微小電極アレイを用いたsiRNAの付着細胞への高効率、サイト固有のトランス体（MEA）

サマリー

記事の詳細は微小電極アレイ（MEA）を使用して付着した哺乳動物細胞培養におけるsiRNAのスクランブル配列の部位特異的なトランスフェクションするためのプロトコル。

要約

このようなsiRNAおよびshRNAなどの真核生物とRNAi剤のその後の開発におけるRNAi経路の発見は、機能ゲノミクスおよび治療 ​​のための特定の遺伝子の^1-8を黙らせる強力な方法を実現しました。 RNAiに基づく研究に関与する主な課題は、標的細胞へのRNAiの薬剤の送達である。このようなバルクエレクトロポレーションおよび化学的トランスフェクション法のような従来の非ウイルス送達技術は、多くの場合、配達上必要な空間的制御を欠いており^、9月12日貧弱トランスフェクション効率を与える。このようなカチオン性脂質、カチオン性ポリマーとナノ粒子のような化学的トランスフェクション法の最近の進歩は非常に強化されたトランスフェクション効率が¹³をもたらしました。しかしながら、これらの技術は、まだ非常に小型化されたハイスループット技術、単一細胞研究と細胞間相互作用の調査を受けることができます配信を正確に空間的制御を提供するために失敗する。 ntは"遺伝子送達で>最近の技術の進歩は。接着細胞のハイスループットトランスフェクションの^{14から23、}マイクロエレクトロポレーションを使用しているかの過半数を有効にしたマイクロスケールエレクトロポレーション（最大単セルまで）配達を正確に時空間制御を提供しており、示されている^{24から26まで}の高効率^19を達成する。さらに、エレクトロポレーションベースのアプローチは、化学ベースのトランスフェクションの方法で必要に応じて、siRNAやDNA複合体とのインキュベーションの長時間（通常4時間）を必要とし、裸の​​siRNAやDNAの直接エントリにつながらない細胞質への分子。結果遺伝子の発現としては、トランスフェクション²⁷後6時間、早ければ達成することができます。私たちのラボは、以前に付着哺乳動物細胞培養^17-19にサイト固有のトランスフェクションのための微小電極アレイの使用（MEA）を実証してきました。 MEAベースのアプローチでは、遺伝的ペイロードの配信は、ローカライズされたマイクロスケールelectroporatiを介して実現されるセルの上に。選択された電極への電気パルスの印加は、刺激電極の領域に存在する細胞のエレクトロポレーションにつながる局所的な電界を発生させる。微小電極を独立して制御するには、トランスフェクションオーバー空間的、時間的な制御を提供し、また、同一の培養実験のスループットを向上させ、文化·ツー·文化の変動を減少させる上で実行される複数のトランスフェクションベースの実験を可能にします。

ここでは、実験装置やエレクトロポレーションを用いて蛍光標識スクランブル配列のsiRNAを用いて接着したHeLa細胞の標的とトランスフェクションのためのプロトコルを記述します。同じプロトコルはまた、プラスミドベクターのトランスフェクションのために使用することができます。また、ここで説明されたプロトコルは、簡単にマイナーな修正と哺乳動物細胞株の多様性に拡張することができます。事前定義されたおよびカスタムの両方の電極パターンとMEAの商業的利用は、この手法アクセシブルトンを作る基本的な細胞培養用器材のoほとんどの研究室。

プロトコル

1。 MEAの準備

1. 以前は¹⁸またはそのようなマルチチャンネルシステムとして、MEAメーカーのベンダーから直接購入し説明されているようにエレクトロポレーション実験で使用するためのMEAは、標準のフォトリソグラフィ技術を用いて製造することができる（http:/www.multichannelsystems.com/）とAlpha MED科学株式会社（ http://www.MED64.com） 。実験に用いたMEAは固体エレクトロニクス研究所（CSSER）のためのセンターによって運営されてアリゾナ州立大学のクリーンルーム施設で社内で作製した。実験に用いたMEAはよく1センチメートル内径50〜200μmのガラスの中から電極径サイズが4の配列で8で32インジウムスズ酸化物電極を持っていた。ガラスはよくポリジメチルシロキサン（PDMS）を使用して、MEAに接着した。
2. セルの前にオートクレーブでMEAを殺菌するeeding。彼らはMEAの完全性を損​​なわない限り、このような70％エタノールに浸漬するように殺菌するための他の方法、別の場所で説明されているようにUV処理及び熱水処理を使用することもできます。
3. 層流フードにオートクレーブし....

ディスカッション

このビデオの記事では、siRNAのスクランブル配列とHeLa細胞の部位特異的なトランスフェクションのためのMEAの使用例を示します。この技術の利点の一つは、主要な細胞株を含む種々の細胞株への適用である。私たちの研究室では以前にE18の日齢のラットおよびスクランブルsiRNA配列とGFPプラスミド^18,19とNIH-3T3細胞から主海馬ニューロン培養の部位特異的なトランスフェクションのために、この技術の使用を実証しています。我々はまた、HeLa細胞における内因性標的（未発表データ）に対して機能的なsiRNAを提供する上での成功を収めている。典型的な市販のMEAは、蛍光免疫染色の技法を用いて、遺伝子サイレンシングの機能的影響の定量的評価を可能にする、光学イメージング（正立顕微鏡）と互換性があります。さらに、MEAにおいて微小電極は、遺伝的摂動に応答して、このような一次神経細胞などの細胞の電気的活動を監視するために使用することができます。ザMEAのユニークな性質は、それによって実験的なスループットを向上させ、単一の細胞培養での同時複数の実験を可能にします。現在、MEAベースのシステムとの主な制限は、高い従来の化学的トラン.......

材料

試薬の名称	会社	カタログ番号	コメント（オプション）
細胞培地： アドバンストMEM L-グルタミン、200mMの ペニシリン/ストレプトマイシン ウシ胎仔血清	GIBCO /インビトロジェン Himedia研究所/ VWR ロンザグループ株式会社 GIBCO /インビトロジェン	12492-013 95057-448 09-757F 16000-044	細胞培地組成： アドバンスMEM中で2％のFBS、2％L-グルタミンおよび2％Pennstrep
トリプシンEDTA	メディアテック株式会社	25から053-CL
PBS	メディアテック株式会社	21から040-CV
sequをスクランブルタグ付けアレクサ488とローダミンリファレンスのsiRNA	キアゲン社	1027292
エレクトロポレーション緩衝液	バイオラッドラボラトリーズ	165-2677
波形発生器	実利的な	2414A	希望するパルスを供給することができます任意波形/パルス·ジェネレータを使用することができます。