ここでは、ホールマウント蛍光を記述その場でハイブリダイゼーション（FISH）プロトコル、キイロショウジョウバエ。
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この記事について
サマリー
要約
遺伝子の発現パターンだけでなく、その転写されたRNAの細胞内局在化特性を評価、開発中にその生物学的機能を理解するために重要な機能です。 in situハイブリダイゼーション 、RNA（RNA ISH）は、生物の、細胞または細胞内のレベル1でそれである、RNAの分布特性を可視化するために使用される強力な方法です。 RNA-ISHはmRNAまたは関心2の非コーディングRNA標的の配列に相補的な標識核酸プローブ（ 例えば、アンチセンスRNA、オリゴヌクレオチド）のハイブリダイゼーションに基づいています。手順は配列特異的なプローブを生成するために単独で一次配列情報を必要として、それは普遍的に生物や組織標本3の広い範囲に適用することができます。実際、大規模なISHの多くの研究がにつながっている様々なモデル生物における遺伝子発現とRNA局在化ダイナミクスを文書化するために実装されています重要な地域資源の確立4-11プローブのラベリングと検出、様々な戦略が長年にわたって開発されてきたが、蛍光標識された検出試薬と酵素信号増幅ステップの併用は、手順12の感度と分解能の大幅な機能強化を提供します。ここでは、段階的なショウジョウバエ胚におけるRNAの発現と局在の動態を可視化するためにチラミドシグナル増幅（TSA）を用いるin situハイブリダイゼーション法（FISH） に最適化された蛍光を記述します。手続きが大幅に多数のサンプルの同時処理を容易にする96ウェルPCRプレート形式で行われる。
プロトコル
1。 RNAプローブの調製
概要：次のセクションでは、魚に適したジゴキシゲニン（DIG）標識RNAプローブを作るために必要な手順を説明します。最初のステップは、クローニングや配列特異的なプローブを生成するために使用され、目的の遺伝子の転写領域に対応する配列を増幅するPCRを伴います。これは、複数のクローニング部位は、その後のプロモーター配列を組み込む隣接するプライマーを用いたPCRのテンプレートとして使用することができますバクテリオファージプロモーターエレメント（T7、T3またはSP6）が隣接したプラスミドへの最初のクローニング遺伝子セグメントによって達成することができる、このように各端で異なるプロモーター配列（ 図1A）と線形PCR産物を生成する。あるいは、クローニングステップを回避するために、1つはまた、T7、T3またはSP6配列が、5 '端で（ 例えば T7を含むオリゴヌクレオチドを用いて、ゲノムDNAまたはcDNAからPCR増幅を行うことができます。5'-TAATACGACTCACTATAGGGAGA-3 '; T3：5'-AATTAACCCTCACTAAAGGGAGA-3'; SP6：5'-ATTTAGGTGACACTATAGAAGAG-3 '）。リニアPCR産物をランオフ適切なポリメラーゼ（ 図1B）
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結果
正常に実行されている場合、このプロシージャは、初期のショウジョウバエの胚発生における遺伝子発現とmRNA局在化ダイナミクスの時空間分析の細部の著しく強化されたレベルを提供しています。古典的なペアルール遺伝子ラント （ ラン ）のために、図3Aに示すように、確かに、1つは核を表現するグループの新生転写産物病巣の検出を介して遺伝子発現のイベントを監視するために、このプロトコルを使用することができます。加えて、 図3Bの胚のモザイクのように、この方法は、高解像度でのmRNA局在機能の可視化を可能にします。
図1。 RNAプローブの調製手順の概要（）は、in vitro転写usin 内でDIG標識.......
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ディスカッション
プローブ合成の手順については、我々は通常、 ショウジョウバエ遺伝子コレクション（DGC）は、次のWebサイトで詳細なリソースで見つかったプラスミドから増幅された完全長cDNAからショウジョウバエのin vitro転写によりランオフアンチセンスRNAプローブを生成： のhttp://www .fruitfly.org / DGC / index.htmlを 14,15。このアプローチは、遺伝子発現やフライ9,16胚におけるmRNA局在パターンをマッピングすることを目的とした大規模なISHの研究に広く用いられてきた。 DGCプラスミドは、 ショウジョウバエのゲノムリソースセンター（から注文することができhttps://dgrc.cgb.indiana.edu/vectors/.......
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開示事項
特別な利害関係は宣言されません。
謝辞
レキュヤー室で行った仕事は、国立科学とカナダの技術評議会（NSERC）、健康研究（CIHR）とフォン·ド·RECHERCHE専用サンテ·デュ·ケベック（FRSQ）のカナダの協会からの資金によってサポートされています。キャロルIampietroがアンジェロPizzagalliポスドクでサポートされていながら、ファビオアレクシスルフェーブルとガエル·Moquin·ボードリーは、NSERC学部研究studentshipsによってサポートされています。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 試薬の名称 | 会社 | カタログ番号 | コメント（オプション） |
| T7、T3またはSP6 RNAポリメラーゼ | フェルメンタスライフサイエンス | EP0101、EP0111、EP0131 | キットは、反応緩衝液を含んでいます。 |
| DIG RNAラベリングミックス | ロシュ·ダイアグノスティックス | 11 277 073 910 | |
| RNAguard | アマシャムバイオサイエンス | 27-0816-01 | |
| 3M酢酸ナトリウム | |||
| 冷たい100％エタノール。 | |||
| 冷70％エタノール。 | |||
| 塩素系漂白剤の溶液を水で1:1に希釈した。 | |||
| ヘプタン | |||
| メタノール | |||
| プロテイナーゼK | シグマアルドリッチオークビル、ON、カナダ | 商品番号P2308 | |
| 新たに調製し、40％ホルムアルデヒド溶液、 | |||
| をPBS-Tween溶液（PBT） | 1xPBS、0.1％Tween-20を | ||
| グリシン溶液 | PBTで2 mg / mlのグリシン | ||
| HRP標識マウスモノクローナル抗DIG | ジャクソンイムノリサーチラボラトリーズ株式会社 | 200から032 - 156 | （PBTBで1 mg / mlの原液の400分の1希釈 |
| HRP結合ヒツジモノクローナル抗DIG | ロシュ·アプライド·科学者CE、ラヴァル、QC | 1 207 733 | PBTBで原液の1/500希釈 |
| ビオチン結合マウスモノクローナル抗DIG | ジャクソンイムノリサーチ·ラボラトリーズ社、ウェストグローブ、ペンシルバニア州、アメリカ合衆国 | 200-062-156 | （PBTBで1 mg / mlの原液の400分の1希釈 |
| ストレプトアビジン-HRPコンジュゲート | Molecular Probes社、ユージーン、OR、アメリカ合衆国 | S991 | （1μg/ mlの株式の1/100希釈 |
参考文献
- Wilcox, J. N. Fundamental principles of in situ hybridization. J. Histochem. Cytochem. 41, 1725-1733 (1993).
- Tautz, D., Pfeifle, C. A non-radioactive in situ hybridization method for the loca....
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再版と許可
