方法論記事

ための間引き頭蓋骨皮質ウィンドウ·テクニック光干渉断層イメージング

DOI：

10.3791/50053

⸱

2012年11月19日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Biomedical Sciences, University of California, Riverside , 2Department of Bioengineering, University of California, Riverside

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

私達はのためのマウスモデルにおける間引き頭蓋骨皮質ウィンドウ（TSCW）を作成する方法を紹介 OCTイメージング。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

光コヒーレンストモグラフィ（OCT）は、高時空間分解能で生物医学イメージング技術です。その低侵襲アプローチと10月は皮膚科、眼科、消化器1-3に広く使用されています。間引き頭蓋骨皮質ウィンドウ（TSCW）を使用して、我々は、in vivoでの画像の皮質をするためのツールとしてスペクトラルドメインOCT（SD-OCT）モダリティを採用しています。一般的に、それは、より汎用性を提供するように開かれ、頭蓋骨がニューロイメージングのために使用されてきた、しかし、TSCWアプローチは、低侵襲であり、神経病理学的研究における長期的イメージングのための効果的な平均である。ここでは、大脳皮質の in vivoイメージングの 10月のマウスモデルにおけるTSCWを作成する方法を紹介します。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1990年代初頭の登場以来、10月は、組織の構造と機能2の生体イメージングのために広く使用されてきました。 10月は、光ファイバ·マイケルソン干渉計2,4低コヒーレンス光源を実装することにより、後方散乱光4のエコー遅延時間を測定することにより、断面画像を生成します。また、フーリエドメインOCT（FD-OCT）として知られている、SD-OCTは、1995年に初めて5年に導入され、従来のタイムドメインOCT（TD-OCT）と比較して優れた画像診断法を提供しています。 SD-OCTでは、参照アームが高速·超高解像度の画像取得6-9で得られた静止状態に保たれています。

現在、TSCWモデルは従来の開頭術の代わりに、2光子顕微鏡の in vivoでの脳の画像アプリケーションでのために主に使用されている。これらTSCWは追加IMAを提供するために、カスタム頭蓋骨板またはガラスカバースリップ10月13日と同時に使用されてきた安定性を変更する。我々の研究では、TSCWが使用されている場合これらのような付属品はOCTイメージングのために必要ではないことを観察した。彼らは光ビームと干渉し、OCT画像を変更することがありますしたがって、頭蓋骨板またはガラスカバースリップの欠如は、イメージング·ウィンドウサイズの広い範囲を可能にします。

間引き頭蓋骨の準備は、二光子顕微鏡10-13を用いて脳のイメージング研究に有利で ​​あることが判明した。私たちの実験では、TSCWを通じて体内画像皮質に、SD-OCTシステムを利用しています。当社のカスタムSD-OCTイメージングセットアップは、それぞれ8μmと20μmの軸方向および横方向の解像度が得97 nmの帯域幅で1295 nmの中心とする2つのスーパールミネッセントダイオード（SLD）14からなる広帯域、低コヒーレンス光源が含まれています。弊社の光学撮像素子では、我々はTSCW介して撮像がoで構造と機能を特定し、可視化に大きな可能性を持っていることを想像するptically密脳組織。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

プロトコル

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1。手術の準備

  1. 6-8週間の年齢の間に雌性CD-1マウスは、私たちの実験で使用した。
  2. ケタミンおよびキシラジンの組み合わせ（80 mg / kgのketamine/10 mg / kgをキシラジン）の腹腔内注射でマウスを麻酔。 〜37℃で最適な体温を確保するための恒温パッドの上にマウスを置き継続的に動物の反射を（ 例えば 、鉗子で鈍足をつまんで）テストすることによって、麻酔のレベルを監視し、必要に応じてそれ以上の麻酔を注入します。
  3. 人工涙液軟膏で両眼を潤滑します。カミソリを使って頭皮に毛を削除し、70％アルコールの準備パッドを用いて残留毛を取り除く。頭皮上Nairさんの脱毛クリームの薄い層を適用し、それを有効にするには、2分間待ちます。穏やかに生理食塩水を使用してNairさん、残りの髪は綿棒とアルコールの準備パッドを湿らせ拭き取ってください。頭皮は完全に無毛である必要があります。
  4. ベタジンスワブスティックを使用して頭皮を消毒すると7をクリーン0％エタノール準備パッド。
  5. 〜37の最適な体温を確保するための手術用ドレープで動物を注意深く包む℃、頭蓋骨を固定する定位フレームに動物をマウントします。軽くて安定性を確保するために頭蓋骨をタップします。使用される材料のリストを表1に提供されています。

2。間引き頭蓋骨皮質ウィンドウ準備

  1. 目の間の正中線の時点で切開を開始します。耳の間の正中線点まで尾を続行します。鉗子との部分は皮膚。
  2. 解剖顕微鏡下で薄くする領域を見つけ、ゆっくりとピンセットを用いて筋膜を除去します。間伐皮質のウィンドウを作成する前に、滅菌綿棒で頭蓋骨を乾かします。私たちの実験では、4×4mmの間伐頭蓋窓〜後部とブレグマ横1ミリメートルを作成しました。
  3. 光抜本的な動きのONLを使用して外科ハンドドリルにドリルビットサイズ0.75ミリメートルの丸カーバイドバーを用いて頭蓋骨を薄く開始yである。頭蓋骨の上に直接圧力をかけないでください。滅菌生理食塩水と綿棒を用いて骨ほこりを取り除くために、頭蓋骨の過熱を防ぐため、毎年20〜30秒の掘削を停止します。生理食塩水はまた、頭蓋骨全体に熱を放散させるのに役立ちます。
  4. 緻密骨の外側の層が完全に除去されたら真ん中の海綿骨の層が表示されるようにする必要があります。血管が海綿骨層でより明らかになりますようにいくつかのわずかな出血があるかもしれません。緑石のいがに切り替えて、海綿層がより繊細であるため特別な注意を用いた掘削を続ける。頭蓋窓全体に均一の作成中に緑色の石のいがが少ない骨材を除去します。骨塵を除去し、頭蓋骨を冷却するために時折ドリルを停止します。
  5. 最後に、頭蓋骨の透明性と脳への血管系になったときに表示されるようになりました、研磨バールを使って頭蓋骨を研磨開始。頭蓋骨を下にスムージングしつつ、間伐より正確にできるようになります。 SKUの薄さをチェック静かにピンセットでそれをタップして、LL。頭蓋骨が少し柔軟になったときに研磨を停止します。
  6. 間伐頭蓋窓は完全に滑らかで反射およびイメージング（ 図1）のために準備ができているはずです。非常に脳の組織の散乱の性質上、頭蓋骨は、最適な深さの浸透のために少なくとも55ミクロンまで薄くする必要があります。使用される材料のリストを表1に提供されています。

3。光コヒーレンストモグラフィーイメージング

  1. 手術が完了した後、麻酔の適切な水準を確保し、必要に応じて追加の麻酔を投与する動物の呼吸速度と反射神経をチェックします。 、定位フレームから動物を削除する手術用ドレープに包まれた動物を維持し、イメージングステーションに動物を輸送する。
  2. イメージングは​​、反射の標識を確認し、必要に応じて追加の人工涙液を適用する前に。頭蓋骨を確保するための定位フレームに代わって動物をマウントします。
  3. 下に動物を置き10月のカメラと位置光ビーム（ 図2）に基づくTSCW。頭蓋骨と脳の断面図になりました（ 図3）可視化することができる。
  4. 関心領域が配置された後、データ取得を開始することができます。イメージング目的のために、私たちは4.0ミリメートルの幅で撮像窓を達成するためにガルボミラーを使用しています。 2mmの撮像深度は6入射電力は、mWと焦点間伐頭蓋骨1mm以下で得られた。それぞれの断面積は、画像1枚あたり0.14秒の取得率は2048軸方向走査で構成されていた。
  5. 脳の体積スキャンも、xyはサジタル方向にビームを走査する第一ガルバノミラーとコロナでスキャン第二ガルバノミラーで走査するためのガルバノミラーの2セットを使用して2D断面一連の画像を収集することによって得ることができる方向。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

結果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

大脳皮質上間伐ウィンドウを作成した後血管系は、より視覚的に顕著でなければなりません（ 図1）と深い撮像深度（1mmまで）が可能になります。右皮質は140μmで（ 図1）で測定した正常な頭蓋骨に比べ、より大きな光学的透明度を提供するので、約55ミクロンまで薄くされる。さらに10から15μmまで薄くするガラスカバースリップと頭蓋骨プレートの使用など、しかし必要ではないが（ 図1および2）我々の実験では実装されていない11が可能です。この特定の方法は、我々の10月断面画像（ 図3）で特定の構造（大脳皮質、脳梁）を識別することができました。間伐頭蓋骨（ 図3B）と正常頭蓋骨の矢状OCT画像（ 図3A）が成功したTSCWとOCT画像の結果を比較するために示されています。さらに、冠状断面10月画像はまた正中線構造（ 図3C）を識別するのに容易にするために取得されます。 図3

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

ディスカッション

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

10月と間引き頭蓋骨によるイメージングはごく最近検討されている小説のニューロイメージング技術15、16です。私たちの実験では、in vivoでのマウスモデルにおけるTSCWを通して、SD-OCTイメージングの実現可能性を実証した。我々の結果から、頭蓋骨が約55μmまで薄くされると侵入深さは、それぞれ、軸方向および横方向に8μmと20μmの画像解像度で約1ミリメートルで得られる。通常の頭蓋骨（ 図4）と比較して信号強度プロファイルでは、TSCWを通してOCTイメージングは、信号強度と深さの浸透を高めます。 〜10月15日程度が3μm〜10の間伐頭蓋骨ながら〜で軸分解能で軟膜表面下150から250μmの10、11、13の撮像深さに達することができるの頭蓋骨の厚さでTSCWとの比較では、2光子イメージング20μmの撮像深度は、大脳皮質12内に300から400μmにまで達することができる。 OVerall、10月と光イメージングは​​mutiphoton顕微鏡よりも深く浸透深さを提供しながら、薄化プロセス...

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

開示事項

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

特別な利害関係は宣言されません。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

この作品は、コンセプト助成のUCディスカバリープルーフによっておよびNIH（R00 EB007241）によってサポートされていました。著者らはまた、この実験では彼女の援助のためのジャクリーン·ハバードに感謝したいと思います。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
材料 会社 カタログ番号 注釈
ケタミンフェニックス医薬品 57319-542-02
キシラジン Akorn株式会社 139から236
人工涙液軟膏ラグビー 0536-6550-91
ナイルチャーチ＆ドワイト株式会社 4010130
滅菌アルコール準備パッドケンドール·ヘルスケア 6818
綿はアプリケーターをひっくり返した Fisherbrand 23-400-115
ベタジンソリューションSwabstick パデュー製品 67618-153-01
食塩水、0.9パーセントフェニックス医薬品 57319-555-08
定位フレーム Stoelting
高速外科ハンドドリル Foredom 38000回転
超硬丸バール Stoelting 0.75ミリメートル
のDura-グリーンストーンズ松風シャンク：HP
形状：BA1
CompoMaster粗＆CompoMasterポリッシャー松風形状：ミニ白金。
SpaceDrapes トリーティフィック株式会社

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bizheva, K., Unterhuber, A., Hermann, B., Povazay, B., Sattmann, H., Drexler, W. Imaging ex vivo and in vitro brain morphology in animal models with ultrahigh resolution optical coherence tomography. Journal of Biomedical Optics. 9, 719-724 (2004).
  2. Fujimoto, J. G. Optical coherence tomography for ultrahigh resolution in vivo imaging. Nature Biotechnology. 21, 1361-1367 (2003).
  3. Wantanabe, H., Rajagopalan, U. M., Nakamichi, Y., Igarashi, K. M., Kadono, H., Tanifuji, M. Swept source optical coherence tomography as a tool for real time visualization and localization of electrodes used in electrophysiological studies of brain in vivo. Biomedical Optics Express. 2, 3129-3134 (2011).
  4. Huang, D., Swanson, E. A., Lin, C. P., Schuman, J. S., Stinson, W. G., Chang, W., Hee, M. R., Flottee, T., Gregory, K., Puliafito, C. A., Fujimoto, J. G. Optical coherence tomography. Science. 254, 1178-1181 (1991).
  5. Mitsui, T. Dynamic range of optical reflectometry with spectral interferometry. Japanese Journal of Applied Physics. 38, 6133-6137 (1999).
  6. de Boer, J. F., Cense, B., Park, B. H., Pierce, M. C., Tearney, G. J., Bouma, B. Improved signal-to-noise ratio in spectral-domain compared with time-domain optical coherence tomograhy. Optics Letters. 28, 2067-2069 (2003).
  7. de Boer, J. F. Ch. 5. Optical Coherence Tomography: Technology and Applications. , Springer. (2008).
  8. Choma, M. A., Sarunic, M. V., Yang, C., Izatt, J. A. Sensitivity advantage of swept source and fourier domain optical coherence tomography. Optics Express. 11, 2183-2189 (2003).
  9. Leitgeb, R. A., Drexler, W., Unterhuber, A., Hermann, B., Bajraszewski, T., Le, T., Stingl, A., Fercher, A. F. Ultrahigh resolution fourier domain optical coherence tomography. Optics Express. 12, 2156-2165 (2004).
  10. Drew, P. J., Shih, A. Y., Driscoll, J. D., Knutsen, P. M., Blinder, P., Davalos, D., Akassoglou, K., Tsai, P. S., Kleinfeld, D. Chronic optical access through a polished and reinforced thinned skull. Nature Methods. 7, 981-984 (2010).
  11. Shih, A. Y., Mateo, C., Drew, P. J., Tsai, P. S., Kleinfeld, D. A Polished and Reinforced Thinned-skull Window for Long-term Imaging of the Mouse. J. Vis. Exp. 61, e3742(2012).
  12. Yang, G., Pan, F., Parkhurst, C. N., Grutzendler, J., Gan, W. Thinned-skull cranial window technique for long-term imaging of the cortex in live mice. Nature Protocols. 5, (2010).
  13. Lu, M., Majewska, S., K, A., Gelbard, H. A. A Thin-skull Window Technique for Chronic Two-photon In vivo Imaging of Murine Microglia in Models of Neuroinflammation. J. Vis. Exp. (43), e2059(2010).
  14. Wang, Y., Oh, C. M., Oliveira, M. C., Islam, M. S., Ortega, A., Park, B. H. GPU accelerated real-time multi-functional spectral-domain optical coherence tomography system at 1300nm. Optics Express. 20, 14797-14813 (2012).
  15. Aguirre, A. D., Chen, Y., Fujimoto, J. F. Depth-resolved imaging of functional activation in the rat cerebral cortex using optical coherence tomography. Opt. Lett. 31, 3459-3461 (2006).
  16. Chen, Y., Aguirre, A. D., Ruvinskaya, L., Devor, A., Boas, D. A., Fujimoto, J. G. Optical coherence tomography (OCT) reveals depth-resolved dynamics during functional brain activation. Journal of Neuroscience Methods. 178, 162-173 (2009).
  17. Liang, C., Wierwille, J., Moreira, T., Schwartzbauer, G., Jafri, M. S., Tang, C., Chen, Y. A forward-imaging needle-type OCT probe for image guided stereotactic procedures. Opt Express. 19, 26283-26294 (2011).
  18. Srinivasan, V. J., Sakadzic, S., Gorczynska, I., Ruvinskaya, S., Wu, W., Fugimoto, J. G., Boas, D. A. Quantitative cerebral blood flow with optical coherence tomography. Optics Express. 18, 2477-2494 (2010).
  19. Galetta, K. M., Calabresi, P. A., Frohman, E. M., Balcer, L. J. Optical Coherence Tomography (OCT): imaging the visual pathway as a model for neurodegeneration. The Journal of the American Society for Experimental NeuroTherapeutics. 8, 117-132 (2011).
  20. Seigo, M. A., Sotirchos, E. S., Newsome, S., Babiarz, A., Eckstein, C., Ford, E., Oakley, J. D., Syc, S. B., Frohman, T. C., Ratchford, J. N., Balcer, L. J., Frohman, E. M., Calabresi, P. A., Saidha, S. In vivo assessment of retinal neuronal layers in multiple sclerosis with maual and automated optical coherence tomography segementation techniques. J. Neurol. , (2012).
  21. Frohman, E. M., Fujimoto, J. G., Frohman, T. C., Calabresi, P. A., Cutter, G., Balcer, L. J. Optical coherence tomography: a window into the mechanisms of multiple sclerosis. Nature Clinical Practice. 4, 664-675 (2008).
  22. Gill, A. S., Rajneesh, K. F., Owen, C. M., Yeh, J., Hsu, M., Binder, D. K. Early optical detection of cerebral edema in vivo. J. Neurosurg. 114, 470-477 (2011).

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

再版と許可

このJoVE記事のテキストまたは図の再利用許可をリクエスト

許可をリクエスト

タグ

OCT OCT

関連記事