迅速かつ完全に逆行灌流を通して無傷ブタ心臓から細胞成分を除去するための方法が記載されている。この方法は、複数の臨床アプリケーションで使用するための可能性を秘めているサイト固有心筋細胞外マトリックス足場が得られます。
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この記事について
サマリー
要約
主に足場のネイティブアーキテクチャを維持しながら、灌流ベースの全臓器の脱細胞化は最近、サイト固有の細胞外マトリックスの足場を作成するための手段として、組織工学の分野で関心を集めています。現在までに、このアプローチは、心臓、肺、肝臓1月5日を含めて、臓器の様々なシステムで利用されている。簡単にアクセスできる血管網なしで組織のための前の脱細胞化法は、界面活性剤、酸、または周囲の細胞外環境6月8日から細胞および核成分を除去するための手段として、酵素処理のソリューションに対する組織の長期の暴露に依存してきた。しかし、拡散を介して組織に浸透するソリューションの能力に応じてこれらの方法ヒンジ式の有効性。 decellularizatiのとは対照的に、自然の血管系による臓器の血流を効果的に拡散距離を減少させ、促進輸送組織のうち、組織および細胞成分にエージェント上。ここで、我々は完全に冠状逆行灌流を通して無傷ブタの心臓をdecellularizeする方法について述べる。プロトコルは、無傷の心臓の3次元構造を完全に脱細胞化された心臓の細胞外マトリックス（C-ECM）の足場を得た。我々の方法は、酵素、界面活性剤、および細胞の溶解および除去を助けるため高張低張とリンスと相まって酸のシリーズを使用していました。プロトコルは、細胞物質の除去を助けるためにTriton X-100およびデオキシコール酸ナトリウム溶液に続くマトリックスから細胞を分離するためにトリプシン溶液を使用していました。説明されたプロトコルはまた、長時間の2リットル/ min以上の灌流速度を使用します。細胞破片の汚染なし、組織への薬剤の輸送許可ソリューションの変更と相まって、高流量、および組織のリンス効果を確実にした。記載された方法はNATIからすべての核物質を除去様々なアプリケーションに使用することができ、サイト固有の心臓ECMの足場を作成VEブタ心臓組織、。
プロトコル
1。組織の準備と実験セットアップ
- 食肉処理場や研究施設からすぐに安楽死の後に収穫豚の臓器と過剰血を洗い流す。心房と大動脈をそのまま維持し、余分な脂肪や組織の中心部をトリミングします。離れて大動脈から肺動脈を分離する脂肪トリミング。組織内の任意のカットがある場合は、適切に廃棄してください。
- 冷凍庫の紙で個別にそれぞれの心をラップし、完全凍結を確実にするために、少なくとも24時間、-80℃の冷凍庫内のすべての組織を保管してください。
- ときに使用する（通常3ヶ月未満）、一晩4℃で4リットルのビーカーに沈めタイプ1の雪解け水1そのまま冷凍ブタ心の準備ができて
- 心が完全に解凍された後、心が乾いたなで心を量ると、体重を記録する。市場重量豚の心臓部は、約375〜450グラムの重量を量るべきである。
- とげのある減速機の¼ "最後までサイズで18マスターフレックスチューブを接続します。有刺鉄線減速機を挿入し、大動脈内側チューブ。ちょうど腕頭動脈の下、大動脈周囲に2ホースクランプまたはセキュアジップタイを置きます。減速機とチューブは大動脈弁ので、冠状動脈が灌流することができます（図1）以上を保つ必要があります。
- タイプIの水でチューブを埋めるために30または60 mlの注射器を使用しています。そのおおよその中点でマスターフレックスローラーポンプのカートリッジ内にチューブを挿入します。流入水2.5リットルを充填し....
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結果
全体ブタの心臓に脱細胞化の効果は自然に大きさの違い、圧力、容器の配置によって変化する。従って、細胞外マトリックス由来の足場の正確な組成は、心臓から心臓に同じにはなりません。説明されたプロトコルの完了は、細胞材料の損失を示す、白色または半透明表示される心臓を得ることができます。しかし、それは広く組織はさらにいくつかの定量的なパラメータ8の組み合わせに基づいて、 "脱細胞化された"と考えることができることが認められている。成功した脱細胞化プロトコルは、組織1mgあたりの二本鎖DNA（図6）に比べ50 ngの行列を生成します。行列の移植の際に宿主免疫応答を回避するために、残りのDNAは、200未満の塩基対（図7）を含める必要があります。これらの知見を確認するには、ヘマトキシリン及びエオシン染色は、核の有無を明らかにする必要があります心室と心室中隔の代表的なセクション（図8）で染色。マッソントリクロームは、さらに心臓の筋束とコラーゲンネットワークの保持
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ディスカッション
現在の研究では、ブタの心臓の一貫性のある効率的な脱細胞化するための方法論を説明した。プロトコルは、以前に発表した報告書1への変更であり、再現性の高い結果が得られた流量と圧力の上昇に長い露出が含まれていました。結果として脱細胞化組織は、組織2が正常細胞化のために発行基準のすべてを満たした。頻繁なソリューションの変更は組織に細胞物質の再導入を制限するために行われた、各細胞化剤への曝露の期間は、ECMへの悪影響を低減するために最小化されました。プロトコルの初期段階の間、灌流速度は徐々に状態に組織を増加させ、プロトコルの後の段階で、より高い流速を可能にします。早い段階で組織はエアコンなしでは、心臓の血管系が破裂することができ、心臓の血流を不可能。プロトCOLはその効率のために使用したところ、特許請求の範囲は、他のプロトコルを介して、その優位性に加えられません。脱細胞化剤と血流の速度の正確な組成は多分良好な機械的または生物学的特性を持つプロトコルをもたらすために変化しますが、心臓への薬剤の送達のための一般原則が適用されてもよい。
心臓のネイティブな.......
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開示事項
博士ギルバートは、研究が行われている間にACell、Inc。で科学諮問委員会にあったし、最近の研究開発担当副社長となりました。 ACell社は、膀胱行列を販売しており、本研究では商業的な利害関係はありません。
謝辞
著者はブローガンゲスト、ミシェル·ウィーバー、そしてクリステンリッペルトを承認したいと思います。この研究のための資金は、NIHグラントR03EB009237ならびにNIHの訓練助成生体イメージングとバイオの国立研究所からT32EB001026-06とT32HL076124-05によって提供されました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 試薬/材料の名称 | 会社 | カタログ番号 | 注釈 |
| トリプシン | ギブコ | 15090 | |
| EDTAを | フィッシャー | BP120-500 | |
| NaN 3を | シグマ | S2002-500G | |
| トリトンX-100 | シグマ | X100-1L | |
| 10X PBS | フィッシャー | BP399-20 | |
| デオキシコール酸ナトリウム | シグマ | D6750-500G | |
| 過酢酸 | ファルツとバウアー | P05020 | 35％CAS番号79-21-0 |
| エタノール | Pharmco | 111000200 | |
| マスターフレックスポンプドライブ | コールパーマー | SI-07524から50 | |
| マスターフレックスチューブ | コールパーマー | 96400から18 | サイズ18 |
| 有刺鉄線リデューサー | コールパーマー | EW-30612から20 | |
| 4Lビーカー | フィッシャー·サイエンティフィック | 02-540T |
参考文献
- Ott, H. C., et al. Regeneration and orthotopic transplantation of a bioartificial lung. Nat. Med. 16, 927-933 (2010).
- Ott, H. C., et al. Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart. Nat. Med<....
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再版と許可
