遺伝子調節の1分子蛍光イメージング開裂により同時翻訳アクティベーションの使用（CoTrAC）

サマリー

我々は、画像への開裂により蛍光顕微鏡法、共同翻訳活性化（CoTrAC）、タンパク質の機能を乱すことなく、単一分子の精度で生細胞中のタンパク質分子の製造を記述している。このメソッドは、転写因子、λリプレッサーCIの確率の発現動態を追跡するために使用されています ¹。

要約

我々は、画像への開裂により蛍光顕微鏡法、共同翻訳活性化（CoTrAC）タンパク質の機能を乱すことなく、単一分子の精度で生細胞中のタンパク質分子の製造を記述している。この方法によれば、シーケンシャル、5分の時間枠で、1セル内に産生されるタンパク質分子の数を数えるようになります。それは、生きた細胞内の単一の蛍光タンパク質分子を検出するために十分に敏感である〜0.5から1キロワット/ cm ²のレーザー励起パワー密度を持つ蛍光顕微鏡を必要とします。膜標的化配列、高速熟成、黄色蛍光蛋白質とプロテアーゼ認識配列：このメソッドで使用される蛍光レポーターが3つの部分から成ります。記者が翻訳目的のタンパク質のN末端に融合されています。細胞は、温度制御された顕微鏡ステージ上に成長させられる。 5分おきに、細胞内の蛍光分子（およびそれ以降の共同撮像される蛍光画像を分析することによってunted）、続いて、新しく翻訳されたタンパク質は、次の測定にカウントされるようにphotobleached。

この方法から得られた蛍光画像は、各画像の蛍光スポットを検出し、個々のセルに割り当てること、その後の細胞系譜への細胞を割り当てることによって分析することができます。与えられたセルにタイムウィンドウ内で産生される蛋白質の数は、単一蛍光分子の平均強度によってスポットの統合された蛍光強度を割ることによって計算されます。我々は、単一の5分の時間ウィンドウで0から45分子の範囲内で発現レベルを測定するために、このメソッドを使用していました。この方法は、私たちがλリプレッサーCIの式で騒音を測定するために有効になっており、システム生物学の他の多くの潜在的なアプリケーションを持っています。

プロトコル

1。ひずみエンジニアリングワークフロー

1. シーケンスのエンコード（）の膜局在化配列、（b）の高速成熟蛍光タンパク質とすると、目的のタンパク質（ 例えば転写因子）とフレーム内の（c）にプロテアーゼ認識配列のN末端 ​​。を挿入我々は、TSR-金星レポーター²標的膜を使用し、発現バクテリオファージλリプレッサーCIのタンパク質分子の数をカウントするユビキチンプロテアーゼ認識配列（UB）に融合した。我々は、野生型CIはコーディング領域とEにコンストラクトを組み込ん交換、融合タンパク質TSR-金星-UB-CIの構築方法についての詳細λ赤組^3を用い^て 、 大腸菌の染色体は、refに詳細に記載されている。 1。
2. 配列決定することによって、すべての変更を確認します。
3. をコードするプラスミドを、目的の蛍光レポーターとタンパク質を発現している株に上記で使用した認識配列に特異的プロテアーゼを変換翻訳融合インチ我々は、C-末端ユビキチン残⁴の直後に切断するプロテアーゼUbp1を使用していました。

2。培養細胞とサンプルを準備

1. 1 Eを選ぶ1X MEMアミノ酸と適切な抗生物質を補充した1ミリリットルM9最少培地⁵にたて縞寒天プレートからの関心の大腸菌コロニー。十分な長さのOD _600が > 1.0（600nmでの光学密度）に到達するために、所望の温度でシェーカーでインキュベートする。
2. OD ₆₀₀ = 0.02に適切な抗生物質で1ミリリットル新鮮M9培地に培養を希釈します。適切な温度でシェーカーでインキュベートする。低温成長のために必要であれば初期細胞密度を増加させることができる。
3. OD ₆₀₀ = 0.2から0.3（37℃、OD ₆₀₀での初期培養細胞を使用したC = 0.02、これは3〜4時間かかります）場合には、アガロースゲルパッド（ステップ3）を製造開始。
4. 時OD細胞はイメージングのための準備が整いました_{の600 = 0.3から0.4。}
5. 卓上遠心機で1分間10,000 xgで1.5 mlマイクロチューブ、遠心分離機に1ミリリットルインキュベート文化を転送します。
6. 上清を捨て、1 mlの新鮮なM9培地を加え、穏やかにペレットを再懸濁します。
7. 1分間、10,000×gで遠心分離します。
8. 1.6と1.7を繰り返します。上清を捨てる。
9. 穏やかに1ミリリットルM9培地に再懸濁します。タイムラプスイメージングのための低細胞密度を確保するために100倍に - 細胞を直接顕微鏡イメージングまたは希釈10に使用することができます。低細胞密度、拡張タイムラプスイメージングのために重要であることに注意してください。イメージング室（ステップ4）は実験中に封入されている。細胞の指数関数的成長のために、高い初期細胞濃度は有意に蛍光タンパク質の成熟を削減し、細胞増殖に影響を与え、ゲルパッド、長引く成長後にチャンバー内の酸素を使い果たすことができます。

3。アガロース溶液を準備

1. 10から20ミリグラムの重量を量る1.5 mlのマイクロチューブに低融点温度アガロース。
2. 3％アガロース溶液を作製するために抗生物質を含まない適切な音量M9最少培地を追加します。
3. 70℃で30分間アガロース溶液を加熱℃、溶液が完全に溶融し、均一であることを保証するためにチューブを反転を溶解した。ゲルパッドは、この時点で注ぐことができる（ステップ4）、または温度が50℃まで低下し、後で使用するために数時間保持することができる。

4。商工会議所にジェルパッドを作製

1. イメージングの前に約50分は、水とMicroaqueductスライドをすすぎます。
2. 1は、カバーガラスを掃除^（6で説明したような厳しい洗浄方法を使用して）圧縮空気を吹き付けることにより滅菌水と乾いたスライドをMicroaqueductすすいでください。
3. それが、これは内のアプリケーション用に変更することができMicroaqueductスライド（のガラス側の入口と出口を覆うようにMicroaqueductスライド上にゴム製のガスケットを配置どのメディア）は、サンプルを通して灌流される。 Microaqueductスライドの中央に50μlをアガロース溶液（ステップ3）を適用します。
4. 洗浄、乾燥したカバーガラスとのアガロース溶液を補充して下さい。
5. アガロース溶液を30分間室温で放置する。
6. 一方、（ステップ2）細胞試料を準備します。
7. 慎重にゲルパッドの上部からカバーガラスを剥がす。ゲルパッドの上部に1.0μlの洗浄された細胞培養を追加します。培養のための〜2分をゲルパッドに吸収されるのを待ちます。それはとても長いゲルパッドoverdriesその待たないようにすることが重要であるが、十分な長さのセルが正しくゲルパッドに付着していること。理想の待機時間は、温度や湿度によって異なります。
8. 待っている間に、別の予備洗浄​​したカバーガラスを乾燥させてください。
9. カバーガラスとMicroaqueductスライドがよく合っていることを保証する新たなカバーガラスでサンプルをカバーしています。
10. メーカーの指示に従って、温度制御された成長チャンバーを組み立てます。現在では、顕微鏡でイメージング（ステップ5）に使用することができます。

5。イメージングとタイムラプスムービーの取得

1. メーカーの指示（ 例えばレーザーは実験前〜0.5時間ウォームアップする必要があるかもしれません）以下のレーザーと顕微鏡をオンにします。
2. 顕微鏡ステージ上のインサートに組み付け室をロックします。成長室の温度は、37℃又は他の所望の成長温度での客観的なヒーターを設定します。
3. イメージング室温以上の場合、フォーカスまたはジェルパッドは、通常約15分初期温度シフト後のために大幅にドリフトします。実際には、関心のある領域を見つけ、実験のために必要に応じてイメージングスクリプトを変更するには、この時間を使用します。
4. 顕微鏡で細胞を見つけると、事前に定義され、整列撮像領域内のそれを中心にした後に各セルの位置を格納します。複数のセルは、各画像取得時間ウィンドウに結像させることができる。 m以上のタイムラプスイメージング用任意の世代は、画像化された細胞は最初に他のコロニーが成長中に撮像領域を入力しないように、少なくとも百数μmで、他の細胞から分離されていることを確認してください。
5. ので、6エクスポージャー（ 図5）内のほぼ全ての蛍光分子が光退色、レーザー励起強度を調整します。
6. 自動イメージングスクリプト/ジャーナルを使用して、 図3の実験的なワークフローで記述されたアルゴリズムを使ってタイムラプスデータを取得する。

結果

λリプレッサーCIの生産を追跡CoTrAC実験から得られた典型的な結果を図4および図5に示されている。この実験では、12個のコロニーは、5分間隔で撮像した。各時点で、コロニーは最初autofocusedたと撮像領域内の中央。次に、フォーカス/中心位置が格納されていたと明視野画像を取得した。ステージはその後細胞（位相差または微分干渉コントラスト（DIC）光学系なし2等分する平面に明焦点面から移動し、z軸に沿って約0.5μmで移行した、半透明のオブジェクトが僅かに結像させることができるアウトフォーカス面^8）。最後に、6つの画像は、100ミリ秒露光（ 図5はそのような時点を示している）を用いて1秒間隔、各々で取得した。これは、各時点でのすべてのセルに対して繰り返された。ほぼすべてのヴィーナス分子が各時点でphotobleachedされているため、蛍光図4と図5のセントスポットが過去5分以内（蛍光なった）成熟金星分子に対応しています。金星分子は^...

ディスカッション

CoTrAC方法は、従来のN末端またはC末端蛍光タンパク質融合体がタンパク質活性を妨害する可能性のある他のタンパク質の産生を測定することが一般化することができる。 CoTrAC戦略は、現在の方法に比べて3特有の利点があります。まず、共同翻訳融合は蛍光レポーターの1分子がリアルタイムでタンパク質生産の正確なカウントを可能にする、目的のタンパク質の各分子のために生成されることを保証します。第二に、膜を標的レポーターTSR-金星は非常に低いレベルで発現されたタンパク質の検出を可能にし、蛍光レポーターの単一分子を検出することができます。第三の、そして最も重要なのは、蛍光レポーターの共同翻訳切断が目的のタンパク質は、その近い野生型配列と機能を保持することができ、常用いて大腸菌のプロテアーゼ認識配列としてユビキチン大腸菌は 、標的タンパク質は、その最初のN-末端Nでその野生型のペプチド配列と異なる</ em>は - ホルミル-メチオニンはメチオニンに変更されます。

CoTrAC方法を使用する場合、それはCo...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
試薬の名称	会社	カタログ番号	コメント（オプション）
アガロース（低融解温度）	ロンザ	50100
のMilli-Q H 2 O
5×M9塩			以下のレシピは9に記載
20％グルコース
MgSO 4を
CaCl 2を
50×MEMアミノ酸溶液	インビトロジェン	11130-051
温度制御成長室 ステージアダプタ	Bioptechs	FCS-2
客観ヒーター	Bioptechs	モデルは、顕微鏡の対物レンズに依存
スライドをMicroaqueduct	Bioptechs	130119から5
マイクロカバーガラス	VWR	40CIR-1	ソースが困難な場合があります。Bioptechsからも利用可能
ガラス/スライドガスケットをカバー	Bioptechs	FCS2 0.75ミリメートル
蛍光顕微鏡	さまざまな	セットアップ例：コヒーレントイノーバ308Cアルゴンイオンレーザー、オリンパスIX-81顕微鏡、オリンパスPlanApo 100X NA 1.45客観、Metamorphソフトウェア	レーザー励起、自動XYZステージ、スクリプト化されたイメージングとオートフォーカスが可能な自動化ソフトウェア、resolvinことのできる光学系を持っている必要がありますgシングル蛍光タンパク質
EM-CCDカメラ	さまざまな	セットアップ例：アンドールIXON DU-898	バックグラウンドを超える単一の蛍光タンパク質を検出するために十分に低いノイズを持っている必要があります