クッパー胞における遺伝子機能と繊毛発生する流体の流れの可視化の分析

Summary

クッパー胞の繊毛で生成された流体の流れ（KV）はゼブラフィッシュ胚の左右パターン形成を制御します。ここでは、KVの細胞に特異的に遺伝子の機能を調節するための手法について説明します。また、流体の流れを可視化するためにKVに蛍光ビーズを提供する方法を示しています。

Abstract

例えば、心臓、脳、腸などの内臓が正常な機能にとって重要である¹左右（LR）非対称性を開発しています。運動性繊毛はLRの確立に関与しているマウス、カエル、ゼブラフィッシュ^2月6日を含む、脊椎動物の胚の非対称性。これらの'のLR繊毛は'器官^7を開発するためのLRパターニング情報を提供すると考えられている左側側板中胚葉、内カスケードのシグナル伝達に保存された非対称節点（TGF-βスーパーファミリー）をトリガすることが必要である非対称の流体の流れを生成します。このように、LRのパターニングのメカニズムを理解するためには、それはLR繊毛細胞の組織、LRの繊毛の運動性と長さと堅牢な非対称フローを生成する能力を制御する遺伝子を同定することが不可欠である。

ゼブラフィッシュ胚に、LR繊毛でクッパー胞^{（KV）2,4,5}に配置されています。 KVはmonociliated上皮細胞の単層で構成されていますそれは液体で満たされた腔を囲みます。運命のマッピングはKVが被包ステージ^8,9の間に背の胚盤葉縁に移行背先駆細胞（DFCが）として知られている〜20から30細胞群に由来することが示されている。初期の体節の段階では、DFCは、クラスタと繊毛上皮細胞への分化は、胚^10,11の尾芽にKVを形成する。ゼブラフィッシュの光学的透明性と迅速な開発とDFCはインの組み合わせを特定して追跡する能力ゼブラKV LR繊毛細胞を研究するための優れたモデル系胚作る。

興味深いことに、DFC / KV細胞系列の前駆細胞は卵黄細胞と2 HPF ⁸後の近い他の胚細胞の間に細胞質の橋のに対し、最大4時間、受精後（HPF）に卵黄細胞の間に細胞質の橋を保持します。これらの細胞質の橋を生かし、我々は、モルホリノoligonucleを提供するためにステージ固有の注射戦略を策定DFCは、ノックダウン、これらのセル¹²における標的遺伝子の機能にもっぱらotides（MO）。この手法は、遺伝子の機能が野生型胚の文脈で発展DFC / KV系統でノックダウンさせたキメラ胚を作成します。 KVにおける不斉の流体の流れを分析するために、我々は、KVルーメンとビデオ顕微鏡^2を使用^してレコードビーズ運動に蛍光マイクロビーズを注入します。流体の流れを簡単に可視化され、時間をかけてビーズの変位を追跡することにより定​​量することができる。

ここでは、ステージ固有のDFC-標的遺伝子ノックダウン技術と流れを可視化するためのKVへの蛍光ビーズの注入を使用して、我々は、KVの発達と機能の間の特定の遺伝子の役割を特徴付けるための効果的なアプローチを提供するプロトコルを提案する。

Protocol

ステージ固有のゼブラフィッシュ胚注射の概要

標的mRNAに結合し、その転写物からのタンパク質発現を破壊アンチセンスモルフォリノオリゴヌクレオチド（MO）は、広く研究がゼブラフィッシュ^13,14で（機能喪失型）遺伝子のノックダウンで使用されています。遺伝子ツールは、LLCは、蛍光顕微鏡を用いて注入胚でMOを検出するためにカルボキシフルオレセイン（緑色の蛍光を発する）またはリサミン（赤色蛍光を発する）のいずれかでタグ付けされたMOを提供しています。ゼブラフィッシュの開発のさまざまな段階で卵黄セルにMOを注入することによって、それは、胚の特定の区画（ 図1A-F）にMOを提供するのは可能です。 1から4細胞の段階（0-1 HPF）との間で卵黄に注入されたMOは、グローバルなノックダウンを容易にするために、32細胞期^15日まで存続する卵黄との接続を介してすべての胚細胞（ 図1A、D、D '）に入ります。 MOはmidblast中に卵黄に注入ULAステージは（2.5から3 HPF）他のほとんどの胚細胞系譜を入力せずに、DFC / KV細胞系統¹²に特異的に細胞質の橋⁸およびノックダウン遺伝子機能を通じてそうDFCの前駆細胞（ 図1B、E、E '）を入力する<....

Results

ステージ固有のMO注入胚の特定区画における遺伝子機能を解析する上で有効なアプローチを提供します。 図1は、DFC / KV細胞における遺伝子機能をテストするために、流体の流れを可視化する蛍光ビーズを導入する方法使用済みの注射戦略のフローチャートを提示KVインチ成功した段階特異注入胚の蛍光MOの分布は、 図1D-Fに、 図2でライブ胚における模式的に示されている。ミズーリままで卵黄細胞に集約されている失敗したMO注入は、 図2Dに示されています。

成功裏に注入された蛍光の局在に基づく胚が選ばれ、MO-ができる流体の流れを分析するためにKVの内腔への蛍光ビーズを送達するための4から6体節の段階（ 図1G-H）でマウントすることができます。ビデオ顕微鏡はKVのビーズの動きを（ 図1I-J）は、記録するために使用され質的に分析した（ 図3A.......

Discussion

DFC / KV細胞系譜にMOをターゲットにステージ固有の注射を使用すると、遺伝子機能の細胞自律性を検討し、全体的な遺伝子ノックダウンによって引き起こされる多面的な表現型を回避するための有用なアプローチである。しかし、これらの注射は技術的に挑戦することができます。 1）MOは卵黄全体2）MOの拡散、注射部位で集計ままおよびDFC / KVセルまたは3に入る）MO：256セル、1,000細胞ステージ間のMOの注入は、3つの可能な結果を​​もたらすことができ卵黄を通して拡散およびDFC / KV細胞および他の胚細胞に入る。したがって、MOはDFC / KV細胞に排他的に移動した胚を選択すると、この実験の重要なステップです。それは、MOはすべてのDFC / KV細胞にロードできることに注意することは重要ですが、多くの場合、これらのセル¹⁰のサブセットのみを入力します。ターゲティングこのモザイクの根底にある理由は不明のままですが、卵黄および/またはINDの閉鎖の時期を通じて、いかに効率的にMOの動きの変動を反映しているかもしれない卵黄およびDFC前駆細胞の間ividual橋。我々は、条件を発見していないその増加は効率をタ.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
試薬/材料の名称	会社	カタログ番号
標準コントロールオリゴリサミンタグ付け	遺伝子ツール、LLC
カスタムRock2bモルホリノオリゴ	遺伝子ツール、LLC
Fluoresbrite Multifluorescent 0.5ミクロンのマイクロスフェア	ポリサイエンス社	24054