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方法論記事

の解離、文化、および分析

13.5K 閲覧数

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DOI：

10.3791/4377

⸱

2012年12月23日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biology, College of William and Mary

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

アフリカツメガエルは、細胞運命の仕様および初代培養細胞内の個々の網膜細胞の生理機能を研究するための理想的なモデルシステムを提供します。ここでは、網膜組織を解剖し、カルシウム活性のために画像化し、in situハイブリダイゼーションにより分析される初代培養細胞を生成するための手法を提示する。

要約

神経板の前方領域は脊椎動物の網膜を生じさせることによって、プロセスは、臨床と基礎研究の両方の主要な焦点であり続けている。網膜疾患の理解と治療のための明白な医学的関連に加えて、脊椎動物の網膜の開発は、神経細胞の種類の判定や分化1-16を理解する上で重要とエレガントなモデルシステムとして機能し続けています。神経網膜には、ステレオタイプのレイヤーに配置された6つの個別の細胞種（神経節、水平、アマクリン視細胞、双極細胞、ミュラーグリア細胞）が、大部分はすべての脊椎動物12,14-18間で保存されているパターンで構成されています。

無傷の胚で網膜を勉強しながら、明らかにこの複雑な器官が層状構造に前脳の突起から発達する方法、あちこち恩恵多くの質問があります理解するために必要とされるmは推定網膜細胞の初代培養細胞を用いた7,19-23アプローチを採用する。たとえば、さまざまな段階で除去され、解離組織から細胞を分析すると、1つは、異なる発達段階で個々のセルの仕様の状態を認識することができ、すなわち、隣接組織8,19-22との相互作用の非存在下における細胞の運命,24-33。初代培養細胞はまた、治験責任医師は、特定の試薬 ​​と文化を扱い、単一細胞レベル5,8,21,24,27-30,33-39に結果を分析することができます。 アフリカツメガエルの研究のための古典的なモデル系初期の神経発達19,27,29,31-32,40-42は 、網膜の初代細胞培養10,38,43-45に特に適したシステムとしての役割を果たします。

推定網膜組織はすぐに神経誘導25,38,43に続いて、開発の初期段階からのアクセスが可能です。また、与えられた目卵黄の供給が含まれている胚の各セルに、網膜細胞は、このようにインキュベーションや他の血清ベースの製品10,24,44-45の交絡影響を除去、緩衝塩溶液からなる非常にシンプルに定義された培地で培養することができる。

しかし、周囲の組織とその後の処理から網膜組織の分離は困難である。ここで、我々は、順番に、単一細胞の解像度でカルシウム活性と遺伝子発現について分析される初代培養細胞を調製するために使用されるアフリカツメガエルの網膜の細胞の解離と解離するための方法を提示する。本稿で紹介トピックが自発カルシウムトランジェントの分析ですが、技術が研究課題とアプローチ（ 図1）の広い配列に広く適用可能である。

プロトコル

全ての実験は、ウィリアム·アンド·メアリー大学におけるインスティテューショナル·動物実験委員会によって承認されたプロトコルに従って実施されています。このプロトコルで参照発達段階はNieuwkoopとフェーバー46によるとされています。

1。解剖

  1. 細胞培養培地及び室温になじまカルシウムマグネシウム培地（CMF）を許可します。また、0.1X Marcの改変リンゲル（MMR）のpHは7.4から7.6が必要になります。
  2. 細胞培養層流フード内で30分間、UV光を照射することにより、以下の項目を殺菌。 （フードに配置する前に、70％エタノールで各項目をスプレーしてください。）
    • 35ミリメートルプラスチックペトリ皿。
    • 60ミリメートルプラスチックペトリ皿。
    • 35ミリメートルNunclon表面の料理をお楽しみいただけます。
    • 1.5 mlのマイクロチューブ。
    • P1000マイクロピペット（1,000μlのマイクロピペット）。
    • エアゾール耐性P1000ヒント（1,000μlのマイクロピペット用エアゾール耐性チップ）。
    • アルコール耐性のペン。
    • ファイン切開鉗子。
    • * 15 mlコニカルチューブ（のみイメージングカルシウム活性のために）。
    • *カルシウムのみ活性のイメージングのため。
  3. フードは紫外線滅菌やソリューションは室温に戻していた後は、ボンネット内の70％エタノールと場所のメディアボトルと手袋とメディアボトルダウンスプレー、フード内で層流をオンにします。
  4. フードの内側に適切なラベリングを確保し、 細胞の各プレートにはP1000マイクロピペットで、次の準備をします。
    • 解剖プレート - 10 mlの細胞培養培地を含有するもの60ミリメートルプラスチックシャーレ。
    • 培養プレート -ワン35ミリメートルNunclon表面の皿は2 mlの細胞培養培地を含む。 （Nunclonプラスチック皿はさらに、任意の接着剤で処理されていません。）
    • ひとつ空の1.5 mlのマイクロチューブ外植解離チューブ 。
    • * 1つの15 mlコニカルハヤブサ15 mlの細胞培養培地を含む試験管。過剰Fluo4-AMイメージングカルシウム活性時を洗い流すために。
  5. フードの内側には、それぞれの郭セッション用 P1000マイクロピペット（複数の網膜を1つのセッションで解剖することができます）で、次の準備をします。
    • 外植片リンスプレート - 2ミリリットルCMFを含むもの35ミリメートルプラスチックシャーレ。
    • 外植片解離プレート - 2ミリリットルCMFを含むもの35ミリメートルプラスチックシャーレ。
  6. フードの外側には、次の準備をします。
    • 10ミリリットル0.1X MMRを含む細胞のプレート当たり一つ60ミリメートルプラスチックシャーレ- プレートを固定している 。
    • 10ミリリットル0.1X MMRを含む細胞のプレート当たり一つ60ミリメートルプラスチックシャーレ- 兄弟プレート 。
    • 麻酔プレート - 10ミリリットル0.1X MMR + 0.5 mg / mlのMS-222（tricaine）を含む解剖セッションごとに1つの60mmのプラスチックシャーレ。
  7. 外植解離プレート （0.1％トリプシン溶液を生じる）、混在させる渦にCMFに40μlの5％トリプシンを追加し、脇に置きます。
  8. ステージ30歳未満である胚を解剖した場合、 解剖プレート （1 mg / mLのコラゲナーゼB溶液を生じる）、溶解して、脇に置き渦に10mgのコラゲナーゼBを追加。
  9. 所望の段階の胚を選択して、非無菌トランスファーピペットで保持プレートに移し、細かい鉗子を用いて卵黄膜（胚はまだ孵化していない場合）を取り外します。
  10. いくつかの転送は同じ非無菌トランスファーピペットで兄弟プレートに胚を上演した。
  11. 胚はステージ25以前の場合は、非無菌トランスファーピペットで麻酔プレートに胚を転送し、動きや刺激への応答が停止するまで、胚が座ることができそうでなければ、解剖と直接進みます。これは、取ることができる最大1分です。
  12. 解剖スコープ（4X目的、10X接眼レンズ）の下で解剖（ 図2）に進みます。

胚の段階では25歳以下：

  1. 非無菌トランスファーピペットを用いて解剖皿に胚を移す。
  2. 細かい鉗子の2ペアを使用して、後端に始まり、胚の前方部分にセメント腺を通じて継続し、胚の腹側の正中矢状カットを行う。
  3. 慎重にカットのエッジのいずれかをつかんで左右拡散によって胚を開きます。 解剖皿に面した背側と胚であり、腹側外胚葉と、この結果は、内胚葉および中胚葉を明らかにするために、オープンに広がった。
  4. 内胚葉と中胚葉（ 図2Aおよび2B）を除去し始める。この組織の最初で最大の層が持つ外見が非常に "ふわふわ"です。大型細胞と少し明らか組織。
  5. この層を除去した後、体節と脊索が見えるようになります。良好なコントラストは、 解剖皿に戻って転送する前に、10mlの細胞培養培地と2〜3分間ナイルブルー硫酸（水中）の1％溶液の100μlを含む別々の60ミリメートルのプラスチックシャーレに胚を移動します。これは、外胚葉、体節、かつ容易に識別およびオリエンテーションのために脊索を染色する。
  6. 胚の前方部分に焦点を当て、慎重に脊索と脳と視神経胞（ 図2C）を露出残っ中胚葉を除去します。
  7. 脳と視神経小胞が完全に露出されると、脳へのちょうど後方神経管および基礎となる外胚葉を切断するためにピンセットを使用しています。
  8. 外胚葉が上になるように上にこの部分を（脳と視神経胞）を回します。
  9. 再び慎重に、基盤となる光ファイバ胞を傷つけないように注意しながら外胚葉（ 図2D）を移動。
  10. 最後に、ピンセットを用いて、（ 図2D及び2E）脳から視神経胞を分離します。

ステージ25よりも古い胚の場合：

  1. 胚が麻酔プレートになっている間は、鉗子で胚の腹の部分を削除します。
  2. 良好なコントラストは、10ミリリットル0.1X MMRと解剖皿に移す前に2〜3分で1％ナイルブルー硫酸100μlを含む60ミリメートルのプラスチックシャーレに胚を移動します。これは、外胚葉を青く染色する。
  3. 一度解剖プレートで、網膜（または胚ステージ26から30のために眼胞）（ 図2Fおよび2G）を覆う外胚葉を引き戻す。ナイルブルー硫酸を使用した場合は、外胚葉は青く染色されますが、根本的な網膜組織はしません。
  4. FOで慎重網膜または眼胞を削除rceps（ 図2H、2I、および2J）。それは、鉗子の1ペアで固定胚を保持し、網膜や他の眼胞とを削除しておくと便利です。

2。組織や細胞のメッキの解離

重要な注意事項 -組織を転送する場合は、網膜や視神経胞は、任意の気液境界線を接触させないでください、これが発生した場合、細胞は溶解します。

  1. 眼胞または網膜を解剖された後、慎重にエアゾール耐性チップを使用してP100のマイクロピペットを用いてプレートをすすぎ、30秒間座ってできるように外植片に転送されます。
  2. 外植片解離プレートから外植解離チューブに CMFの0.1％トリプシンの80μlを。
  3. P100マイクロピペット及びエアゾール耐性チップを使用し、 外植片から網膜または眼胞を転送すると、 外植片Dissociatiに皿をすすぐTubeで、外植片の転送を回避することは、リンス液。
  4. 組織は室温で1時間外植解離チューブで解離することができます。一網膜はプレートごとに使用されました、しかし、我々はそれがプレートあたりのセルの数を増やすことが望まれているなら、複数の当たりプレートを使用することが可能であることに注意してください。
  5. プレートの細胞をするには、まずゆっくり外植解離チューブから溶液40μlを削除して、P100マイクロピペット及びエアゾール耐性チップを使用して破棄します。 P100セット〜40μlおよびエアゾール耐性チップを使用して、 培養プレートに細胞を（現在は組織が ​​解離していることを）転送します。プレート上に細胞を吸引するときは、ゆっくりとピペットとプレートの中央に小さな領域で細胞を維持。

注：セルの複数の画像は、実験を通じて取り出される場合、 培養プレートの下面にグリッド（Cellattice）を添付。これは同一の向きで同一の細胞の画像は、プロシージャ内のさまざまなポイントで撮影できるようになります。

  1. 細胞はNunclon板に付着するために少なくとも1時間静置座ってすることができます。この時間が経過すると、彼らは非常に優しく扱われなければならないか、またはそれらは切り離さになる可能性があります。
  2. 細胞と同じ温度で飼育され同胞胚を観察することによって、目的のステージへの培養細胞、。生きた細胞は、さらなる操作のために使用されていない場合は、この時点でMEMFA溶液中に固定することができます。

重要な注意：我々の実験のほとんどは細胞のめっき6時間以内に固定されています。培養中の細胞の寿命は、組織が解剖した段階、細胞内に依然として存在卵黄の量に依存する。年下（神経胚段階）から解剖細胞は細胞から取得しながら、5から6日間培養における健康を維持年上の胚（スイミングオタマジャクシステージは）2-3日間培養中の生のままになります。

3。カルシウムイメージング47から49

このプロトコルは、個々の細胞内カルシウムトランジェントを定量化するためのカルシウム感受性Fluo4-AMおよび共焦点顕微鏡を利用しています。 Fluo4-AMを使用してすべてのステップがFluo4-AMは光に敏感であるように、光から離れて行われるべきである。すべての洗浄を追加またはP1000マイクロピペット及びエアゾール耐性チップを使用して削除する必要があります。ピペッティングして細胞を乱すことを避けるためにゆっくりとプレートの縁に向かって行われるべきである。培養は、一般的に解剖された6時間内に固定されているため、メディアは変更されません。長期的な文化では、メディアは毎日変更する必要があります。

  1. Fluo4-AMは-20℃で保存されており、我々は、5μlのアリコートに格納することをお勧めします。ご使用になる前に、光源から離れFluo4は-AM5μlのアリコートを解凍し、直接このアリコートにプルロニックF-127の2μlを添加する。
  2. 所望の時間培養後の細胞（少なくとも1時間）、 培養プレートから細胞培養培地1mlを削除します。穏やかにピペッティングにより混合、Fluo4-AMおよびプルロニックにこれを追加します。
  3. 徐々に結像される細胞の培養プレートの端に戻ってこのソリューションのすべてを転送し、Fluo4-AMを吸収するために1時間静置この溶液中の細胞を残す。
  4. 洗い流すように、培養した細胞からFluo4-AM過剰、次の洗浄シリーズを完了して下さい：
    • プレートから培地を1mlを削除します。
    • 板に新鮮な細胞培養培地3mlを（15 mlコニカルチューブから）を追加します。
    • 2追加の洗浄を実行するたびに徐々にプレートから溶液3mlを除去し、新鮮な細胞培養培地3mlを加える。
  5. 細胞は、今では細胞培養培地4mlになるとFluo4-AMを含むべきである。 Fluo4-AMは酵素的に細胞から拡散したり、膜に結合した区画に、それを防止する、セル内に一度切断される。
  6. 文化を汚染するのマーカー粒子を防ぐためにカバーを保ちながら、イメージングのための共焦点顕微鏡のステージ上にプレートをセットする前に、皿の上に永久的なマーカーで赤い縦線を引きます。縦線は、シャーレ（ペトリ皿で​​はなく、蓋の底）の側を下に描かれている。その目的は、個々の細胞の正確な向きや位置が後の時点で再確立することができるように、視野に関して培養プレートの方向を示すことである。
  7. プレートは現在、イメージングのための共焦点顕微鏡のステージ上にロードするための準備ができています。共焦点顕微鏡（対物20X）を走査レーザーで明るいフィールドの設定を用いて細胞を可視化する。後でSi中の後に撮像する際の文化に簡単に同一視野を見つけるようにするCellaticeカバースリップ上で大規模なグリッド番号が含まれてい視野で、好ましくは、塊を含まない密な細胞の面積を求めよTUハイブリダイゼーション。イメージングに先立ち、文化を通じてダウン焦点を当て、細胞培養の位置と向きを情報として記録する細胞下のグリッドの明視野像を取る。これは、その後の分析のための細胞の再編成が可能になります。
  8. 焦点面を上げて始めてカルシウムイメージング（ 図3A）に先立って細胞の明視野像をキャプチャします。
  9. セルの中心面が合うと、プレートはカルシウム活性のイメージングのための準備ができています。設定は、顕微鏡やアプリケーションによって異なります。我々は、画像次のパラメータを使用して、1,2、または12時間アルゴン488nmレーザーを用いて細胞を：
    • 1時間の画像 ：
      • アルゴン488nmレーザーは最大30mWの電力の4％でスキャンします。
      • 毎4秒（時間あたり900スキャン）を1回スキャンします。
    • 2時間の画像：
      • アルゴン488nmレーザーは最大30mWの電力の4％でスキャンします。
      • 一度のスキャン8秒（時間当たり450スキャン）。
    • 12時間の画像：
      • アルゴン488nmレーザーは最大30mWの電力の2％でスキャンします。
      • 一回ごとに48秒（時間あたり75スキャン）をスキャンします。

これらのパラメータは、それぞれの時間枠は900静止フレーム画像のセットになります。カルシウム活性は、その後、ImageJの50のような画像処理アプリケーションを用いて、経時画像（ 図3B）の上に蛍光レベルを分析することによって、記録することができます。

4。細胞を固定する

  1. イメージング後、細胞をプレートから溶液3mlを除去し、培地の残りの1 mlに1ミリリットル2X MEMFAを追加することで、30分間固定することができます。
  2. 固定後、MEMFAを削除し、各1ミリリットルの容積、5分間の一連の洗浄で細胞を脱水する：
    • 1Xリン酸緩衝食塩水（PBS）で25％エタノール。
    • 1X PBSで50％エタノール。
      • 2 O（滅菌脱イオン蒸留水）中のLi> 75％エタノール。
    • -20℃で1ミリリットルの100％エタノールと店舗プレートと最後の洗浄を交換

注意：メタノールはまた、これらの洗浄用とストレージ用に使用することができます。

5。 蛍光 in situハイブリダイゼーション （FISH）

文化はアンダーソンラボ52で概説されるように、細胞培養用の修正と51に記載されているように 、アフリカツメガエルのための標準FISHプロトコルを使用して測定することができる。アンダーソンラボプロトコルへの変更は以下のとおりです。特記のない限り、すべての洗浄は、約1mlのボリュームに35ミリNunclonプレート上で実施しています。ソリューションは、Sive らで定義されています53特に断りのない限り。

重要な注意：結像するために細胞にin situハイブリダイゼーションを行う際にフルオレセイン標識RNAプローブを使用しないでくださいカルシウム活性。抗フルオレセイン抗体は残留に結合する細胞内Fluo4-AMおよび文化内のすべてのセルにおける正の信号を発生することがあります。

1日目：透過化とハイブリダイゼーション

  1. 補水洗浄をストレージに使う脱水溶媒に等級付けされるべきである。私たちの実験では、洗浄液を1X PBSでエタノールに等級付けされた。
  2. 水分補給後、室温で5分間ずつ細胞を1X PBSでさらに3回洗浄する。
  3. ファルコンチューブ内で無水酢酸の62.5μlの0.1 Mトリエタノールアミン液（pH8.0）25mlを混合し、すばやくとしてアンダーソンラボ52プロトコルで議論を徹底的に分散するまで混ぜる。室温で10分間、この混合物中で培養する。無水酢酸処理後、室温で5分間1X生理食塩クエン酸ナトリウム（SSC）で細胞を洗浄する。
  4. 最後のSSC洗浄を外し、細胞を透過するために10分間、0.2MのHCl（SDD H 2 O中）と交換します
  5. 5分間1X PBSで2回洗浄してHClを洗い流す。
  6. 60℃で6時間の最小振とう水浴中CでISHバッファにプレハイブリダイゼーションが、これは深刻な信号を減少させるように一晩プレハイブリダイゼーションしていません。
  7. 希釈されたプローブ750μlの（精製プローブから1:250希釈）で8月14日時間60℃で一晩ハイブリダイズする。 1.0から1.5μg/μLのからプローブ濃度範囲を精製した。

2日目：バインドされていないプローブと抗体とのインキュベーションの除去

  1. プローブを取り出し、60℃の0.2X SSCで5分間培養をすすぎ℃に60℃で1時間、新鮮0.2X SSCで洗う
  2. 水浴から文化を取り外し、それらを5分間室温に調整することができます。
  3. 室温で5分間0.2X SSCですすいでください。
  4. 0.1％トリトンX-100（PBT）で1X PBSで15分間洗浄する。
  5. 内因性ペルオキシダーゼを不活性化するために、PBTの2％H 2 O 2溶液で1時間洗浄してください。
  6. は1Xトリスで15分間の洗浄とすすぎ0.1％のTween20（TBST）で緩衝生理食塩水。
  7. 室温で1時間マレイン酸バッファー（MAB）の2％ブロッキング試薬でブロックします。我々は、このブロッキングメソッドがPBTで20％羊血清でブロッキングの従来の方法と比較して感度を増加させることを見出した。
  8. 4℃で一晩、POD標識抗体の1:1000希釈を含むMABの2％ブロッキング試薬1mlの培養する

3日目：非結合抗体を除去し、蛍光発生

  1. 抗体溶液を除去し、室温で5分間、TBSTで3回すすいでください。
  2. 継続的に遅い速度で揺らしながら室温で15分間、TBSTで4回洗浄する。
  3. 10分間室温でのPBTで2回洗浄する。
  4. 1:200フルオレセインチラミドまたはPBT中に希釈したCy3 1時25チラミド750μlを適用します。室温で5分間インキュベートし、2.5μlの0.3％H 2を追加 O 2。開発するための信号を可能にするために40分間ロック。
  5. 振盪しながら室温でTBSTで15分間ずつ、少なくとも4回洗浄する。
  6. 信号が完全に開発されたら、1X PBTで5分間洗浄します。
  7. 4℃、室温で1時間と1X PBSでストア用の1X MEMFAに修正

6。画像FISH結果とカルシウムイメージングデータの共同登録

  1. FISHの完了時に、細胞培養プレートは、細胞が特定のプローブのための肯定的な蛍光シグナルを表示するかを決定するために結像される。カルシウムイメージング中に研究ビューの正確なフィールドを見つけて、カルシウムの画像フレームの方向にプレートを揃えるCellatticeカバースリップを使用しています。
  2. セルの中心面にフォーカスし、その最大1 mWのパワー（ 図3C）の15％がヘリウム、ネオンのHeNe 543 nmのレーザーを使用して、単一の高解像度の画像を撮影する。
  3. カルシウムイメージングプロトコルから撮影した画像の元の900フレームセットで、画像処理プログラム（例えばImageJの50など）を使用することにより、目的の領域（ROI）などの個々の細胞を識別します。時間蛍光ペア ​​値（ 図4）を表すデータ点の集合としてのROI蛍光データを抽出します。
  4. カルシウム画像（ 図3D）から同定されたROIとFISH結果の画像を重ね合わせる。
  5. 、プローブの正のプローブに負、または不明として、各ROIを登録 - ROIに対応するセルがもはや魚の画像の視野内で検出できなかった場合はインチ
  6. 異なる解剖の段階（ 図5Aおよび5C）または異なるFISHプローブ（ 図5Bおよび図5D）陽性細胞間カルシウム活性レベルを比較する統計解析スクリプトを（MATLABまたは他のプログラミング言語を介して設計）を使用してプロセスのROI蛍光データ。私たちの研究室で使用されるすべてのスクリプトは、ご要望に応じて自由に利用可能です。

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結果

首尾よく解剖オプティック胞（ステージ25）、網膜（ステージ35）の例は2Eおよび2J図に示されている。このプロトコルは、開発のさまざまな段階で使用することができますが、それはさらなる実験のために正確さを保証する唯一の網膜組織を得ることが重要です。慎重にすべての段階で表皮を取り除き、あなたの鉗子は網膜組織を穿刺しないことを確認してください。ステージ35歳以上では、レンズ、網膜の上に透明なレイヤーとして見ることができると鉗子を用いて慎重に削って除去することができる。

首尾よくメッキ初代培養細胞は 、 図3Aに示されている。組織を解離するときに、リンス液に解離するから組織を防ぐために推奨される30秒のインキュベーション時間よりも長くすすぎ液中に網膜外植片を残さないことが重要です。さらに、組織は完全な時間のためにトリプシン溶液中で解離することが許可されていることを確認培養プレート中の細胞の均一な分布を可能にするために（古い胚および幼虫期はさらに長く必要になるかもしれない。）細胞がメッキされ...

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ディスカッション

すべての脊椎動物全体で保存されており、その十分に特徴付けられた細胞の種類によって、網膜は細胞型仕様と分化を支配する分子細胞過程を研究するための有用なモデルを提供します。初代培養細胞は、遺伝子発現、蛋白質のダイナミクス、およびカルシウム、単一細胞の解像度レベルでの電気的活動を含むプロセスの広い範囲を調査するための強力な方法を与える。ここでは、 アフリカツメガエルにおける解剖推定網膜組織からの初代細胞培養のための簡単な手法を提示し、推定網膜が発達し、その初代細胞培養のごく初期の段階から容易にアクセス可能であることを与えられたこのような研究のために特に適した生物がで発生する可能性があります単純な食塩水から成る定義されたメディア。

ほとんどの実験室の設定に容易に適応が、特に細心の注意を必要とするいくつかの手順があります。 Dissectiアドオンは新鮮尖っ鉗子を用いて実施されるべきである。若い段階（<聖30）細胞培養培地と混合コラゲナーゼBと治療の恩恵を受ける。別のメディアから組織や細胞の移転を伴うすべての手順は、空気 - 溶液界面の近傍に入ってくるから組織や細胞を...

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開示事項

特別な利害関係は宣言されません。

謝辞

我々は優雅にスクリプト用ドクタージョンヘイズに感謝;博士。エリック·ブラッドリーと共焦点顕微鏡の支援のためのクリストファー·デル·ネグロ、ドリュー·ヒューズ、プロジェクトを開発し、予備的なデータを提供する際に自分の仕事のためラウラOdorizzi、アレックスGarafalo、レベッカラウデン、とリズ·マクマレイ、統計分析に役立つ提案のための博士グレッグスミス。この作品は、MSSにNIHの助成金（NINDS IR15N5067566-01）とウィリアム·アンド·メアリー大学のハワードヒューズ医学研究所の科学教育助成金によって支えられている。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
試薬の名称 会社 カタログ番号
解剖と培養するための
BDファルコンイージーグリップ組織培養皿、35ミリメートルフィッシャー 08-772A
使い捨てのポリスチレンペトリ皿、60×15ミリメートルフィッシャー 0875713A
35ミリメートルNunclon表面ペトリ皿（Airvent付き） フィッシャー 12-565-91
デュモンファイン鉗子（Dumostar＃55） フィッシャー NC9341917
Cellatticeマイクロ支配プラスチックカバースリップ、25ミリメートルフィッシャー 50-313-17
エチル-m-アミノ安息香酸メタンスルホン酸塩（MS-222） MPバイオメディカル、LLC 103106
硫酸ゲンタマイシンエンツォ生命科学 380から003-G025
ギブコトリプシン（1:250）パウダーライフテクノロジーズ 27250-018
クロストリジウム·ヒストリチカムからのコラゲナーゼB ロッシュ 11088831001
ペニシリン - ストレプトマイシンギブコ 15140-122
ナイルブルー硫酸（オプション） ファルツ＆バウアー N05550
500mlの真空フィルター/ストレージボトルシステム、孔径0.22μm33.2センチメートル2 CN膜コー​​ニング 430758
カルシウムイメージングのための
のFluo-4は、DMSOで1mM溶液、永久細胞AM ライフテクノロジーズ F-14217
水中でのプルロニックF-127の10％溶液ライフテクノロジーズ P-6866
LSM 510共焦点顕微鏡システムツァイスモデル廃止
ブロッキング試薬ロッシュ 11096176001
蛍光in situハイブリダイゼーション （FISH）を用
抗ジゴキシゲニン-POD、Fab断片ロッシュ 11207733910
抗DNP-HRP抗体パーキンエルマー NEL747A
Cy3でNHSエステル GEヘルスケア PA13101
NHS-フルオレセインサーモサイエンティフィック 46409
ホルムアミド、脱イオン Amresco 0606-950ML
トルラRNA、IX型シグマアルドリッチ R3629
ブタ腸粘膜からヘパリンナトリウム塩、 シグマアルドリッチ H3393-250KU
CHAPS シグマアルドリッチ C3023

表2に特異的な試薬や機器。

ソリューション リファレンス 中身
細胞培養培地チャンとスピッツァー、2009 54 116 mMのNaCl
0.67のKCl
2mMのCaCl 2
1.31 mMのMgSO 4を
4.6 mMトリス
1％（v：v）のペニシリン/ストレプトマイシン
HClで7.8にpHを調整する。
0.22μmのCNのフィルターを通過することによって殺菌をフィルタリングします。
4℃で保存する
カルシウム·マグネシウム培地（CMF） グーら 、1994 42;。Guとスピッツァー、1995年55 116 mMのNaCl
0.67のKCl
4.6 mMトリス
0.4 mMのEDTA
1％（v：v）のペニシリン/ストレプトマイシン
HClで7.8にpHを調整する。
0.22μmのCNのフィルターを通過することによって殺菌をフィルタリングします。
4℃で保存する
マレイン酸バッファ（MAB） Sive ら 、2000年53 100mMのマレイン酸
150mMのNaCl（pH7.5）で。
10X Marcの修正リンガー（MMR） Sive ら 、2000年53 100mMのNaCl
のKCl
1mMのMgSO 4を
2mMのCaCl 2
5mMのHEPES
pHはNaOHで7.4に調整
0.1X MMRは、50 mg / mlの硫酸ゲンタマイシン及びpHをNaOHで7.4に調整されているが含まれています。
10X MEMFAソリューション、 Sive ら 、2000年53 の0.1M MOPS緩衝液（pH7.4）
2mMのEGTA
1mMのMgSO 4を
3.7％ホルムアルデヒド
10X溶液は、ホルムアルデヒドことなく、4℃で保存することができますホルムアルデヒドは（標準37％ストックの1/10量）新鮮追加されます。
in situハイブリダイゼーション緩衝液中に SIV電子ら 、2000年53 50％ホルムアミド
5X SSC
1 mg / mlのトルラRNA
100 mg / mlのヘパリン
1Xデンハルト溶液
0.1％のTween20
0.1％CHAPS
10mMのEDTA。

ペニシリンとストレプトマイシンが我々の文化メディアで使用されている間ソリューションを提供しています。*ゲンタマイシン、抗生物質は、私たちのMMRのソリューションで使用されています。

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