックス。 4でアルミ箔にダイエットを転送し、冷却するための皿（または皿）に注ぎ、しっかりとラップし、℃で保存
2. 到着時には、Mを殺菌する時々かき混ぜながら90ミリメートルろ紙ガラスフィルターホルダー及び真空フラスコ装置では、2〜3分間0.6％漂白剤溶液の250mlでsextaの卵。
3. 洗浄あたり250ミリリットル滅菌蒸留H ₂ Oで3-4回漂白剤溶液を排出し、卵を洗うために真空をオンにします。
4. ペトリ皿のふたに入れ新鮮な90ミリメートルろ紙に卵を移し、それらを一緒に彼らはもはや棒になるまで乾燥させます（約20〜30分）。
5. 各コンテナに約40個の卵を置いて、昆虫食とプラスチック容器の底に卵を移す（ 図1A）。卵は湿気によって真菌汚染を防ぐために食事から分離されています。 8時間暗の光周期：16時間明、26で卵℃を維持する。卵が孵化する前に、黄白色に明るくなります。
6. 孵化が完了したら、慎重に底のダイエット（ 図1B）を使用して新しい容器にそれぞれ約25幼虫を移す。その壊れやすい初期の発達....

結果

昆虫死亡率アッセイの代表例を図3に示します。この実験では、昆虫は野生型（ATCC19061）または中間対数期（株当たりn = 6虫）まで成長Xenorhabdus nematophilaの弱毒変異株（LRP ^13）のいずれかの約50コロニー形成単位（CFU）を注射した。昆虫は約72時間観察し、各時点でまだ生きて注入された昆虫のパーセントを記録した。このケースでは、弱毒株は、昆虫殺害でクリア遅延を示し、野生型株は前に変異感染幼虫の死に、30時間後に注射内のすべての6幼虫を殺した。

図1注射の準備のために昆虫飼育。 a）約40表面殺菌した卵は、5オンスのカップの底に配置されている不妊虫食はゴム栓の上で休憩。 B）は二十孵化したばかりの昆虫は、下部の不妊虫食と5.......

ディスカッション

Mの直接注入ここで説明するように昆虫病原細菌とsextaの幼虫は、細菌の病原性を解析するためのシンプルで効果的な手段として機能します。この方法はまた、別の実験対象および/または条件に合わせて高度に適応可能である。細菌は、注射前に、種々の方法で調製する​​ことができる。 Xの場合にはnematophila、中間対数期に栄養豊富なルリア-ベルターニ（LB）培地で増殖させた野生型細胞は注入後に30時間以内にほとんどまたはすべての虫を殺して、通常は最も病原性があります。静止期の細胞はしばしば幼虫を殺すために5月10日より長い時間がかかる。成長期は、病原性に影響を与えていますが、注入された細胞の総数は20から20,000 CFUに至る典型的な接種で^、16あまり重要でないように思われる。実際には、XenorhabdusとPhotorhabdus種の場合には、5 CFU限り少ないが昆虫宿主^17を殺すのに十分である。病原propeを評価するために、エタノール消毒（ 例えばバチルス種）.......

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
試薬	会社	カタログ番号	注釈
90ミリメートルろ紙	ワットマン	1001 090
ガラスフィルターホルダー	ミリポア	XX1004700
たばこスズメガ卵	カロライナ生物サプライ	143880
マイマイガダイエット+寒天	MPバイオメディカル	0296029301
5.5オンスプラスチック容器と蓋	ソロカップカンパニー	URC55-0090 PL4-0090
1オンスプラスチック容器と蓋	DARTコンテナ株式会社	100PC 100PCL25
1X PBS			137mMのNaCl、2.7mMのKCl、8mMののNa 2 HPO 4、1.46 mMのKH 2 PO 4、pH7.4の
注射器	ハミルトン	80208	30ゲージ、0.375 "長さ、ポイントスタイル2