遺伝子発現とE4orf4誘発細胞死にノックダウン効果の測定のための条件付きノックダウン細胞株の作製

Summary

E4orf4誘導細胞死へのACFのクロマチンリモデリング因子の寄与を測定した。プロトコルはドキシサイクリン治療がACFユニットAcf1とSNF2hの条件付きノックダウンを誘導し、誘導細胞株でE4orf4誘導される細胞死を測定するためのDAPIアッセイを使用した細胞クローンの選択が含まれています。

Abstract

哺乳動物細胞における遺伝子発現の機能的不活性化は、様々な経路^1,2に、目的のタンパク質の寄与の研究にとって極めて重要である。構成的なノックダウンが時間^3月5日の長い期間のための細胞によって許容されていない場合しかし、遺伝子発現のノックダウン条件は場合に必要です。ここでは、ACFのクロマチンリモデリング因子のサブユニットの条件付きノックダウンを可能にする細胞株を調製するためのプロトコルを記述します。これらの細胞株は、アデノウイルスE4orf4タンパク質⁶による細胞死の誘導へのACFの寄与の決定を容易にする。 ACFのクロマチンリモデリング因子のAcf1とSNF2hサブユニットに対する短いヘアピンRNAをコードする配列はまた、ネオマイシン耐性遺伝子の遺伝子を含むプラスミドでドキシサイクリン誘導性プロモーターの隣にクローン化した。ネオマイシン耐性細胞クローンは、G418と孤立の存在下で選択した。得られた細胞ラインはによって誘発されたドキシサイクリン治療は、一度Acf1またはSNF2h発現レベルが低下した、細胞をコードするプラスミドE4orf4または空ベクターでトランスフェクトした。 shRNAコンストラクトの具体的な効果を確認するために、Acf1またはSNF2hタンパク質レベルはサイレント変異を導入することにより、shRNAのに耐性がレンダリングされた発現プラスミドAcf1またはSNF2hと共トランスフェクションすることにより、WTのレベルに復元されました。様々な試料に細胞死を誘導するE4orf4の能力は、トランスフェクトされた細胞集団におけるアポトーシスの形態を有する核の出現頻度が^7-9を測定されたDAPIのアッセイによって決定した。

構成的なノックダウン細胞が致死であるかもしれない場合、ここで説明プロトコルは場合に限り、そのタンパク質パートナーによる細胞死の誘導に種々のタンパク質の機能的貢献の決定に利用することができる。

Protocol

1。誘導性細胞株の作製

1. 実験1の前に、目的の細胞株の調製のために使用されるすべての細胞を死滅させる薬剤G418の最小濃度を見つける必要があります。この目的のために、プレートの実験中に使用し、G418の濃度を増加させ（ml当たり0〜1,000μg）を追加する培地中でコンフルエント70％でいくつか重複してプレートで選択したセル。効率的に細胞を死滅させる最小限のG418濃度を決定するために、毎日細胞を監視します。細胞死は3-7日以内に観察される。
2. それはshRNAを発現するプラスミドは研究対象の遺伝子のある程度式に減らすことができることを一過性トランスフェクションアッセイによって確認することが推奨された細胞株の世代の前に。これは、効率的にトランスフェクトすることができる任意のセルラインで行うことができる。
3. プレート10パーセントテトSYを含むDMEM培地（8mlに10cmプレートあたり約^{5×10 6}細胞の密度でT-REX-293細胞ステムが承認したFBS、2mM L-グルタミン、mlペニシリンおよびストレプトマイシンあたり0.1mg、ミリリットルブラストあたり5μg当たり100単位）。 37℃で一晩プレート℃、5％CO ₂でインキュベート_する 。
4. 翌日、トランスフェクションの前に8ミリリットル新鮮な培地に変更します。
5. テトラサイクリン誘導性H1プロモーター、ならびにGFPと融合およ....

Discussion

特定の遺伝子発現のノックダウンは調節経路へのタンパク質の寄与の捜査に重要なアプローチである。必須遺伝子の発現の構成的なノックダウンが否定的に細胞増殖に影響を与えるので、それらの研究では、一時的なsiRNAの導入や安定した条件付きノックダウンシステムのアプリケーションのいずれかを必要とするかもしれません。ここで説明するshRNAの薬物誘発性の発現のための容量を持つ安定な細胞株の生成は、多くの細胞株では効率的ではありません一過性のトランスフェクションを上回る利点を提供し、繰り返しの準備が必要となるウイルスの使用上、時には追加の短期用語選択。一度生成された細胞株は、追加の準備を必要としません。さらに、我々の手の中に、shRNAコンストラクトの一過性トランスフェクションは、選択された細胞株でのshRNA発現の誘導に比べてはるかに少ない効率的な遺伝子発現をノックダウンすることであった。これはお勧めですedはしかし薬物誘発性ノックダウン効率的なままであることを各実験で確かめること。遺伝子発現のノックダウン条件のための安定した細胞株の使用の潜在的な欠点は、潜在的に実験の結果に影響を及ぼす可能性が選定の過程で追加の変更を取得しているかもしれないというこ.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
試薬の名称	会社	カタログ番号	コメント（オプション）
高グルコースDMEM	ギブコ	41965
TETシステムが承認したFBS	クロンテック	631106
L-グルタミン酸	ギブコ	25030
ペンのStrep	ギブコ	15140
0.25％トリプシン-EDTA	ギブコ	25200
T-REX-293細胞	インビトロジェン	R710-07
G418	シグマ	A1720
ブラストサイジン	Invitロゲン	R210-01
プラスミドpSuperior.neo + GFP	OligoEngine	VEC-PBS-0007/0008
jetPIE	Polyplusトランスフェクション	101から40
ドキシサイクリン	シグマ	D9891
パラホルムアルデヒド	電子顕微鏡学	15710
4 '、6 - ジアミジノ-2 - フェニルインドール（DAPI）	シグマ	D9542
Fluoromount™を-G	SouthernBiotech	0100から01