ペプチドエピトープ特異的T細胞のMHCテトラマーベースの濃縮

サマリー

エピトープ特異的T細胞の低周波の集団を区別し、フローサイトメトリーによって、それらを分析するためのMHCテトラマーと磁性マイクロビーズ：このプロトコルは、ペプチドの使用について説明します。この方法は、から対象の内因性T細胞集団の直接調査を可能に実験システム。

要約

in vivo実験モデルでと適応免疫を勉強研究者のための基本的な必要性は、それらのT細胞抗原受容体（TCR）の特異性に基づいてT細胞を識別する能力である。 T細胞のバルク集団が特定の抗原およびエピトープ特異的T細胞をin vitro で刺激されている多くの間接的な方法が利用可能です、増殖、サイトカイン産生や活性化マーカー¹の発現などの機能的応答の測定によって識別されます。しかし、これらの方法では、唯一の多くの可能な機能の一つを示すエピトープ特異的T細胞を同定し、そして、彼らは素朴な前駆周波数でエピトープ特異的T細胞を検出するのに十分な小文字は区別されません。人気のある選択肢は、TCRトランスジェニック養子移入モデルであるTCRトランスジェニックマウス由来モノクローナルT細胞はEASIできるエピトープ特異的T細胞の大前駆体細胞集団を作成するために組織適合ホストに播種するLyはコンジェニックマーカー抗体^2,3の使用で追跡。パワフルながら、この方法では^、4,5の単一エピトープに対して特異性を有するT細胞の非生理的な周波数に関連付けられている実験的な成果物に苦しんでいる。また、本システムは、ポリクローナル集団内のエピトープ特異的T細胞クローンの機能的な異質性を調査するために使用することはできません。

MHC（pMHC複合）錯体：適応免疫を研究するための理想的な方法は、単にその同族ペプチドに結合することにより、TCRの特異性を区別する方法を用いて内因性のT細胞レパートリーからのエピトープ特異的T細胞の直接検出を関与させるべきである。 pMHC複合テトラマーおよびフローサイトメトリーの使用は、この^6を達成^しますが、のみ、次の抗原誘発クローン増殖を発見したエピトープ特異的T細胞の高頻度の個体群の検出に限定されています。このプロトコルでは、pMHC複合テトラマーの使用を調整する方法を説明し、マグネチック細胞濃縮技術は、マウスリンパ組織^3,7から超低周波エピトープ特異的T細胞の検出を可能にします。この手法では、1は、包括的に免疫応答の全ての段階で、マウスにおける内因性T細胞の全体のエピトープ特異的集団を追跡することができます。

プロトコル

1。リンパ組織からの細胞の単離

1. の小さな正方形を含む60mmの培養皿に、氷冷cEHAA（EHAA +10％FBS、ペニシリン/ストレプトマイシン、ゲンタマイシン、2mM L-グルタミン、55 mM 2 - メルカプトエタノール）または他の同等のT細胞培地1mlを追加氷の上に100μmのナイロンメッシュと場所。
2. マウスを安楽死させる。
3. 脾臓、できるだけ多くの簡単にアクセスできるリンパ節を切除する。これらは少なくとも鼠径部、腋窩、上腕、頸部、および腸間膜リンパ節を含める必要があります。培養皿にナイロンメッシュの上に置きます。
4. ナイロンメッシュ上のリンパ組織はリンパ球を解放するために、閉じた1.5 mlのマイクロチューブのフラットトップを使って、 優しくマッシュ。懸濁液中に細胞を動作するように上下cEHAAとピペットの別の1ミリリットルを追加します。 15 mlのポリプロピレン製遠心分離管の上に配置されたナイロンメッシュの別の部分を介して細胞を移す。氷冷cEHAA、POの別の1ミリリットルと皿とメッシュをすすぐ同じチューブにボリュームをoling。 4ミリリットルの最終細胞懸濁液の容積を達成するために繰り返します。
5. 15ミリリットルの最終容量に冷たいソーター酸緩衝液（PBS + 2％FBS、0.05％アジ化ナトリウム）を追加し、300×gで5分間遠心分離管を、4℃
6. 慎重に液体が滴がチューブの両側に残っていないことを確認し、上清を吸引除去する。約2倍のペレット自体のそれに等しい最終容量へのFcブロック（ソーターバッファ+ 2.4G2抗体）で細胞ペレットを再懸濁します。例えば、ナイーブマウスの脾臓およびリンパ節は通常、約100μlの細胞ペレットを生成します。この場合は、200μlにボリュームを持って来るためのFcブロックの100μlを添加する。細胞凝集度が大きいが発生した場合は、ピペットチップを用いて、この時点で細胞塊を除去します。

2。四量体染色

1. 10 NM（または経験的に最適化された濃度）の最終濃度にPEまたはAPC標識pMHC複合テトラマーを追加します。
2. ミックスとインキュベーション室温で1時間TE（または経験的に最適化された時間と温度）。
3. 15ミリリットルの容積に冷たいソーター·バッファを追加し、300×gで、4℃で5分間、チューブを遠心氷の上または°C今から4でサンプルを保管してください。
4. 慎重に液体が滴がチューブの両側に残っていないことを確認し、上清を吸引除去する。 200μlの最終容量にソーター·バッファ内の細胞ペレットを再懸濁します。二量体の濃縮​​は、150μlの最終容量に再懸濁します。

3。磁気濃縮

1. ミルテニー抗PEまたは抗APCマイクロビーズの50μlを添加する。二量体の濃縮​​のために、両方の50μlを添加する。
2. 4で混ぜ合わせ、20分間インキュベート℃、
3. 15ミリリットルの容積に冷たいソーター·バッファを追加し、300×gで、4℃で5分間、チューブを遠心
4. 待っている間、またはMidiMACS QuadroMACS磁石にミルテニーLSの磁気カラムを設定します。上の開いている15mlのポリプロピレン遠心管を置き列の真下ラック。
5. それは15 mlのチューブに排出できるように、列の先頭にソーター緩衝液3mlを加える。
6. 列の上に100μmのナイロンメッシュ正方形を置きます。
7. 細胞が回転し終わったら、慎重に上清を吸引し、ソーター緩衝液3mlでペレットを再懸濁します。
8. カラムの上にナイロンメッシュを介して細胞懸濁液を移す。
9. 細胞懸濁液が完全にカラムに排水されている場合、プロセス内でメッシュをすすぎ、ソータバッファの別の3mlでオリジナルのチューブを洗浄し、カラムにナイロンメッシュを介してバッファを転送します。ナイロンメッシュを破棄します。
10. バッファが完全にカラムに排水している場合、その列にソーター·バッファの別の3ミリリットルを追加します。
11. 3×3 mlの洗浄の合計に対して、ステップ10を繰り返します。
12. 新しい15 mlのポリプロピレン製遠心管を介して磁石と場所からカラムを取り外します。
13. tにソーター緩衝液5mlを追加彼列。
14. すぐに列の上部にプランジャーを挿入し、一つの連続した​​動きで、チューブにカラムOUTバッファを強制的に、プランジャーのすべての方法を下に押します。
15. 300×gで5分間溶出結合画分およびフロースルー非結合画分、4℃を含むチューブを遠心
16. 慎重に液体が滴がチューブの両側に残っていないことを確認しながら、結合画分から上清を吸引除去する。正確に95μlの最終容量にソーター·バッファ内の細胞ペレットを再懸濁します。 2ミリリットルの最終容量に非結合画分を吸引除去し、再懸濁します。

4。フローサイトメトリー

1. 各画分については、5μlを削除し、5ミリリットルのFACS管で計数ビーズを200μl（ソーター·バッファ内の20万個/ mlの濃度に調整）に追加します。 4で取っておく°後の分析のためのC。時間を節約するために、ビーズは、実験開始前にラベルしたチューブにあらかじめ等分することができます。
2. 午前の準備ASTERは、セル（ 表1）の表面マーカーを染色する抗体のミックス。時間を節約するために、これは実験の開始前に行うことができます。
3. 結合分画は、チューブ内の細胞の約90μlに直接抗体カクテルの用量を追加します。非結合画分の分析が必要な場合は、5ミリリットルのFACSチューブに細胞の90μlを転送し、抗体カクテルの用量を追加します。
4. フローサイトメーター用の単一色補正のコントロールパネルを設定します。使用する各蛍光色素の場合は、対応する蛍光色素に結合した抗CD4抗体の1μlを5ミリリットルのFACSチューブ内に残った非結合分画細胞の50μlを混合します。同様に染色されていないコントロールを設定することを忘れないでください。
5. ボルテックスし、4℃で30分間、すべてのサンプルをインキュベート℃に
6. 300×gで5分間、4℃で各チューブと遠心分離機にソーター緩衝液5mlを追加
7. 結合画分については、慎重に上清を吸引し、ソーターbufの200μlの細胞を再懸濁FER。 1.2ミリリットルのFACSマイクロチューブに細胞を移します。同じマイクロチューブにソーター·バッファーおよびプールの別の200μlで管を洗浄します。細胞塊が明らかである場合には、50μmのフィルターを介して細胞を渡す。
8. 非結合画分と補償コントロール、またはデカントで上澄みを再懸濁し、2mlのソーターバッファを吸引するための。
9. 単一色補正コントロールを使用して、フローサイトメーターを設定します。記録する追加パラメータとして、側方散乱幅（SSC-W）を選択します。
10. 図1および図2に示すように、CD4 +またはCD8 + T細胞を同定するために連続したインクルージョンゲートのシーケンスを使用して染色したサンプルを分析します。結合画分については、最大2,000,000の合計の最大イベントにできるだけ多くの細胞を収集しています。非結合分画、1,000,000合計イベントを収集します。買収レートを1秒あたりのイベントで、または3000以下に保つ。
11. 同じマシンの設定を使用して、数えるビーズサンプルを分析する。万合計イベントを収集します
12. FCSのファイルなど、すべてのデータを保存します。

5。データ解析

1. FlowJoソフトウェアを使用してカウントビーズサンプル用のFCSデータファイルを分析します。前方にプロットFITCによって散乱および（ 図1および図2を参照）をカウントするビーズをaroungゲートを設定します。各試料で検出されたビーズをカウントの合計数を決定する。採取した細胞イベントの数を決定するために収集されたイベントの合計数から減算します。
2. ボックス1で概説方程式を用いて、各サンプル中のすべてのセルの総数を計算します。
3. ステンドバインドおよび非バインド分数サンプル用のFCSデータファイルを分析します。リンパ+サイド散布幅^LO、ダンプ、CD3 +、CD4 +またはCD8 +、テトラマー、図1および図2に示すように、各試料中の+ T細胞。を識別するために、連続的なインクルージョンゲートのシーケンスを設定
4. CD4を定義するために使用される包接ゲートの各々の周波数によって、サンプル中の細胞の総数を掛け+テトラマー+またはCD8 +テトラマー+細胞エピトープ特異的T細胞（ボックス1）の合計数を計算する。

結果

図2は、以前に関連するペプチド+ CFAで免疫したマウスについての代表的なデータを示しながら、 図1は 、ナイーブマウスからpMHCIIテトラマー濃縮脾臓及びリンパ節試料の代表的なフローサイトメトリープロットを描いている。シリアル·ゲーティングは、CD4の分析+ T細胞集団からの自家蛍光およびその他の不要なイベントを削除します。 CD8 + T細胞集団は、CD4のpMHCIIテトラマー染色+ T細胞のための有用な内部ネガティブコントロールとして機能します。ゲーティングはより難しくなり、濃縮から結合画分は、通常、非結合分画より自家細胞の有意に高い割合を含んでいることに注意してください。

ビーズ計数分析から決定するように、試料中のエピトープ特異的T細胞の絶対数は決定要因として、テトラマー+はこれらの細胞の割合は、濃縮されたサンプルの結合分画内のすべてのセルの合計数を乗じて算出しています細胞染色分析（ボックス1）からNED。

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ディスカッション

このプロトコルによって提示pMHC複合テトラマー基づく細胞濃縮法は、内因性のT細胞レパートリーからエピトープ特異的T細胞を研究するための強力なツールです。 pMHC複合テトラマーの使用は、同族のpMHC複合リガンドと結合するTCRの能力に直接基づくエピトープ特異的T細胞の検出を可能にします。濃縮は、抗原特異的T細胞の非常にまれな集団が彼らの遺伝子構造または前駆周波数の任意の操作なしで、T細胞の内因性レパートリーから検出することができるように感度のレベルを提供します。結果として、この手法は、調査員が直接、免疫応答の全ての段階を通じて、素朴なレベルから in vivo実験系からの内因性抗原特異的T細胞集団を追跡することができます。

このプロトコルは、二次リンパ器官からのエピトープ特異的CD4 + T細胞を濃縮するpMHC複合クラスII（pMHCII）四量体の使用に最適化されていマウスのだ。しかしながら、この技術はまた、pMHC複合クラスI（pMHCI）テトラマーおよびCD8 + T細胞⁹に適用可能である。 CD4とは異なり、CD...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
試薬ベンダーカタログ番号
PEまたはAPCの共役pMHC複合テトラマー（またはマルチマー）	NIHのテトラマーコアから得られた、研究者によって作られた、または商業的供給源から購入
アンチPE結合磁性マイクロビーズ	ミルテニー	130-048-801
アンチAPC共役磁性マイクロビーズ	ミルテニー	130-090-855
LS磁気列	ミルテニー	130-042-401
MidiMACSまたはQuadroMACS磁石	ミルテニー	130-042-302または130-090-976
細胞計数ビーズ	ライフテクノロジーズ	PCB-100