哺乳動物細胞における小胞体ローカライズされたmRNAの可視化

サマリー

ここでは、哺乳類の組織培養細胞に小胞体関連mRNAを可視化する方法を説明します。この手法は、蛍光灯に続く細胞質の内容を削除するジギトニンと形質膜の選択的透過性上昇を伴うその場でハイブリダイゼーション。

要約

真核生物では、分泌され、膜タンパク質は小胞体（ER）の表面に局在しているエンコードのメッセンジャーRNA（mRNA）のほとんど。しかし、これらのmRNAの可視化が困難な場合があります。これは、mRNAの一部のみがER関連のときは特にそうであり、この細胞小器官への分布は非標的（ すなわち "自由"）転写産物は妨害されます。同時に、ERの整合性を保ちながら、ER関連mRNAを監視するために、我々は、細胞が選択的に細胞膜をpermeabilizesジギトニン抽出溶液に短い露光で処理させる方法を開発し、したがって細胞質内容が削除されました。このメソッドはin situハイブリダイゼーション（FISH） 蛍光 inと結合されているとき、1は明らかに蛍光顕微鏡で、ERに結合したmRNAを可視化することができます。このプロトコルを使用してバルク·ポリ（A）転写産物または特定のmRNAのいずれかのためにER-関連度を評価することができるさらに定量化した。プロセスでは、1は、mRNA-ERの相互作用の性質を調べるために、このアッセイを使用することができます。

概要

真核生物では、コードするmRNAは、翻訳時の^3,4リボソームとtransloconsの間の直接的な相互作用を介して分泌され、膜タンパク質は、共同翻訳シグナル認識粒子^1,2によってERに標的とすることができるし、ERに保持することができる。しかし、mRNAはごく最近まで不明であったリボソームや翻訳のいずれかの独立した小胞体に標的にし、維持することができるかどうかを指定します。これまでの研究では、細胞分画技術を用いて、ERでの翻訳に依存しないmRNAの関連があるかどうかを対処しようとしました。過酷な化学的条件は潜在的に繊細なmRNAの小胞体関連が中断される可能性があり、ER由来の小胞から、リボソームの関連付けを解除する必要がありましたので、これらの研究では^、5月8日のための証拠を提供する、決定的なものではなかったと^9,10に対してリボソーム依存しないmRNAのERへのアンカリング。

これらの問題を回避するために、我々はprotoを開発しました小胞体に結合したmRNAを単離すると、画像にCOL。この手順では、同時に、ER形態とその関連分子のすべてを保持しながら、効果的に細胞（非小胞体に結合したmRNAを含む）のすべての細胞質のコンテンツを削除し、軽度抽出処理を伴う。このプロトコルを使用して私たちは、mRNAのサブセットを対象としており、その後、リボソームまたは翻訳を¹¹の独....

プロトコル

1。抽出のための材料の調製

1. 細胞の調製
   1. 実験する前に、少なくとも1日に酸処理されたカバースリップ上種子組織培養細胞。我々は、これらの2つの細胞株が分泌されたタンパク質の強固な生産を示す限り、COS-7またはU2OSを使用し、よく定義されたERを持っています。高い抽出効率を達成するために、細胞は実験の日にカバースリップ上で80％コンフルエントを超えてはならないことに注意してください。
   2. 特に外因性のmRNAが検討されている場合には、細胞は、標準的なトランスフェクションプロトコールを用いて目的の遺伝子を含むプラスミドで播種後1日目にトランスフェクトする。次に、細胞を抽出する前に少なくとも18時間のためのmRNAを発現するように許可されています。
2. 翻訳阻害剤で細胞を処理
   1. ERでのmRNAの関連のメンテナンスにそのままリボソームの効果をテストするために、細胞の関連を混乱させる翻訳阻害剤で治療することができますmRNAは¹¹とリボソームの。
   2. （4 -メチル-2,6 - dinitroanilino） - -などhomoharringtonin（HHT）、pactamycin、または2と翻訳開始の阻害剤、同時にに従事してリボソームを可能にしながら、N-メチルプロピオンアミド（MDMP）は、トランスクリプトとの関連付けから新しいリボソームを防ぐ^12月14日翻訳<....

結果

ER関連であるmRNAの割合を決定するために、 胎盤アルカリホスファターゼ（ALPP）またはシトクロムP450-8B1（CYP8B1）が含まれていたプラスミドでトランスフェクトしたCOS-7細胞のいずれかジギトニンで抽出した後、固定、または直接修正されました（ 図1を参照して、比較する"Ctrlキーを抽出された"には"Ctrlキーを押しながら未抽出"）。非核保有蛍光が両方のサンプルで定量し、ER関連するmRNAの一部は（ 図2）を算出した。我々のデータは明らかにALPPとCYP8B1の両方に対して、細胞質mRNAの約60％がERに関連付けられていることを示しています。これらのmRNAの両方が、ER内腔で処理されたタンパク質をエンコードするので、我々の結果は、このようなmRNAは小胞体の表面に換算されているという考えと一致している。

リボソーム解離した後、これらの転写産物のER-関連を監視するには、トランスフェクトされたCOS.......

ディスカッション

様々な細胞内のサイトへのmRNAの局在化は、mRNA局在タンパク質と転写産物の相互作用を介して、細胞内のローカルな要件への彼らの最終目的地へのタンパク質が適切にソートするため、遺伝子発現の微調整のための重要な広範な現象である地域^19,20。

ここに記載のアッセイを用いて、我々は、分泌タンパク質をコードするmRNAがリボソームや翻訳の存在下または非存在下で、ERで維持できるかどうかの質問を再訪。実際、我々はこれらのmRNAのサブセットが、この活動^11を持っ^ていること^がわかった。たとえば、この抽出プロトコルを使用して、我々はALPPとCYP8B1 mRNAの両方が制御におけるERの表面処理されたCOS-7細胞（ 図1-2）に局在していることが判明しました。しかし、翻訳阻害ピューロまたはHHT、ALPPだけではなく、CYP8B1 mRNAで細胞を処理した後、機能的なリボソームと翻訳（