Method Article

蛍光顕微鏡法による、複数世代にわたってライブ哺乳類細胞におけるプラスミドの複製を監視

DOI:

10.3791/4305

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December 13th, 2012

 ,  , 
1Department of Oncology, University of Wisconsin - Madison

In This Article

Summary

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生きた細胞内の個々のDNA分子を観察する方法が記載されている。技術は目的のDNAに組み換え結合部位に蛍光標識lacリプレッサータンパク質の結合に基づいています。この方法は、時間をかけて生きている細胞内の多くの組換えDNAをたどるように適応させることができる。

Abstract

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いくつかの天然に存在するプラスミドを、哺乳動物細胞内に保持されます。これらのうち、複数のヒト悪性腫瘍1-3引き起こすエプスタイン-バーウイルス（EBV）およびカポジ肉腫関連ヘルペスウイルス（KSHV）を含むガンマヘルペスウイルスのゲノムは、されています。これら二つのゲノムは単一のウイルス蛋白質と細胞複製機構を使用して、それぞれの、ライセンスされた方法で複製され、その欠けている伝統的なセントロメア4月8日にもかかわらず、細胞分裂の際に娘細胞に渡されます。

多くの仕事は、サザンブロッティングやin situハイブリダイゼーション（FISH） 蛍光 inなどのメソッドを使用して、これらのプラスミドゲノムの複製を特徴付けるために行われている。これらの方法は、しかし、制限されています。定量PCRおよびサザンブロットは、細胞集団における細胞あたりのプラスミド数の平均値に関する情報を提供します。 FISHは平均数とプラスミドの分布の両方を明らかに単一セルアッセイであるの細胞あたりの細胞集団でなく調べセルの親や子孫の情報を全く許さない、静的なものである。

ここでは、生きた細胞内のプラスミドを可視化するための方法を説明します。このメソッドは、関心9のプラスミド内に複数のサイトへの蛍光標識ラクトースリプレッサータンパク質の結合に基づいています。目的とするDNAをラクトースオペレーター（LACO）配列の約250タンデムリピートを含むように設計されています。 LACOは、具体的に蛍光タンパク質に融合させることができるラクトースリプレッサータンパク質（LACI）によってバインドされています。融合タンパク質は、いずれかの人工プラスミドまたはレトロウイルスベクターにより導入されたから発現させることができる。このように、DNA分子は、蛍光標識、したがって、蛍光顕微鏡を介して、目に見えるようになるされています。プラスミドが閲覧できるようになるまで融合タンパク質は、IPTGの存在下で培養することによりプラスミドDNAを結合からブロックされています。 ontentは ">このシステムは簡単にトランスフェクションし、理想的な細胞が接着されています。それらの合成の特性を明らかにし、娘細胞に分割、プラスミドは数世代を通して生きた細胞で監視することができ、大規模な核を持っているこの技術はあることを決定するために使用されていますEBV由来プラスミドの84％は、HeLa細胞に娘細胞に忠実に、各世代を合成し、新たに合成されたプラスミドパーティションの88％されており、これらのEBVプラスミドのペアがでそれらの合成の後につながまたは姉妹染色分体に関連付けられていることが観察されたS-彼らは後期10で分離された姉妹染色分として分離するのを見たまで。メソッドは現在、HeLa細胞とSLK細胞におけるKSHVゲノムの複製を研究するために使用されています。HeLa細胞は、ヒト上皮細胞を不死化され、SLK細胞が内皮ヒト不死化している段階細胞。SLK細胞はもともとKSHVの病変に由来したものの、ヒーラもSLKのセルライン自然にハーブもORS KSHVゲノム11。ウイルス複製の勉強に加えて、この可視化技術は、合成、ローカリゼーション、および他の組換えプラスミドDNAのパーティション化に様々なDNA配列の要素の追加、削除、または変異の影響を調査するために使用することができます。

Protocol

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1。可視プラスミドを有する細胞のエンジニアリング

  1. 視覚化するプラスミドにラクトースオペレーター配列（LACO）の約250部を含むDNA断片を導入するために標準の制限酵素消化または相同組換え技術を使用しています。私たちのプラスミドは約170 kbpのバクミドだっおよびハイグロ12にカポジ肉腫関連ヘルペスウイルスの全ゲノム（KSHV）とエンコードされた抵抗を含んでいた。
  2. リポフェクタミン2000を用いたトランスフェクションにより、哺乳動物細胞へLACO含有プラスミドDNAを導入。我々は、25μlのリポフェクタミン2000、0.5ミリリットルのOptiMEM、および3.5ミリリットルDMEMで精製プラスミドDNA10μgを4時間の場合は60 mmディッシュでHeLaおよびSLK細胞をトランスフェクションした。
  3. 10％ウシ胎児血清および48時間インキュベート細胞と5ミリリットルDMEMに培地を変更します。
  4. プレート導入ナンプラーための抗生物質の選択を含む培地中で大きな皿や培養細胞における低密度での細胞SMID、我々は3週間300μg/ mlのハイグロマイシンを10％ウシ胎児血清を含むDMEM中で細胞を選択した。
  5. 新しい培養皿にハイグロマイシン耐性コロニーを転送するために、滅菌したトリプシンに浸したろ紙の小片を使用しています。
  6. トランスフェクトされたクローンは皿を埋めるために成長しているときは、プラスミドLA....

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Results

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代表的な実験で取得したZ-スタックの最大強度の予測を図3に示します。典型的なプラスミド信号は、単一またはプラスミドのクラスタを表しているかどうかに応じてzスタックの3-8スライスに存在しています。細胞が分裂期に達するまでのEBVおよびKSHV由来プラスミドの場合、信号が細胞内でゆっくりと移動します。細胞自体は、実験のコースを上に移行されます。彼らはまた、球状になり、有糸分裂の間に皿から切り離す。健康HeLaおよびSLK細胞の細胞周期は約24時間かかります。細胞周期を完了するには30以上の時間がかかるこれらの種類の細胞が正常でないと判断されるべきである。娘細胞は、通常、互いに近くに添付し、次の細胞周期で同時に分割するために行く。細胞周期を完了することを示すことができる唯一の​​細胞を分析する必要があります。

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図1のプラスミドが見えるようにするためのスキーム。 （A）.......

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Discussion

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ここで説明する方法は、複数の世代にまたがる時間をかけて生きた哺乳動物細胞におけるプラスミドをフォローするために使用できます。励起光への曝露を制限することによって、我々は、少なくとも72時間、3細胞分裂を表す16から32細胞のコロニーを通って新しく分割ペアからセルをフォローするために、これらの技術を使用している。これらの実験は、このような定量的PCR、サザンブロッティング、魚のような静的なアッセイから得られない情報を提供します。

このようなタンデムLACO繰り返されるような反復配列を有するプラスミドを使用するときに転位が発生する可能性があるとして、それは、均質な構造を持つプラスミドの細胞のクローンをスクリーニングすることが不可欠である。また、最適な信号強度のために感染した細胞のレトロウイルス感染と画面クローンを最適化することが有用である。あまりにも多くのLacIタンパク質を発現する細胞は、核内に高いバックグラウンド蛍光を持つことになり、あまりにも少し発現するものでは弱い信号を持つことになります。最後に、私はsは、重要な細胞の形態を見て、その可視化時に使用するビューのフィールドをマーキ.......

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Disclosures

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特別な利害関係は宣言されません。

Acknowledgements

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この作品は、NIHとACS、T32CA009135含む、CA133027、CA070723、およびCA022443からの補助金によって賄われていた。ビルサグデンは、アメリカ癌協会の研究教授である。

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
試薬の名称 会社 カタログ番号 注釈
DMEM GIBCO 11965
OptiMEM中 GIBCO 31985
ウシ胎仔血清 Hyclone社 SH30910.03
ペニシリンシグマ P3032
硫酸ストレプトマイシンシグマ S9137
ハイグロマイシンカルビオケム 400050 SLKのための400μg/ mlの、HeLa細胞では300μg/ mlの
イソプロピル-BD-ガラクトシド（IPTG） ロッシュ 10 724 815 001 最終濃度が200μg/ mlの
リポフェクタミン2000 インビトロジェン 11668-027
HEPES GIBCO 15630
ガラスボトムディッシュマテック P35G-1.5-10-C
CultFoil Pecon 000000-1116-08
AXIOVERT 200M ツァイス
コリブリツァイス 423052-9500-000
中性の白色LED ツァイス 423052-9120-000
フィルターキューブ75 HE ツァイス 489075-0000-000
プラン·アポクロマート63x/1.4客観ツァイス 440762-9904-000
CascadeII：1024 EMCCDカメラ Photometrics B10C892007
Tempcontrolミニツァイス/ Pecon 000000-1116-070
Tempcontrol 37から2デジタルツァイス/ Pecon 000000-1052-320
CTIコントローラー3700デジタルツァイス/ Pecon 411856-9903
客観ヒーターツァイス/ Pecon 440760-0000-000
ステージ加熱インサートP ツァイス/ Pecon 411861-9901-000
ステージトップインキュベーターS ツァイス/ Pecon 411860-9902-000
加湿システムツァイス/ Pecon 000000-1116-065

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cesarman, E., Chang, Y., Moore, P. S., Said, J. W., Knowles, D. M. Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus-like DNA sequences in AIDS-related body-cavity-based lymphomas. N. Engl. J. Med. 332, 1186-1191 (1995).
  2. Chang, Y., et al.

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Plasmid ReplicationFluorescence MicroscopyLive Cell ImagingLactose OperatorFluorescent Protein FusionViral Genome PartitioningCell Division TrackingFluorescent TaggingTime Lapse ImagingHeLa Cells

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