の解離、文化、および分析<em&gt;アフリカツメガエル</em&gt;胚性網膜組織

サマリー

アフリカツメガエルは、細胞運命の仕様および初代培養細胞内の個々の網膜細胞の生理機能を研究するための理想的なモデルシステムを提供します。ここでは、網膜組織を解剖し、カルシウム活性のために画像化し、in situハイブリダイゼーションにより分析される初代培養細胞を生成するための手法を提示する。

要約

神経板の前方領域は脊椎動物の網膜を生じさせることによって、プロセスは、臨床と基礎研究の両方の主要な焦点であり続けている。網膜疾患の理解と治療のための明白な医学的関連に加えて、脊椎動物の網膜の開発は、神経細胞の種類の判定や分化^1-16を理解する上で重要とエレガントなモデルシステムとして機能し続けています。神経網膜には、ステレオタイプのレイヤーに配置された6つの個別の細胞種（神経節、水平、アマクリン視細胞、双極細胞、ミュラーグリア細胞）が、大部分はすべての脊椎動物^12,14-18間で保存されているパターンで構成されています。

無傷の胚で網膜を勉強しながら、明らかにこの複雑な器官が層状構造に前脳の突起から発達する方法、あちこち恩恵多くの質問があります理解するために必要とされるmは推定網膜細胞の初代培養細胞^を用いた^7,19-23アプローチを採用する。たとえば、さまざまな段階で除去され、解離組織から細胞を分析すると、1つは、異なる発達段階で個々のセルの仕様の状態を認識することができ、すなわち、隣接組織^8,19-22との相互作用の非存在下における細胞の運命^,24-33。初代培養細胞はまた、治験責任医師は、特定の試薬 ​​と文化を扱い、単一細胞レベル^{5,8,21,24,27-30,33-39}に結果を分析することができます。 アフリカツメガエルの研究のための古典的なモデル系初期の神経発達^{19,27,29,31-32,40-42は} 、網膜の初代細胞培養^10,38,43-45に特に適したシステムとしての役割を果たします。

推定網膜組織はすぐに神経誘導^25,38,43に続いて、開発の初期段階からのアクセスが可能です。また、与えられた目卵黄の供給が含まれている胚の各セルに、網膜細胞は、このようにインキュベーションや他の血清ベースの製品^10,24,44-45の交絡影響を除去、緩衝塩溶液からなる非常にシンプルに定義された培地で培養することができる。

しかし、周囲の組織とその後の処理から網膜組織の分離は困難である。ここで、我々は、順番に、単一細胞の解像度でカルシウム活性と遺伝子発現について分析される初代培養細胞を調製するために使用されるアフリカツメガエルの網膜の細胞の解離と解離するための方法を提示する。本稿で紹介トピックが自発カルシウムトランジェントの分析ですが、技術が研究課題とアプローチ（ 図1）の広い配列に広く適用可能である。

プロトコル

全ての実験は、ウィリアム·アンド·メアリー大学におけるインスティテューショナル·動物実験委員会によって承認されたプロトコルに従って実施されています。このプロトコルで参照発達段階はNieuwkoopとフェーバー⁴⁶によるとされています。

1。解剖

1. 細胞培養培地及び室温になじまカルシウムマグネシウム培地（CMF）を許可します。また、0.1X Marcの改変リンゲル（MMR）のpHは7.4から7.6が必要になります。
2. 細胞培養層流フード内で30分間、UV光を照射することにより、以下の項目を殺菌。 （フードに配置する前に、70％エタノールで各項目をスプレーしてください。）
   • 35ミリメートルプラスチックペトリ皿。
   • 60ミリメートルプラスチックペトリ皿。
   • 35ミリメートルNunclon表面の料理をお楽しみいただけます。
   • 1.5 mlのマイクロチューブ。
   • P1000マイクロピペット（1,000μlのマイクロピペット）。
   • エアゾール耐性P1000ヒント（1,000μlのマイクロピペット用エアゾール耐性チップ）。
   • アルコール耐性のペン。
   • ファイン切開鉗子。
   • * 15 mlコニカルチューブ（のみイメージングカルシウム活性のために）。
   • *カルシウムの....

結果

首尾よく解剖オプティック胞（ステージ25）、網膜（ステージ35）の例は2Eおよび2J図に示されている。このプロトコルは、開発のさまざまな段階で使用することができますが、それはさらなる実験のために正確さを保証する唯一の網膜組織を得ることが重要です。慎重にすべての段階で表皮を取り除き、あなたの鉗子は網膜組織を穿刺しないことを確認してください。ステージ35歳以上では、レンズ、網膜の上に透明なレイヤーとして見ることができると鉗子を用いて慎重に削って除去することができる。

首尾よくメッキ初代培養細胞は 、 図3Aに示されている。組織を解離するときに、リンス液に解離するから組織を防ぐために推奨される30秒のインキュベーション時間よりも長くすすぎ液中に網膜外植片を残さないことが重要です。さらに、組織は完全な時間のためにトリプシン溶液中で解離することが許可されていることを確認培養プレート中の細胞の均一な分布を可能にするために（古い胚および幼虫期はさらに長く必要になるかもしれない。）細胞がメッキされ.......

ディスカッション

すべての脊椎動物全体で保存されており、その十分に特徴付けられた細胞の種類によって、網膜は細胞型仕様と分化を支配する分子細胞過程を研究するための有用なモデルを提供します。初代培養細胞は、遺伝子発現、蛋白質のダイナミクス、およびカルシウム、単一細胞の解像度レベルでの電気的活動を含むプロセスの広い範囲を調査するための強力な方法を与える。ここでは、 アフリカツメガエルにおける解剖推定網膜組織からの初代細胞培養のための簡単な手法を提示し、推定網膜が発達し、その初代細胞培養のごく初期の段階から容易にアクセス可能であることを与えられたこのような研究のために特に適した生物がで発生する可能性があります単純な食塩水から成る定義されたメディア。

ほとんどの実験室の設定に容易に適応が、特に細心の注意を必要とするいくつかの手順があります。 Dissectiアドオンは新鮮尖っ鉗子を用いて実施されるべきである。若い段階（<聖30）細胞培養培地と混合コラゲナーゼBと治療の恩恵を受ける。別のメディアから組織や細胞の移転を伴うすべての手順は、空気 - 溶液界面の近傍に入ってくるから組織や細胞を.......

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
試薬の名称	会社	カタログ番号
			解剖と培養するための
BDファルコンイージーグリップ組織培養皿、35ミリメートル	フィッシャー	08-772A
使い捨てのポリスチレンペトリ皿、60×15ミリメートル	フィッシャー	0875713A
35ミリメートルNunclon表面ペトリ皿（Airvent付き）	フィッシャー	12-565-91
デュモンファイン鉗子（Dumostar＃55）	フィッシャー	NC9341917
Cellatticeマイクロ支配プラスチックカバースリップ、25ミリメートル	フィッシャー	50-313-17
エチル-m-アミノ安息香酸メタンスルホン酸塩（MS-222）	MPバイオメディカル、LLC	103106
硫酸ゲンタマイシン	エンツォ生命科学	380から003-G025
ギブコトリプシン（1:250）パウダー	ライフテクノロジーズ	27250-018
クロストリジウム·ヒストリチカムからのコラゲナーゼB	ロッシュ	11088831001
ペニシリン - ストレプトマイシン	ギブコ	15140-122
ナイルブルー硫酸（オプション）	ファルツ＆バウアー	N05550
500mlの真空フィルター/ストレージボトルシステム、孔径0.22μm33.2センチメートル2 CN膜	コー​​ニング	430758
			カルシウムイメージングのための
のFluo-4は、DMSOで1mM溶液、永久細胞AM	ライフテクノロジーズ	F-14217
水中でのプルロニックF-127の10％溶液	ライフテクノロジーズ	P-6866
LSM 510共焦点顕微鏡システム	ツァイス	モデル廃止
ブロッキング試薬	ロッシュ	11096176001
			蛍光in situハイブリダイゼーション （FISH）を用
抗ジゴキシゲニン-POD、Fab断片	ロッシュ	11207733910
抗DNP-HRP抗体	パーキンエルマー	NEL747A
Cy3でNHSエステル	GEヘルスケア	PA13101
NHS-フルオレセイン	サーモサイエンティフィック	46409
ホルムアミド、脱イオン	Amresco	0606-950ML
トルラRNA、IX型	シグマアルドリッチ	R3629
ブタ腸粘膜からヘパリンナトリウム塩、	シグマアルドリッチ	H3393-250KU
CHAPS	シグマアルドリッチ	C3023
			表2に特異的な試薬や機器。
			ソリューション リファレンス 中身 細胞培養培地 チャンとスピッツァー、2009 54 116 mMのNaCl 0.67のKCl 2mMのCaCl 2 1.31 mMのMgSO 4を 4.6 mMトリス 1％（v：v）のペニシリン/ストレプトマイシン HClで7.8にpHを調整する。 0.22μmのCNのフィルターを通過することによって殺菌をフィルタリングします。 4℃で保存する カルシウム·マグネシウム培地（CMF） グーら 、1994 42;。Guとスピッツァー、1995年55 116 mMのNaCl 0.67のKCl 4.6 mMトリス 0.4 mMのEDTA 1％（v：v）のペニシリン/ストレプトマイシン HClで7.8にpHを調整する。 0.22μmのCNのフィルターを通過することによって殺菌をフィルタリングします。 4℃で保存する マレイン酸バッファ（MAB） Sive ら 、2000年53 100mMのマレイン酸 150mMのNaCl（pH7.5）で。 10X Marcの修正リンガー（MMR） Sive ら 、2000年53 100mMのNaCl のKCl 1mMのMgSO 4を 2mMのCaCl 2 5mMのHEPES pHはNaOHで7.4に調整 0.1X MMRは、50 mg / mlの硫酸ゲンタマイシン及びpHをNaOHで7.4に調整されているが含まれています。 10X MEMFAソリューション、 Sive ら 、2000年53 の0.1M MOPS緩衝液（pH7.4） 2mMのEGTA 1mMのMgSO 4を 3.7％ホルムアルデヒド 10X溶液は、ホルムアルデヒドことなく、4℃で保存することができますホルムアルデヒドは（標準37％ストックの1/10量）新鮮追加されます。 in situハイブリダイゼーション緩衝液中に SIV電子ら 、2000年53 50％ホルムアミド 5X SSC 1 mg / mlのトルラRNA 100 mg / mlのヘパリン 1Xデンハルト溶液 0.1％のTween20 0.1％CHAPS 10mMのEDTA。 ペニシリンとストレプトマイシンが我々の文化メディアで使用されている間ソリューションを提供しています。*ゲンタマイシン、抗生物質は、私たちのMMRのソリューションで使用されています。