このコンテンツを表示するには、JoVEへの購読が必要です。 または、無料トライアルをお申し込みください。

方法論記事

の長期嗅覚順応の分子読み出し

10.1K 回視聴

⸱

DOI:

10.3791/4443

⸱

2012年12月22日

 ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences and Institute for Neuroscience, George Washington University, 2Fred Hutchinson Cancer Research Center, 3Department of Cell and Tissue Biology, University of California San Francisco

この記事について

サマリー

ここでは、の長期的な嗅覚順応の分子読み出しを記述線虫（Caenorhabditis elegans）。プロテインキナーゼGは、EGL-4は、AWCと呼ばれる一次感覚ニューロン対における安定的な適応反応のために必要である。細胞質から核へのAWCのEGL-4転位長引く臭気露光中。

要約

持続的な刺激中に最も感覚ニューロンは信号に対する感度を減少させることによってその応答を適応させます。適応応答は、形状の注目を助け、また過剰刺激から細胞を保護する。 Cの嗅覚回路内の適応虫は最初コルベールとBargmann 1,2によって記述されていた。ここでは、著者らはAmphidウィング細胞タイプC（AWC）感覚ニューロンによって感知された揮発性の臭いに適応する能力に欠陥のある突然変異体を単離するために遺伝学的スクリーニングを設計するために使用される嗅覚順応パラダイムのパラメータを定義しました。ときに野生で虫動物は 、彼らが臭いに対する応答性を修正します30分間魅力AWC-感知臭気3に晒されており、その後約1時間、走化性行動アッセイにおける適応臭気を無視します。ときに野生で虫動物は 、彼らがしてACの適応臭気を無視します〜1時間のための魅力的なAWC-感知臭気にさらされている〜3時間hemotaxis行動アッセイ。 Cの嗅覚順応のこれらの2つの段階エレガンスは 、短期嗅覚順応（30分臭暴露後に誘導される）、および長期的な嗅覚順応（60分臭暴露後に誘導される）として記載した。後でレト ​​ワールらから作業、4 AWCニューロンにおける短期および長期の嗅覚順応の両方に必要ですEGL-4と呼ばれるプロテインキナーゼG（PKG）を発見した。 EGL-4蛋白質は、長期的な嗅覚順応応答のため必要であるが、AWC 4短期嗅覚順応応答に必須である核局在化配列を含んでいます。緑色蛍光タンパク質をタグ付けEGL-4によって、それが長引く臭気露光時AWCにEGL-4の局在を可視化することが可能であった。 EGL-4（GFP :: EGL-4）分子この完全に機能的なGFPタグを使用して、我々はAWC 5の長期的嗅覚順応の分子読み出しを開発することができました。このmを使用嗅覚順応のolecular読み出しは、我々はAWC 6,7でGFPの欠陥のある細胞内局在パターン:: EGL-4を示す変異動物を識別するために、両方の順方向と逆方向の遺伝子スクリーニングを行うことができました。ここでは説明し、GFPの1）建設:: EGL-4発現する動物、2）長期的な臭気誘起核移行アッセイのための動物の栽培のためのプロトコルであり、長期的な臭気誘発性の3）のスコア核移行イベントや核GFP :: EGL-4の状態からリカバリー（再感作）。

プロトコル

1。 GFPの建設は、EGL-4発現する動物タグ付き

  1. （p）はODR-3 :: GFP :: EGL-4：ODR-3遺伝子（直接上流開始コドンの使用は2678 bp）のためのプロモーター下で翻訳融合GFP :: EGL-4のクローンを作成します。 ODR-3プロモータードライブamphidニューロン対における表現：AWA、AWB、AWC、そして弱くASHインチ
  2. （p）はOFM-1：標準的な生殖細胞形質転換技術8を使用して共射出マーカーと50 ng /μlにで野生型（N2）を動物にプラスミド（p）のODR-3 :: GFP :: EGL-4を注入： ：GFP 9（25 ng /μlに）、および（p）ODR-1 :: DsRedを10（25 ng /μlに）。 AWCとAWB amphidニューロンペアでODR-1プロモータードライブ式、coelomocytesでOFM-1プロモータードライブ式。
  3. 紫外線（UV）/トリメチル（TMP）を統合プロトコルにステップ1.2で詳述体外配列を発現するトランスジェニック動物を施す11。
  4. 漂白剤は、動物12を同期させ、OP50 Eを含む線虫の成長メディア（NGM）プレート上でそれらを養うL4ステージに大腸菌 。 OP50 E.を削除するには、M9のバッファーでNGMプレートからL4の動物を洗う大腸菌 。
  5. M9のバッファを削除し、1.5 mlのマイクロチューブにワームペレットに30μg/ mlのTMP作業溶液の50から100μlを添加する。周囲の光を遮断し、ホイルで包まれた1.5 mlマイクロチューブ中で15分間、ローテーターを軽く攪拌するためにホイルで1.5 mlマイクロチューブを巻き付けます。大型非シードのNGMプレートにTMP /ワーム溶液中でワームを転送します。
  6. Stratalinker 2400を使用して、UV 350μJ（X100）にNGMプレート上にワームを公開します。その後OP50含むNGMプレートにワームを追加し、5時間、暗所でインキュベートする。
  7. 約10シードプレート（2-5ワーム各プレート）〜50ジェニックワームを選ぶ。転送P0は新しいプレートに3日ごとに24時間です。
  8. 250クローンF1をピックnimals（プレートあたり1匹）。各F1のプレート2から4 F2動物をクローンします。 OFM-1（P）を見て、100％の送電線を探すためにF3の動物をチェック::解剖蛍光顕微鏡下でGFPの発現パターン。
  9. 異系交配野生のN2動物5回で最終的な統合された行（複数可）。我々はpyIs500として最終統合ラインを参照して、GFPなどのGFPタグEGL-4分子:: EGL-4になります。

2。核移行アッセイのための動物の栽培とメンテナンス

  1. OP50 Eで°標準10cmのNGMプレート上のC（レシピは下記を参照）シード25でpyIs500動物を養う大腸菌 13（ 図1）。
  2. 1日目に、5つの別々の10センチメートルOP50 E.上に25℃で培養プレート四から五L4 pyIs500動物°Cを選ぶ大腸菌シードプレートとインキュベート（25℃）（、プレートあたり4から5 L4の動物である）。
  3. 4日目、成人pを洗うS-基底バッファを使用して大規模のNGMプレートオフpyIs500動物のopulations（レシピは下記参照）。彼らはプラスチック製のピペットチップの側面に固執するように、動物を転送するために使い捨てガラスピペットを使用しています。

3。長期的な臭気誘起核移行アッセイ

  1. 細菌を除去するために、S-基底でpyIs500動物3回洗浄する。洗浄の間動物を遠心しないでください、むしろ動物が静止した1.5​​ mlのマイクロチューブに重力によって沈降することができます。これは、すべての細菌が除去されていることを確認するのが重要であり、残留細菌がマイナスに転座アッセイの結果に影響を与えるとして、NGMのパテが汚染されていること。また、1.5 mlのマイクロチューブをオートクレーブすると両側に固執する動物を引き起こすなど非オートクレーブした1.5​​ mlのマイクロチューブを使用し、管の内壁に "スティッキー"プロパティを生成することを発見した。
  2. 動物が洗浄の間に沈降しているが、トンを作る彼は適応ソリューションを提供します。シリンダーを卒業100mlに、S-基底緩衝液100mlを追加します。 S-基底に適応臭気を追加し、パラフィルムのストリップを使用して、シリンダーを密閉する。ベンズアルデヒドの適応を行っている場合はブタノン適応がS-基底100mlに2 butaoneの11μlを加えるためには、S-基底100mlにベンズアルデヒド7.5μlを添加する。ゆっくり（振らない）均一なエマルジョンを作成するために、S-基礎と匂いの30倍を含む卒業シリンダーを反転させる。
  3. S-基底で最後の洗浄の後、動物はすべての液体を解決し、削除することができます。ラベル1管 "+ VE"や "適応"と他のチューブ "-VE"または "unadapt"。その後、適応のマイクロ遠心チューブ（+ VE）に適応ミックスの1ミリリットルを追加して、原文のまま制御のマイクロ遠心チューブ（-VE）にS-基底の1 mlを加える。各チューブに100と200の間に動物の数を維持しようとします。いくつかの練習で、それは目でペレットの動物のおおよその数を推定することが可能である。
  4. 1.5ミリリットルマイクロチューブキャッププロテクターを配置各チューブ（オープン飛び出るから蓋を防ぐ）へと80分間ローテーターにチューブを置きます。我々は60分および80分の間に臭気暴露は、同様の結果を（長期的な適応反応の両方の結果）が得られることを見出した。しかし、80分の露出は、私たちの手でより一貫性のある結果を提供します。したがって、すべての当社の長期的な適応アッセイは80分臭露出（ 図2）を用いて標準化されています。
  5. 80分後、S-基底で動物を3回洗う。動物は、各洗浄の間に重力によって沈降することができます。

4。短期的な臭気誘起核移行アッセイ

  1. 短期的な臭気の適応の場合には、長期的な臭気誘発性転座検定法（ステップ3.1から3.4）あたりと同じプロトコルを使用して、しかしその代わりに80分間匂いを適応にpyIs500動物をインキュベートすること、30分露出を使用。以下に概説する臭気誘起核移行アッセイの定量化（ステップ5）長期と短期のTERでも同じですm個のエクスポージャー。

5。臭気誘起核移行イベントを記録

  1. のdH 2 0でゲル電気泳動アガロースを溶解させることにより5 mMのアジ化ナトリウム（NaN 3を ）を含む2％アガロースパッドを作る。ガラス顕微鏡スライド上にNaN 3を含む溶融アガロースの一滴を置きます。直ちに溶融アガロースのドロップをフラット化して最初のスライドに別のガラス顕微鏡スライドを配置します。 30秒間のままにして、穏やかに顕微鏡が約1mmのフラットアガロースパッドで1顕微鏡スライドを残してスライドして離れていじめる。
  2. S-基底で最後の洗浄の後、ワームは1.5 mlマイクロチューブに定住し、すべての液体を除去することができます。その後、いくつかの顕微鏡スライドのアガロースパッド上に滴下動物を追加します。これは、50と100の間にスライドあたりの動物の数を保つことが重要です。スライドごとにあまりにも多くの動物が得点を複雑にし、多くの場合、青色励起後の散乱グローを作成します。余分な液体かもしれないキムワイプ小を使用してアガロースパッドから邪悪なる。パッドの上に0.5ミリメートルのガラスカバースリップを置き、動物を固定するためのNaN 3を可能にするために2分間放置する。ノートは、動物を得点された後はスライドから回収することができる。 M9バッファのドロップに播種するNGMプレートに移した場合の動物は約1時間後にNaN 3を麻酔から回復します。
  3. この時点では、各実験者がスライドは実験的（+ VE）をスライドで、どのスライドコントロール（-VE）のスライドであり、盲目的にGFPを獲得します、別の人にスライドを渡すかを追跡するためにキーを工夫することが不可欠です： EGL-4の局在パターン。これは、任意の実験者バイアスを制御します。
  4. 、10X 40Xと63X倍率の目標とGFP / RFPのフィルタを使用して直立蛍光顕微鏡を使用して、スライドごとに50〜100の動物の間に得点。まず、明視野照明を使用して倍率10倍の下に動物を探します。第二に、brighをオフにすることで、AWCニューロンを見つけT-視野照明とRFPフィルタを使用しています。 （p）はODR-1 :: AWBとAWCニューロンにおけるDsRedのドライブ式。形状が小さく、円形であるAWBの細胞体（ 図2）と比較してAWCニューロンは独特の楕円形の細胞体を持っています。
  5. AWCの細胞体が置かれた後、GFPフィルターに切り替えるとGFPの局在記録：核または細胞質などEGL-4。カウンタを使用すると、実験者がスライドを記録しながら接眼レンズに探し続けることができます。注：ステップ5.1から5.5までは、統計的に有意なデータを（ 図1-2）を生成するために別の日に少なくとも3回繰り返される。

6。モニタリング長期臭気適応からの復旧時に、EGL-4 GFPタグ

  1. ステップ3.5の後、時点ゼロでAWCで複数のアリコートと核対細胞質GFPのスコア:: EGL-4にpyIs500動物の個体数を割る（つまり80分の曝露後に、です）とmultipleその後の時点（図3）。
  2. NGMプレート上に使い捨てガラスピペットを用いて、制御（-VE）と実験（+ VE）動物の両方を転送します。
  3. 動物は、GFPの局在を時間のさまざまな長さのために回収し、再検討することができます:: EGL-4インチのAWC各時点でのステップ5.5から5.1のように。

7。材料

NGMプレート：; 3グラムの塩化ナトリウム（NaCl）、2.5グラムのバクト-ペプトン21グラムバクト寒天：1 Lに対して1Lの蒸留H 2 0に追加します。オートクレーブメディア。温度が54℃を読み取っオートクレーブ、涼しい寒天後まで、1ミリリットルの1M硫酸マグネシウム（MgSO 4）、1ミリリットルの1M塩化カルシウム（CaCl 2）、エタノール中で1ミリリットルコレステロール（5 mg / mlストック）を25ml 1Mリン酸カリウム緩衝液：次の解決策を追加します。

1Mの二塩基K 2 HPO 4 174.2グラム/モル：500ミリリットルの場合：400ミリリットルのddH 2 Oに溶解、87.1グラムDibasiC、K 2 HPO 4。蒸留H 2 Oで500 Lに音量を調整する500ミリリットル滅菌フィルターユニットを使用して滅菌するフィルタリング。

1Mの一塩基のKH 2 PO 4 136.1グラム/モル：1リットルの場合：800ミリリットル蒸留H 2 Oで、136.1グラム一塩基のKH 2 PO 4を溶かす。蒸留H 2 Oで1Lに音量を調整する500ミリリットル滅菌フィルターユニットを使用して滅菌するフィルタリング。

1Mリン酸カリウム（K 3 PO 4）緩衝液（pH6.0）：1 Lの場合：1リットルの滅菌フィルターユニットで、1 Mの一塩基のKH 2 PO 4の868ミリリットルを追加します。ユニットが通ってフィルタリングすることができ、その後、1M二塩基K 2 HPO 4の132ミリリットルを追加します。ユニットはすべての液体をフィルタリングすることができます。フィルターユニットを取り外して、pHを6.0に調整する。室温で保管してください。

S-基礎：1リットルの場合：50ミリリットル1M、K 3 PO 4緩衝液を加え、pH約6.0であり、20ミリリットル5M NaCl 水溶液 。で1Lにフィル蒸留H 2 Oソリューションをオートクレーブ。

M9：3グラムのKH 2 PO 4、6グラムのNa 2 HPO 4、5gのNaCl、1ミリリットルの1MのMgSO 4、H 2 O：1 Lに対して蒸留H 2 0で1Lに記入してください。オートクレーブで滅菌する。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

結果

GFPの局在パターンの例:: EGL-4インチAWC長引く臭気暴露前後が図2に示されている。長引く臭気暴露、GFP :: EGL-4より前はAWC（図2B）の細胞質に局在しており、80分後に臭気暴露GFP :: EGL-4はAWC（図2D）の核に局在している。行動レベルでは、細胞質GFP :: EGL-4でAWCを持つ動物は、匂いの点光源（ -走化インデックス3が 1に近い（注） 図2Cは、原文のまま動物の走化性アッセイからの代表的な結果をグラフ）に魅了されています。 AWCに核GFP :: EGL-4を示す動物は適応臭い（ -走化指数はゼロに近い注意適応動物の走化性アッセイから図2Eグラフの代表的な結果）の点光源に誘引されていません。臭気誘起核転座アッセイからの統計学的に有意なデータを生成するには、実験は少なくとも3回、別々の日にを実行する必要があります。走化性アッセイの詳細な説明については、記事2490年14 J...

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

ディスカッション

GFPタグEGL-4分子の匂いに誘発される核のエントリは、ここで説明すると、Cの嗅覚順応の強固な分子読み出しを提供エレガンス 。臭気誘起核移行アッセイは簡単で、準備時間のわずか数日を必要とします。我々はこれらのアッセイのために構築されていることpyIs500動物は、AWCニューロンと同様に発現しているGFPタグEGL-4タンパク質を照らすマーカーを発現する。従って、我々はニューロンのこのクラスでの作業経験がないにはほとんど使って実験者が非常に急速に（おそらく数十の動物を検査した後）は、核対細胞質のEGL-4の正しいセルおよび採点を識別快適に感じるように開始できることを感じています。読者がCで GFPの分析を説明記事835 JOVEを参照してくださいすることが役に立つかもしれません虫 15。

生成されたデータは、最高品質であることを確実にするためには、次のガイドラインに従うことをお勧め：1）すべてのスコアリングはやみくもに行うべきである、2）汚染の痕跡を...

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

開示事項

特別な利害関係は宣言されません。

謝辞

我々は、この原稿を注意深く読むためにスコット·ハミルトン、そしてオハロランラボのメンバーに感謝したいと思います。我々はまた、優れた提案と洞察に満ちたコメントのための私達の匿名の校閲者に感謝します。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
試薬の名称 会社 カタログ番号 注釈
バクト寒天ディフコ DF0140-07-4 NGMプレート
塩化ナトリウムフィッシャーケミカル S671-10 NGMプレート
バクトペプトンディフコ DF0118-07から2 NGMプレート
リン酸二カリウムフィッシャーケミカル S375-500 S-基底バッファおよびNGMプレート
リン酸二水素カリウムフィッシャーケミカル P285-500 S-基底バッファおよびNGMプレート
キムワイプ - スモールキンバリークラーク LS2770
エタノール100パーセントゴールドシールドケミカル株式会社 43196-115 走化性アッセイ用希釈臭い
塩化カルシウムシグマアルドリッチ C8106-500G NGMプレート
硫酸マグネシウム MPバイオメディカル 150136-500G NGMプレート
アジ化ナトリウム99パーセントフィッシャー·サイエンティフィック ICN10289180 麻酔薬
アガロース - 純インビトロジェン 16500-500 アガロースパッド
ベンズアルデヒドシグマアルドリッチ B1334-100G AWC臭気
ブタノン、ACSグレードシグマアルドリッチ 360473-500ML AWC臭気
微量遠心チューブ - 1.5ミリリットル着色デンヴィル LS8147
パスツールピペット使い捨てガラス5-3/4 " フィッシャー·サイエンティフィック 13から678-20B
Stratalinker ストラタジーン Stratalinker 2400 紫外線統合
フィルタ真空ボトル - 500ミリリットルナルゲン 09から740-25B

参考文献

  1. Colbert, H. A., Bargmann, C. I. Odorant-specific adaptation pathways generate olfactory plasticity in C. elegans. Neuron. 14 (4), 803(1995).
  2. Colbert, H. A., Bargmann, C. I. Environmental signals modulate olfactory acuity, discrimination, and memory in Caenorhabditis elegans. Learning and Memory. 4 (2), 179(1997).
  3. Bargmann, C. I., et al. Odorant-selective genes and neurons mediate olfaction in C. elegans. Neuron. 74 (3), 515(1993).
  4. L'Etoile, N. D., et al. The cyclic GMP-dependent protein kinase EGL-4 regulates olfactory adaptation in C. elegans. Neuron. 36, 1079-10 (2002).
  5. Lee, J. I., et al. Nuclear entry of a cGMP-dependent kinase converts transient into long-lasting olfactory adaptation. PNAS. 107 (13), 6016(2010).
  6. O'Halloran, D. M., et al. Regulators of AWC-mediated olfactory plasticity in Caenorhabditis elegans. PLoS Genetics. 5 (12), e1000761(2009).
  7. O'Halloran, D. M., et al. Changes in cGMP levels affect the localization of EGL-4 in AWC in Caenorhabditis elegans. PLoS ONE. 7 (2), e31614(2012).
  8. Mello, C. C., et al. Efficient gene transfer in C.elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences. EMBO Journal. 10, 3959-39 (1991).
  9. Miyabayashi, T., et al. Expression and function of members of a divergent nuclear receptor family in Caenorhabditis elegans. Dev. Biol. 215, 314(1999).
  10. L'Etoile, N. D., Bargmann, C. I. Olfaction and odor discrimination are mediated by the C. elegans guanylyl cyclase ODR-1. Neuron. 25 (3), 575(2000).
  11. Mello, C., Fire, A. DNA transformation. Methods Cell Biol. 48, 451(1995).
  12. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. Wormbook. , (2006).
  13. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77 (1), 71(1974).
  14. Kauffman, A., Parsons, L., Stein, G., Wills, A., Kaletsky, R., Murphy, C. C. elegans Positive Butanone Learning, Short-term, and Long-term Associative Memory Assays. J. Vis. Exp. (49), e2490(2011).
  15. Berkowitz, L. A., Hamamichi, S., Knight, A. L., Harrington, A. J., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Application of a C. elegans Dopamine Neuron Degeneration Assay for the Validation of Potential Parkinson's Disease Genes. J. Vis. Exp. (17), e835(2008).
  16. Pittenger, C., Kandel, E. R. In search of general mechanisms for long-lasting plasticity: Aplysia and the hippocampus. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 358 (1432), 757(2003).

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

再版と許可

タグ

AWC GFP G
の長期嗅覚順応の分子読み出し
お問い合わせ
図書館に推薦する

プライバシー

利用規約

ポリシー

著作権 © 2026 MyJoVE Corporation. 無断転載を禁じます。