の血小板媒介クランピングのためのシンプルなプロトコル熱帯熱マラリア原虫感染した赤血球

Summary

この方法は、血小板の媒介凝集表現型を調査熱帯熱マラリア原虫感染赤血球（PRBC）。これは、多血小板血漿とPRBCの懸濁液を分離し、共培養することにより行われる。

Abstract

熱帯熱マラリア原虫は、重度のマラリア感染の大半を引き起こす。脳マラリア（CM）の根底にある病態生理学的メカニズムは十分に理解されていない、いくつかの仮説がP.の微小血管の機械的閉塞を含めて、提唱されています熱帯熱マラリア 、寄生赤血球（PRBC）。実際には、そのライフサイクルの体内赤血球段階の間、P.熱帯熱マラリア原虫は赤血球膜上に接着性を変化させて表面抗原をエクスポートすることにより、感染した赤血球の表面を改質するためのユニークな能力を持っています。これは後の毛細血管細静脈¹の微小血管の内側を覆う内皮細胞への接着によって、複数の組織や臓器にPRBCの隔離が可能になります。そうすることによって、寄生虫の成熟形態が変形感染赤血球の脾臓クリアランスを避ける^2、より有利な低酸素圧力³に自分の環境を制限する。このSEQUESTの結果として配給は、それが末梢血中に検出することができる唯一の​​未熟無性生殖母細胞寄生虫である。

微小血管のベッド上に発現する多数のホスト受容体への成熟したPRBCの細胞接着と隔離は厳しいと合併症のない疾患で発生します。しかし、いくつかの証拠は、特定の表現型接着剤は、マラリアの深刻な病理学的転帰に関連付けられている可能性が高いことを示唆している。このような特定のホスト寄生虫の相互作用の一例は、特定の接着剤特性を有するPRBCの結合をサポートするために、細胞間接着分子-1の能力は^4,5脳マラリアの開発にリンクされているインビトロで実証されている。胎盤はまた、コンドロイチン硫酸とその行メイン受容体⁶として胎盤絨毛スペースを合胞体に発現し、マラリアに感染した妊婦の優遇PRBC蓄積のサイトとして認識されています。 PRBCトンのロゼット補体レセプター^{1（CD35）7,8}を経由して感染していないO赤血球も重篤な疾患⁹に関連付けられている。

最も最近記載P.の一つ熱帯熱マラリア原虫の細胞接着の表現型は、in vitroで血小板媒介塊を形成するPRBCの能力である。このようなPRBC塊の形成がCD36、血小板の表面に発現糖タンパク質を必要とします。内皮細胞および血小板を含む多様な細胞型上に発現別のヒト受容体、gC1qR/HABP1/p32も、塊^10を形成するために、血小板にPRBC接着を促進することが示されている。凝集は、 生体内で発生したかどうかは不明なままであるが、それは、CM ¹¹で死亡マラウイの子どもたちの脳の微小血管に記載されて血小板の著しい蓄積を占める可能性があります。また、in vitroで凝集に対する臨床分離株の培養物の能力は直接マラウイの¹²の病気の重症度にリンクされていた13、（ではないがマリ^14）。

不十分特徴PRBC凝集表現型のいくつかの側面では、このテーマに関する現在の研究では、標準化された手順に従っていない。これは、アッセイ¹⁵に固有の既知の高い変動の重要な課題である。ここでは、P.のin vitro血小板媒介凝集のための方法を提示それは他のグループのために一貫した方法のためのプラットフォームを提供し、今後の研究では、この表現型を調査に限界の意識を高めることを期待した熱帯熱マラリア 。マラウイに基づいている、我々は新たに収集された臨床分離株は、凍結保存を必要とすることなく、表現型のために検査することができるという利点が、特に限定されたリソースの設定のために設計されたプロトコルを提供します。

Protocol

1。試料捕集

血小板は簡単に温度、撹拌またはストレージを介して活性化することができ、したがって、彼らは慎重に扱われるべきである。血小板の準備のための血液を収集するバキュテイナーの使用がほとんどの臨床状況では避けられないですが、吸引力が潜在的に血小板活性化の原因となりますので慎重に検討する必要があります。我々の研究の病院で使用された臨床プロトコルのために、私たちのサンプルは慎重にクエン酸ナトリウムバキュテイナーに収集されます。私たちは、このまたは我々の以前の研究¹²で時期尚早の血小板活性化の問題を経験していない。我々は、非特異的な血液型抗原の凝集を最小限に抑えるために血液型O +個体からの血小板製剤、血液を採取。ドナーはまた、いくつかの薬は、血小板機能に影響を及ぼすことが知られている前の日から10日間の投薬を受けていない。

多血小板血漿の1.1準備（PRP）

1. 約5ミリリットルを収集マラリアナイーブホストまたはクエン酸ナトリウムバキュテナー（BD製品番号36276）でCMや重症マラリア（SM）の患者からの血液の2.5ミリリットルからの全血。
2. 室温で10分間250×gで全血を遠心分離する。 4℃遠心しないでください°Cの低温で凝集する血小板を引き起こす可能性がある。
3. 慎重に新しい15 mlチューブに曇り清を移す。血小板は簡単に温度変化や物理的衝撃によって活性化されるので、注意して扱われるべきである。揺れやチューブのいずれかぎくしゃく動きをすることは避けてください。
4. 健康なドナーと1Xリン酸緩衝液（; PBS pHは7.2〜7.4）を使用して、CMとSMの患者からの<150×10 ³血小板/μlのために> 300×10 ³血小板/μlに血小板サスペンションをカウントし、調整するノイバウアーのhaematocytometerを使用してください。血小板数を緩和し、その精度を確保するため、高希釈倍率を選択するようにしてください。

注：マラリアバッチリientsは健常^16,17,18に比べて減少した血小板数を持っている。したがって、CMおよびUM用血小板濃度は各マラリア診断グループ内の患者のための平均血小板数に応じて調整されています。 P.熱帯熱凝集表現型は、CM分離株では一般的であると血小板濃度はすべてのCMのケースのために標準化されて以来、塊の大きさや周波数に影響を与えない強力な結合親和性ゆえ減少血小板濃度が表示されます。

貧血小板血漿の調製1.2（PPP）

1. PPPを入手するには、10分間1500 xgで上記で得られたPRPの一部を遠心。血小板の大部分はチューブの底にペレット化する。
2. PRPとPPPの両方が、最大2週間のために4℃で保存することができます。理想的には、凝集アッセイのために新鮮な血小板を使用しています。 8-10日後最も血小板のは非アクティブ、おそらく集約である可能性が高い。

2。パラスITE文化

1. 5分間370×gで遠心分離することにより5〜10ミリリットルRPMI 1640でペレット化PRBC 3回洗浄する。
   注：このプロトコルですべての文化は、約1ミリリットルパック細胞容積（PCV）から開始し、5％のヘマトクリット値で維持。培養物は、所望のヘマトクリット値に到達するPRBCのいずれPCVから始まり、非感染RBC及びメディアに応じて調整することができる。
2. の25mM HEPES、5％Albumax IIまたは血清、10％と5％のヘマトクリット値を達成するために、40μgの/ mlのゲンタマイシンを添加したRPMI 1640の標準的なマラリアの培養培地で培養フラスコとサプリメントでPRBCを置きます。
3. シーリングとインキュベートする前に、92.5％の窒素、酸素2.5％、5％二酸化炭素の混合物で培養フラスコに浸透。あるいは、トレガ-ジェンセンの気密キャンドルジャー方法を用いることができる。
4. PRBCは、患者から直接得られるために、成熟した寄生虫を取得するには、5％CO ₂で37℃のインキュベーター内で24-36時間、彼らの培養フラスコをインキュベート。
   注：MOST研究室と文化適応ラインは、標準的な条件下で培養中に維持するために非常に簡単です。成長率を維持するために、異なる寄生虫段を同期させることができ、後述する単純な技術がある。
5. 以下のように薄い血液塗抹標本を準備し、光学顕微鏡下で寄生虫の成熟を調べます。

3。薄い血フィルムスライドの準備

1. 平らな面に載ってすりガラスのスライドの一端に血液の約10〜15μLを置きます。
2. 血液が均等に第二スライドの端に分散されるまで、第二スライドの端との血の一滴をタッチします。
3. 45°の角度で二スライドを保持しながら、迅速かつ慎重に、最初のスライドにあまりにも多くの圧力を与えることなく、均等に分散されて、血液の薄膜を作成する最初のスライド全体に血をスライドさせます。乾燥した空気。
4. 10秒間メタノールでスライドを浸します。乾燥した空気。
5. 2％ギムザセントでスライドを浸し少なくとも10分間AIN。水がきれいに実行されるまで、広範囲にすすいでください。乾燥した空気。
6. 光学顕微鏡で90-100xの油エマルジョンレンズを使用してスライドを調べる

4。無性段階の精製と同期

成熟したPの浄化熱帯熱 PRBCは凝集アッセイに必要なステップです。確かに、唯一の成熟寄生虫は、それが関連するリガンドを発現し、感染赤血球の表面から突出していることを、このライフサイクル段階にあるように血小板受容体に結合することができる。 Pの無性段階を浄化し、同期させる方法はいくつかあります熱帯熱マラリア原虫 ：後期無性段階はパーコール勾配¹⁹により濃縮することができる^、20をソートまたはゼラチン沈降²¹プロトコルを用いた磁気セルは、ここで説明する。ソルビトール同期は（無nのリングは、成熟段階を得るために24-26時間培養した後、リング·ステージ²²のために選択されます）ゼラチン浮揚を実行するEED。

4.1原形質ゲルの浮選

原形質ゲル浮選は低体重が密リングフォームやロゼットが底に沈むしながら溶液中に残存する赤血球をこぶのあるを選択するために、ゼラチンのようなソリューションを使用しています。この技術は成熟期に感染した赤血球の純度90％まで提供し、フィールド実験に分離株の両方に使用することができる。しかし、前述のように、原形質ゲル浮選はロゼットPRBCだけでなく、高ロゼット周波数にこれらのサンプル中の還元凝集周波数につながる可能性が未熟な段階を削除します。凝集は、血小板によってpRBCsバインディング媒介している間ロゼットがPRBCと非感染赤血球の相互作用であるので、原形質ゲル浮選後ロゼットPRBCの不在は、凝集アッセイに影響を与えないだろう。これら二つの形質に関わるリガンドは異なります。主にロゼットを仲介する非感染赤血球のレセプターCR-1を補完すると。

1. ℃の水浴中で37〜Prewarm Gelofusine液及び血清/ Albumax IIを含まない培地。
2. 5分間370×gで室温で遠心分離することによりクリーンな滅菌を15mlチューブ、ペレット細胞に文化を転送します。
3. 慎重に等しいGelofusineの量とタンパク質を含まない培地中でペレットを再懸濁した細胞を邪魔しないように上清を吸引除去する。
4. 滅菌を15mlチューブに混合物を移し、明確な境界は、上部と下部のレベルの間で見ることができるようになるまで37℃のインキュベーター内で15〜20分間、または放置する。
5. 慎重に新鮮な滅菌を15mlチューブに上位層を転送し、新鮮なRPMI 10mlのを追加します。
6. 5分間370×gで遠心し、注意深く上清を捨てる。
7. 薄い血液塗抹標本で寄生虫と発達段階を評価し、4章で説明したように光学顕微鏡下で調べる。

注：感染赤血球dependi 60〜90％の間で成熟しPRBC範囲文化の初期の寄生虫にNG。成熟した寄生虫の割合が高いために、≥10％の初期寄生虫と文化を使用しています。

5。アッセイを凝集

1. ×10 ⁸ PRBC /μlの1に原形質ゲル浮揚後に得られたPRBCサスペンションをカウントし、調整するノイバウアーのhaematocytometerを使用してください。
2. 新しい1.5 mlチューブ、5％ヘマトクリットで再懸PRBC、アクリジンオレンジ20μgの/ mlの最終濃度とPRPでの総容量の10％である。
   代わりに、アクリジンオレンジ、寄生虫培養物は、使用前に5分間、25μgの/ mlのエチジウムブロマイドで染色することができる。
   200μlの反応混合物の場合例えば、10μlの成熟したPRBC、健康なドナーまたは150×10 ³血小板/ SM患者および無タンパク質培地170μLからμLからPRP用/μlの300×10 ³血小板20μlのを追加します。
   注：血小板の比率：PRBC最終反応では、午後8時01分です。格言ができているので、これは重要です。ウム試料の凝集周波数が決定される。少ない血小板がコントロールで追加された場合、すべての凝集pRBCsは塊にチャンスがあるかもしれません。
3. 凝集pRBCsで血小板の役割を確認するために非感染赤血球とPRPとPPPとPRBC、同様に次のコントロールを用意しております。
4. 1.5〜2.0ミリリットルコニカルスクリューキャップバイアルにサスペンションを移す。
5. 室温で10-12 rpmで圧延して穏やかに撹拌下にバイアルを置きます。
6. スライドガラス、ガラススリップ、蛍光下調べるとカバーのPRBC±血小板ミックス10μlのピペッティングすることにより調製ウェットスライドによって塊の形成を確認してください。
7. サンプリングは、120分の合計15〜20分間隔で行うことができます。塊は、3つ以上の感染赤血球の集合体として考えられている。

Results

約70％のPの成熟段階を使用して血小板媒介塊アッセイの例原形質ゲル浮選による濃縮後の熱帯熱マラリア原虫は、 図2に示されている。塊は、3つ以上の感染赤血球の集合体である。アクリジンオレンジまたはエチジウムブロマイドで染色して蛍光顕微鏡で可視化することができる。エチジウムブロマイドは赤493 nmで励起極大およびローダミン色素と同様620 nmに発光極大を（持っていながら、アクリジンオレンジは、502 nmで励起極大と525 nmの（緑）の発光最大、フルオレセインとスペクトル類似しています）。それらは細胞凝集体として緑色または赤色の斑点としての蛍光の下に表示され、通常光の下でのように、アクリジンオレンジ又は臭化エチジウム染料で染色すると、図2に示すように、塊を容易に、それぞれ、顕微鏡下でスポットし（30分時点アクリジンオレンジを使用して）。塊より大きい、より大きなセル集合体は、国連が表示されますファンデ通常の光と緑色または赤色の下のスポットが大きく、それぞれの染料のために蛍光を発する。染料の標的DNA、したがって染色核、血小板および非感染赤血球は核の欠如により蛍光顕微鏡で検出されませんので。

4.7の小さなPRBC塊のランダム形成±1.6 pRBCs /塊は30分後に発生。塊のサイズが大幅に多数PRBC /視覚的にカウントすることができませんでした塊を含むいくつかの塊で120分間インキュベートした後、> 15 PRBC /塊の平均に増加します。凝集表現型の周波数は、塊/複製アッセイにおいてカウント1,000感染細胞中に存在する感染した細胞の数として計算される。

図1。実験を凝集するための流れ作業。血小板RICHと血小板血漿（）とP.熱帯熱マラリア原虫に感染した赤血球培養物（B）を調製し、次いで凝集アッセイ（C）と組み合わされる。

図2。 P.によって感染赤血球の凝集熱帯熱マラリアの研究室では、分離します。時間0でHB3によって形成された塊、30および120多血小板血漿（）及び乏血小板血漿（B）の貧しい塊形成の分。

検定の制限

特に血小板機能や影響の結果に影響を与え、これらのほとんどはすでにアルマンとロウ¹⁵によって強調された制限があります。ここでのdiffereで遭遇するかもしれない潜在的な問題のいくつかを言及アッセイのNT段階：

1. in vitro培養におけるへの臨床分離株を適応することは、時にはより長い培養期間は塊の形成を可能にするために十分高い寄生虫を達成するために必要とされるように挑戦することができる。 P.の高い抗原変異率が熱帯熱マラリア 、文化適応寄生虫の接着表現型は、文化の中で長引く回後に元の感染寄生虫人口を反映しない可能性があります。
2. 血液型抗原に起因する非特異的凝集を避けるために、血小板ドナーは、同じアッセイに用いた臨床分離株と血液型抗原、またはユニバーサルドナーの血液抗原基O-用いるために一致すべきである。しかし、血液型を持つ人は、そのようなマラウイなどアフリカの現場で珍しいO-であり、したがって、一般的に使用される血小板は血液型O +ドナーから得られ、血液型にマッチしなければならない。
3. ぬれたスライド準備に塊をカウントするCなどの画像キャプチャのために面倒かつ困難であるエルボは一定の動きである。通常、PRBCはカバースリップの端に蓄積したり、あるいは彼らは簡単に本物の塊と混同することができます "false"に塊を形成一緒に固執する傾向がある。細胞運動を低減するために、分析前に室温で15分間沈降に細胞を可能にする。
4. 凝集アッセイは時間に敏感であるため、唯一のサンプルが最適な精度のために一度に人あたり、分析することができます。二つの異なるサンプルの時間サンプリング点は、容易に同時に複数のサンプルを処理する場合、サンプル間のミスマッチのサンプリング時点で得られた、重なり合うことができる。このような状況では、洗練された定量的なソフトウェアは、クランプのサイズを計算することができるか、あるいは細胞特異的抗体は、凝集塊の組成を分析するために使用することができる。これらの技術は非常にデータの重要度を向上させることができながら、このアッセイが使用される可能性のある資源が乏しい設定で、このような技術および装置は、容易に入手できない。

Discussion

我々は、直接フィールドに臨床分離株でPRBCを研究するために使用さ血小板媒介凝集アッセイを記載している。血小板媒介凝集、P.に特徴的な挙動熱帯熱マラリアの臨床分離株は、CD36結合分離^12,23-24で頻繁に、明確な接着表現型として同定されている。我々は3つの主要なポイントを識別するために、このアッセイを使用している：1）in vitroで強いPの表現型を凝集熱帯熱マラリアは、疾患の重症度と診断2）CD36、3と共に血小板の凝集小説受容体P-セレクチンmediaties）CMの患者に存在する血小板減少症の程度と関連しているマラウイの子どもたちから分離することで PRBC塊のさらなる形成を制限するのに十分である試験管 ^12。塊形成における血小板の関与はセクション6で説明したように湿式スライド製剤を調べることによって実証される。血小板を高速で遠心分離によりPRPから単離することができる血液型抗原反応を最小限にするために、しかし、我々は、過度の取り扱いから、高速遠心分離から時期尚早血小板活性化を最小限にするために、全体のPRPを使用した。血小板活性が弱い血小板アゴニスト、エピネフリンまたは²⁶に記載のアデノシン二リン酸^{（ADP）25を}用いて血小板凝集試験により測定することができる。

以前に不十分特徴付けられているアッセイのいくつかの態様は、アッセイの結果にPRPソースおよび血液グループ抗原の効果を選ぶことの重要性であるそのうちの一つがある。我々はグループOの血液だった個体からPRPを用意+と一部の医薬品が血小板の挙動に影響を与えることができるように血が描画される前の最後の7-10日に任意の薬を取っていなかった。

凝集の成功に影響を及ぼす可能性のある他の要因がPRBCヘマトクリット、寄生虫レベルと凝集アッセイの長さが含まれています。高いヘマトクリット値及び血小板の共同使用UNT、クラスタが本当に塊またはそれらが密集しているので、あまりにも多くの細胞は単に^15を一緒に座っているかどうかであるかどうかを見分けるのは難しいだろう。凝集はまた、一般的により長いインキュベーション時間とともに増加する。これらは、凝集の研究を設計する際に考慮されるべきであるすべての有用なガイドラインです。

我々は、異なる臨床グループからのサンプルは、それがそうすることが可能であれば並列同じドナーからPRPを使用して分析することができるが、このようなフィールドサイトなどの限られたリソースの設定に輸血プールが一般に限られていることがわかる。これは、アッセイを標準化するために単一のO +供与体を有することが困難である。したがって、我々は可能な限り血液適合性を確保するために、いくつかのO +ドナーを同定した。献血の負担は1つだけ、個々の上に落下しないように、複数のドナーを使用すると、大規模なサンプルサイズの場合に便利です。

単一のpeの場合15〜20分でサンプリング点がはるかに実現可能であるrsonぬれたスライドの準備を可能と重複サンプリング時間なしでアッセイ動態を行い、検定を行っています。微視的データの大部分は、視覚的かつ幾分目的であるため、細胞計数は、複数の人によって確認されたことが重要である。その場合には、一度に一つのサンプルを処理することは個人的な効率に応じて三時五十七試料日の完全な分析を可能にすることができる。

血小板凝集媒介性は、臨床および実験分離株の両方を用いて行うことができる。実験線のためには、CD36結合寄生虫が凝集周波数を最大化するために使用されることをお勧めします。アッセイは、例えばロゼット又はPRBC結合、この表現のほとんど理解され、検査面を媒介し得る血小板上の受容体の研究を可能にする阻害アッセイの凝集に用いられるような他の凝集アッセイと結合することができる。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
RPMI 1640	Invitrogen	21870-092
アクリジンオレンジ	Invitrogen	A3568	10 mg/ml
ゲロフシン	B ブラウン	ゲロフシン
1 M HEPES	Invitrogen	15630
ゲンタマイシン		15750045	50 mg/ml
Albumax	GIBCO	1102-037
クエン酸ナトリウム真空管	BD	362760	4 ml 容量
倒立顕微鏡	ライカ	MD16000 B
蛍光顕微鏡	ライカ	EL6000	アクリジンオレンジとエチジウムブロマイド用の青色と緑色の光蛍光フィルターが含まれています