心臓組織工学のためのキャピラリーフォースリソグラフィ

Summary

このプロトコルでは、毛細管現象リソグラフィーを使用して、2つの異なる高分子材料から作られた生体模倣心細胞培養基質の作製を実演します。 記載されている方法は、in vitroおよびin vivoアプリケーション用の巨視的心臓組織の構造と機能を設計するためのスケーラブルで費用対効果の高い技術を提供します。

Abstract

心血管疾患は世界的に¹死亡の主要な原因である。心臓組織工学は、心臓再生だけでなく、in vitroスクリーニングアッセイのための機能的な組織を開発する目的で画期的な医療発見を実現するために多くの可能性を秘めています。しかしながら、心臓組織の高忠実度のモデルを作成することが困難であることが証明されている。心臓の細胞外マトリックス（ECM）は、マイクロナノメートルスケールの²に至るまでの生化学的および生体力学的信号の両方からなる複合構造体である。ローカル機械的負荷条件及び細胞-ECM相互作用は、最近、心臓組織工学^3-5の重要なコンポーネントとして認識されている。

心臓ECMの大部分は有意に組織構造および電気機械結合^に影響^を与える²ナノスケールの直径を有する整列されたコラーゲン繊維から構成されている。残念ながら、いくつかのメソッドは、HAVEナノメートルスケールまでECM繊維の組織を模倣することができた。ナノファブリケーション技術の最近の進歩は、しかし、心の^6-9でのECMのin vivoでの構造と基板の剛性の手がかりを模倣する、スケーラブルな足場の設計および製造を可能にした。

ここでは、の開発に存在する二つの再現可能な、費用対効果、および生体適合性ポリマーであるポリ（ラクチド-コ-グリコリド^{）（PLGA）8}およびポリウレタン（PU）系ポリマーを用いて心臓細胞の機能的な位置合わせのためのスケーラブルなナノパターニングプロセス。これらの異方nanofabricated基層（ANFS）はよく組織化、整列の組織の根本的なECMを模倣し、細胞の形態と機能^10から14にナノトポの役割を調査するために使用できます。

鋳型としてナノパターン（NP）シリコンマスターを使用して、ポリウレタンアクリレート（PUA）モールドが作製される。このPUAモールドは、その後、PAに使用されているそれぞれ、UV支援または溶媒媒介毛細管力リソグラフィー^{（CFL）、15,16}を経由して、PUまたはPLGAヒドロゲルをttern。簡潔には、PUまたはPLGAプレポリマーは、ドロップガラスカバースリップ上に分注し、PUAモールドを上に置くである。 UVアシストCFLの場合、PUは、次いで硬化させるためのUV照射（λ= 250〜400 nm）に露光される。溶媒媒介性CFLについては、PLGAを、熱（120℃）および圧力（100kPaで）を用いてエンボス加工される。硬化後、PUAモールドを細胞培養のためのANFS残して、剥離される。例えば、新生仔ラット心室筋細胞、ならびにヒト多能性幹細胞由来の心筋細胞のような初代細胞は、ANFS ²上に維持することができる。

Introduction

心血管疾患は、世界における罹患率および死亡率の主要な原因であり、すでに緊張した世界的な保健システム^1,17上の重い社会経済的な負担を提示する。 （1）in vitroでの薬物スクリーニングまたは疾患のモデリングのための心臓の高忠実度モデルを作成する虚血性疾患又は心筋症又は（2）の後に損傷した心筋を再生する：心臓組織工学は、2つの異なる目標を有している。

心臓は体に血液を供給するために常に働かなければならない複雑な器官である。心筋細胞および支持組織の密集した層構造は、心臓壁^18,19を通して螺旋パターンで配置されている。心臓はまた、電気機械的に効率的に本体²¹に血液を排出する高度に配位様式²⁰に結合される。自然の複雑なデザインを確実vitroでで要約することができる前に、いくつかの主要なハードルは、しかし、対処されていない。ロバストな心筋細胞分化方法²²開発され続けているが、まず、HPSC-CMはまだかなり未成熟表現型を示す。彼らの電気機械特性および形態は、最も密接に胎児のレベルを^23に一致する。従来の培養条件で維持さときに、第2、幹細胞由来の心筋細胞および一次両方は、天然、組織様構造に組み立てることができない。むしろ、細胞がランダムに配向となり、大人の心筋²⁴のバンド棒状の外観を示さない。

細胞が相互作用する細胞外マトリックス（ECM）環境では、多数の細胞プロセス^11,13,25において重要な役割を果たしている。 ECMは、細胞を有意に^6,26の構造及び機能に影響を与える複雑な、明確に定義された分子及び地形手がかりからなる。心の中では、携帯の位置合わせは、密接に、基礎となるナノメートルスケールのECM繊維^2に従います。これらnanotopographの影響細胞および組織の機能上のiCalの手がかりは、しかし、完全には理解遠くからである。ナノメートルスケール細胞生体材料の相互作用の予備的研究は、成長^31、接着^28〜30、27細胞^シグナル伝達のためにサブミクロン地形手がかりの潜在的な重要性と影響力を示し、分化^32,33。しかし、再現性のあるスケーラブルなnanofabricated基板を開発することが困難であるため、このような研究は、 生体内のECM環境での複合体のマルチスケール細胞効果を再現することができませんでした。このプロトコルでは、天然の心臓ECM繊維の配向を模倣する細胞培養足場を製造する簡単で費用効果の高いナノファブリケーション技術は、心筋細胞、生体材料の相互作用の新規な調査の広い範囲を可能にする、記載されている。心筋細胞は、ナノスケールのECM環境とどのように相互作用するか理解することは、より密接に模倣天然組織の機能に細胞挙動を制御する能力のために可能性がありますTiONから。さらに、細胞単層は、3D構造に比べて簡略化された実験系であるが、それでも洞察に満ちた調査と機能的スクリーニング^2,34-36ための複雑な多細胞挙動を示す。最後に、このような足場は、再生目的のために心臓³⁷内に埋め込 ​​まれた際の細胞移植片の機能を改善するために使用することができる。

Protocol

特に断りのない限り、全ての手順を室温（〜23℃）で行われる。

シリコンマスターの1。作製

1. O ₂ / N ₂ガ ​​ス下で100％エタノール、キシレン、ドライクリーンなシリコンウェーハ。
2. 0.3〜0.5ミクロン厚のフィルムを製造するために2000〜4000回転の回転速度でスピンコーターでシリコンウエハを置く。
3. フォトリソグラフィシステムを使用して、正しい寸法を有するパターンをフォトレジスト膜
4. 完全にフォトレジスト現像液の適切な量のパターン化されたフォトレジストでコーティングされたシリコンウエハを浸す。
5. 脱イオン水で現像されたフォトレジストでコーティングされたシリコンウエハーを洗浄します。
6. ほぼ垂直な側壁を有するサブミクロンスケールのリッジのアレイを形成するために、ディープ反応性イオンエッチング装置を用いて露出したシリコンをエッチングする。
7. プラズマアッシャーシステムにおいてシリコンウェハを配置することによって、残りのフォトレジストを除去する。
8. Wシリコンをカットその後のレプリカ成形に適したサイズのシリコンマスターズへのダイヤモンドが先端に付いたカッターでafers。

シリコン·マスターからのPUA型の2。作製

注：ナノファブリケーションのためのシリコンマスターに追加されるボリュームは、ポリウレタンアクリレート（PUA）溶液の粘度ならびに複製されるナノパターンマスタの面積に応じて変化する。

1. 100％エタノール又はO ₂ / N ₂ガ ​​ス下、キシレン、ドライクリーンなシリコンマスタ面。
2. シャーレにシ​​リコンマスターパターン側を上に置きます。
3. 2センチメートル×2センチメートル表面パターン、パターン面への不要と思われるアプリケーションのピペット40μlのシリコンマスターのため。
4. 4センチメートル注し、PUA上のX 4センチメートル透明なポリエステル（PET）フィルムのシートを配置します。
5. ダウンPETシートを押して、そのように（カードなど）ローラーまたはフラットエッジの表面を用いたパターン面を横切るシートの下に不要と思われるアプリケーションを広める全体パターンは、PUAプレポリマーで覆われている。
6. 50秒間約10cm 20ワット（115 V）のUV光（λ= 365 nm）を下回るシリコンマスター、プレポリマー、およびPETを配置します。効果的にするために、UV光の波長は310〜400nmの間の任意の場所とすることができる。光の強度は、基板表面の10〜15ミリワット/ cm ²である。
7. 硬化後、ピンセットでゆっくりとPETフィルムを除去します。 PUAは、シリコンマスターナノパターンの負のPETフィルムに添付してください。
8. 使用前に少なくとも12時間のUVで硬化PUA / PETナノパターン。露出オーバーは問題ではありません。
9. シリコンマスターをクリーニングするには、不要と思われるアプリケーションを追加することなく、マスターの上にPETの別のフィルムを配置し、50秒間UV光（λ= 365 nm）に公開し、PETフィルムを除去します。これは、任意の未反応モノマーを除去します。
10. O ₂ / N ₂ガ ​​ス下で100％エタノール、キシレン、乾燥してシリコンマスターを洗浄します。

図3（a）。ナノパターニングポリウレタンポリマー

1. 10分間オゾン処理チャンバ内に配置することにより、直径25mmの円形ガラススライドを調製する。
2. 容易な取扱いのための小さなPDMSブロック上に、オゾン処理したガラススライドを置きます。
3. ガラススライドに絵筆で表面接着促進剤の薄層を適用する。 30分間風乾燥したガラススライド。
4. プリンタ紙にガラススライドを置きます。
5. ドロップは、スライドガラスの中央部にポリウレタンの10μL（PU）プレポリマー（NOA 76）を分注する。気泡が添加後存在しないことを確認してください。
6. 場所のPUAモールド、パターンは、スライドガラス上に、下向きにセットしてください。 PUAモールドに沿ってゴム製のシリンダーローラーを転がすことにより、スライドガラスの表面全体に均一にPUを分散させる。プリンタ用紙は、ポリマーのオーバーフローを吸収する。
7. ワットUVランプ。 PUの重合時間は、UV光源のパワーに依存している。
8. UV光源からサンプルを取り出して、慎重にPUコーティングされたガラススライドからPUA金型をはがします。 PUの重合は、Cと考えられているompleteとききれいにサンプルからPUAモールドの皮とPUガラススライドは虹色の外観を有する。
9. 限りの月のようにストレージのためにデシケーターに仕上がったサンプルを置きます。

図3（b）。ナノパターニングポリ（ラクチド - コ - グリコリド）ヒドロゲル

1. 激しく10:1の比でシリコーンエラストマーベース及びシリコーンエラストマー硬化剤を混合することにより、平坦なPDMSモールドを作成する。
2. PDMS前駆体は皿（ すなわち、PDMSを厚さ5mmになるように）の縁5mmまで到達するようにペトリ皿に混合PDMS前駆体溶液を注ぐ。
3. 脱ガスに1時間デシケーター中でペトリ皿とPDMS前駆体を配置します。
4. 治すために、少なくとも2時間、65℃のオーブンにペトリ皿とPDMS前駆体を移動します。
5. PDMSを硬化させた後は3センチ×3センチメートルの正方形の部分に平らなPDMSをカットするかみそりを使用しています。これらは、パターニングプロセスの後半で使用されるフ​​ラットなPDMSモールドとなります。
6. PLによるクリーンな直径25mmの円形のガラススライド水中超音波処理装置での30分間イソプロピルアルコールでacing。
7. O ₂ / N ₂ガ ​​ス下で乾燥した清浄なガラススライド。
8. 液滴をガラススライド上にPLGA溶液100μl（クロロホルム中/ vのPLGA 15重量％）を分注する。
9. 溶剤を吸収し、平らなPLGA表面を得るに分注し、PLGAの上に平らなPDMSモールドを配置します。 5分間PDMSの上に200グラムの重量を配置することによって、光の圧力（〜10キロパスカル）を適用します。
10. ゆっくりと平坦なPDMSモールドを剥離し、残留溶媒を除去し、PLGAとカバー​​ガラスとの密着性を高めるために5分間予熱したプレート（120°C）でカバーガラスを配置する。
11. フラットPLGAの上のNP PUAモールドを配置し、15分間の加熱プレート上にある間、PUAモールドの上に1kgの重りを配置することによって、一定の圧力（〜100キロパスカル）と熱（120℃）を適用する。
12. PLGAカバースライドから重量を除去し、基質を室温まで冷却する。基層がされるまで、PUAモールドを削除しないでください冷却した。
13. 基質が十分に冷却した後、慎重にNPのPLGA基層を明らかにし、NP PUAモールドをはがす。 NPのPLGA基層は、虹色の外観を持っている必要があります。
14. 限りの月のようにストレージのためにデシケーターに仕上がったサンプルを置きます。

4。細胞播種および培養

注：このプロトコルは、新生児ラット心室筋細胞（NRVMs）およびH7ヒト胚性幹細胞由来の心筋細胞（hESCの-CMS）が、他の細胞源の文化を説明して使用することができる。

1. 35mmの組織培養ポリスチレン皿にANFSカバースリップ（PUまたはPLGA）を取り付けます。ピペットノーランド光学接着剤（NOA83H）20μlの皿の底に、ゆっくりとNOAの上にANFSカバースリップを配置。接着剤が広がって全体のカバーガラス底をカバーすることができます。 10分間UVに料理を暴露することによりNOAを治す。
2. 二回、5分間、70％エタノール水溶液2mlですすぐことによりANFSを滅菌する。 Eを削除吸引によりthanol。 ANF​​Sは生物学的安全キャビネット内のUV殺菌ランプ（λ= 200から290ナノメートル）の下で〜1時間、完全に空気乾燥させます。
3. 細胞接着を一晩フィブロネクチンでANFSを被覆することによって強化される。 5μg/ mlのDI水にフィブロネクチンを希釈する。皿にフィブロネクチン溶液をピペット2ミリリットル。 37℃のインキュベーター中に置き、5％CO ₂で一晩（少なくとも6時間）。
4. 以前プロトコル²²に従ってNRVMs、ヒトES細胞-CMS、または関心のある他の心臓細胞を得る。
5. 細胞をペレットに3分間1,000 rpmで遠心分離細胞サンプル。
6. 慎重に吸引して上清を除去。ペレットを乱さないように注意してください。
7. 4.6×10 ⁶細胞/ mlの濃度になるように適切な培養培地中で細胞を再懸濁。
8. 慎重に滅菌ANFS上に細胞懸濁液200μlをピペットで。細胞懸濁液は、カバーガラス上に残っていることを確認してください。
9. 37℃、5％のインキュベーター中で細胞を置き細胞はANFSにアタッチできるようにする4時間のCO _2。
10. 同じ条件で培養器で細胞を皿に代わる暖かい培養培地の2ミリリットルを追加します。
11. 24時間後、培地を除去し、余分な細胞を除去するために二度のDPBS 2ミリリットルで洗浄する。
12. 同じ条件で培養器で細胞を皿に代わる暖かい培養培地の2ミリリットルを追加します。文化細胞が密集するまで。一日おきにメディアを交換してください。

Results

図1は、2つの製造方法の製造工程の概略図である。によりナノスケールの地形に起因する光の回折に、ナノパターニングはANFSに虹色の表面をもたらすはずである。 図2は、800 nmの稜線と溝とよくパターン化された25ミリメートルのNP-PUカバースリップ（図2A）に、この虹色の表面を示している幅（図2B）。 ANF​​Sの虹色の外観は、畝と溝の幅によって多少異なります。

ANF​​S上に細胞を播種した後、細胞を基板の稜線と平行な方向に整列させるために開始されます。位置合わせは、播種後の最初の24時間以内に明らかになるべきであり、培養期間の全体のために維持する必要があります。 図3は、培養48時間後の培養とのhESC-CMの7日後にNRVMsの代表明視野像を示す。 NRVMs A番目のhESC-CMのNP表面上にパターン化されていない表面上での心筋細胞がランダムに配向しているのに対して（ 図3A

Discussion

機能的に成熟した心臓組織は、 生体内および心臓組織工学のインビトロ適用の両方のために欠けている。ここで説明するのCFLナノ加工法は、細胞の位置合わせを実現し、システムの拡張性に起因する巨視的組織機能に影響を与えるための堅牢な技術である。大きな面積を容易にパターニングし、細胞培養のために使用することができる。巨視的セルラアラインメントは生体模倣、それは心筋³⁸の機械的および電気的特性の両方に影響を与えるような機能的な組織を生成するために、心臓組織工学において必須である。

ここでの方法は、心臓組織工学内の広範囲の用途に適用することができる。これは、先に、ナノスケールの手がかりは、心臓幹細胞ニッチを作成し、再生^14を促進するために役立つことが実証されている。従って、例えばPLGAなどの生分解性ポリマーを用いて、ナノパターン「パッチ」は、促進するために作ることができる心臓発作の後に治癒。あるいは、天然の心臓と同様の弾性率とのヒドロゲルを用いて、心筋細胞ECM相互作用は、単純化された、再現可能な...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
フィブロネクチン	BDバイオサイエンス	354008
NOA 76	Norland Products, Inc.	7606B
表面接着プロモーター (ガラスプライマー)	Minuta Tech
PUA	Minuta Tech	MINS-311RM
軟質ゴムローラー	スピードボール
シリコンウェーハ	NOVA Electronic Materials	FA01-9900
フォトレジスト		Shipley SPRT510
フォトレジスト現像液	Shipley	MF320
電子ビーム露光装置	JEOL	JBX-9300FS
エッチング装置	Surface Technology Systems	NP10 8UJ
Plasma Asher System	BMR Technology Co.	DSF-200
オゾンキュアシステム	ミヌータテック	MT-UV-O- 08
フュージョンキュアシステム	ミヌータテック	MT-UV-A 11
NOA 83H	ノーランドプロダクツ	8301
スピンコーター	ローレルテクノロジー	WS-400-6NPP
Skyrol PET Film	SKC Co., Ltd.	23038-59-9
25 mm スライド	コーニング	2948
シルガード 184 シリコーン エラストマー キット	ダウ コーニング	6/5/2553
ポリ (D,L-ラクチド-コグリコリド)	Sigma-Aldrich	P2191-1G
クロロホルム	Sigma-Aldrich	372978-1L
500 g 重量	グローバル インサストライT9FB503120
イソプロピルアルコール	EMDミリポア	PX1835-2
ホットプレート	コーニング	PC-420D
超音波発生器	ブランソン	B2510MTH