エピトープ特異的T細胞の低周波の集団を区別し、フローサイトメトリーによって、それらを分析するためのMHCテトラマーと磁性マイクロビーズ：このプロトコルは、ペプチドの使用について説明します。この方法は、から対象の内因性T細胞集団の直接調査を可能に実験システム。
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この記事について
サマリー
要約
in vivo実験モデルでと適応免疫を勉強研究者のための基本的な必要性は、それらのT細胞抗原受容体（TCR）の特異性に基づいてT細胞を識別する能力である。 T細胞のバルク集団が特定の抗原およびエピトープ特異的T細胞をin vitro で刺激されている多くの間接的な方法が利用可能です、増殖、サイトカイン産生や活性化マーカー1の発現などの機能的応答の測定によって識別されます。しかし、これらの方法では、唯一の多くの可能な機能の一つを示すエピトープ特異的T細胞を同定し、そして、彼らは素朴な前駆周波数でエピトープ特異的T細胞を検出するのに十分な小文字は区別されません。人気のある選択肢は、TCRトランスジェニック養子移入モデルであるTCRトランスジェニックマウス由来モノクローナルT細胞はEASIできるエピトープ特異的T細胞の大前駆体細胞集団を作成するために組織適合ホストに播種するLyはコンジェニックマーカー抗体2,3の使用で追跡。パワフルながら、この方法では、4,5の単一エピトープに対して特異性を有するT細胞の非生理的な周波数に関連付けられている実験的な成果物に苦しんでいる。また、本システムは、ポリクローナル集団内のエピトープ特異的T細胞クローンの機能的な異質性を調査するために使用することはできません。
MHC（pMHC複合）錯体：適応免疫を研究するための理想的な方法は、単にその同族ペプチドに結合することにより、TCRの特異性を区別する方法を用いて内因性のT細胞レパートリーからのエピトープ特異的T細胞の直接検出を関与させるべきである。 pMHC複合テトラマーおよびフローサイトメトリーの使用は、この6を達成しますが、のみ、次の抗原誘発クローン増殖を発見したエピトープ特異的T細胞の高頻度の個体群の検出に限定されています。このプロトコルでは、pMHC複合テトラマーの使用を調整する方法を説明し、マグネチック細胞濃縮技術は、マウスリンパ組織3,7から超低周波エピトープ特異的T細胞の検出を可能にします。この手法では、1は、包括的に免疫応答の全ての段階で、マウスにおける内因性T細胞の全体のエピトープ特異的集団を追跡することができます。
プロトコル
1。リンパ組織からの細胞の単離
- の小さな正方形を含む60mmの培養皿に、氷冷cEHAA（EHAA +10％FBS、ペニシリン/ストレプトマイシン、ゲンタマイシン、2mM L-グルタミン、55 mM 2 - メルカプトエタノール）または他の同等のT細胞培地1mlを追加氷の上に100μmのナイロンメッシュと場所。
- マウスを安楽死させる。
- 脾臓、できるだけ多くの簡単にアクセスできるリンパ節を切除する。これらは少なくとも鼠径部、腋窩、上腕、頸部、および腸間膜リンパ節を含める必要があります。培養皿にナイロンメッシュの上に置きます。
- ナイロンメッシュ上のリンパ組織はリンパ球を解放するために、閉じた1.5 mlのマイクロチューブのフラットトップを使って、 優しくマッシュ。懸濁液中に細胞を動作するように上下cEHAAとピペットの別の1ミリリットルを追加します。 15 mlのポリプロピレン製遠心分離管の上に配置されたナイロンメッシュの別の部分を介して細胞を移す。氷冷cEHAA、POの別の1ミリリットルと皿とメッシュをすすぐ同じチューブにボリュームをoling。 4ミリリットルの最終細胞懸濁液の容積を達成するために繰り返します。
- 15ミリリットルの最終容量に冷たいソーター酸緩衝液（PBS + 2％FBS、0.05％アジ化ナトリウム）を追加し、300×gで5分間遠心分離管を、4℃
- 慎重に液体が滴がチューブの....
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結果
図2は、以前に関連するペプチド+ CFAで免疫したマウスについての代表的なデータを示しながら、 図1は 、ナイーブマウスからpMHCIIテトラマー濃縮脾臓及びリンパ節試料の代表的なフローサイトメトリープロットを描いている。シリアル·ゲーティングは、CD4の分析+ T細胞集団からの自家蛍光およびその他の不要なイベントを削除します。 CD8 + T細胞集団は、CD4のpMHCIIテトラマー染色+ T細胞のための有用な内部ネガティブコントロールとして機能します。ゲーティングはより難しくなり、濃縮から結合画分は、通常、非結合分画より自家細胞の有意に高い割合を含んでいることに注意してください。
ビーズ計数分析から決定するように、試料中のエピトープ特異的T細胞の絶対数は決定要因として、テトラマー+はこれらの細胞の割合は、濃縮されたサンプルの結合分画内のすべてのセルの合計数を乗じて算出しています細胞染色分析（ボックス1）からNED。
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ディスカッション
このプロトコルによって提示pMHC複合テトラマー基づく細胞濃縮法は、内因性のT細胞レパートリーからエピトープ特異的T細胞を研究するための強力なツールです。 pMHC複合テトラマーの使用は、同族のpMHC複合リガンドと結合するTCRの能力に直接基づくエピトープ特異的T細胞の検出を可能にします。濃縮は、抗原特異的T細胞の非常にまれな集団が彼らの遺伝子構造または前駆周波数の任意の操作なしで、T細胞の内因性レパートリーから検出することができるように感度のレベルを提供します。結果として、この手法は、調査員が直接、免疫応答の全ての段階を通じて、素朴なレベルから in vivo実験系からの内因性抗原特異的T細胞集団を追跡することができます。
このプロトコルは、二次リンパ器官からのエピトープ特異的CD4 + T細胞を濃縮するpMHC複合クラスII（pMHCII）四量体の使用に最適化されていマウスのだ。しかしながら、この技術はまた、pMHC複合クラスI（pMHCI）テトラマーおよびCD8 + T細胞9に適用可能である。 CD4とは異なり、CD.......
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開示事項
特別な利害関係は宣言されません。
謝辞
著者らは、このプロトコルの開発で助けジェンキンスラボのアンドレ漢とローレンス·イェン技術上の支援のため、メンバーに感謝したいと思います。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 試薬ベンダーカタログ番号 | |||
| PEまたはAPCの共役pMHC複合テトラマー（またはマルチマー） | NIHのテトラマーコアから得られた、研究者によって作られた、または商業的供給源から購入 | ||
| アンチPE結合磁性マイクロビーズ | ミルテニー | 130-048-801 | |
| アンチAPC共役磁性マイクロビーズ | ミルテニー | 130-090-855 | |
| LS磁気列 | ミルテニー | 130-042-401 | |
| MidiMACSまたはQuadroMACS磁石 | ミルテニー | 130-042-302または130-090-976 | |
| 細胞計数ビーズ | ライフテクノロジーズ | PCB-100 |
参考文献
- Knutson, K. L., dela Rosa, C., Disis, M. L. Laboratory analysis of T-cell immunity. Front Biosci. 11, 1932-1944 (2006).
- Kearney, E. R., Pape, K. A., Loh, D. Y., Jenkins, M. K. Visualization of peptide-specific T cell immunity and peripheral tolerance induction in vivo. Immunity....
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再版と許可
