鉄源としてヒトヘモグロビンを用いた黄色ブドウ球菌の成長

サマリー

ここでは、のための増殖アッセイを記述黄色ブドウ球菌利用可能な栄養素鉄の唯一の供給源としてヘモグロビンを用いた。このアッセイは、ヘモグロビン由来の鉄獲得に関わる細菌因子の役割を確立します。

要約

黄色ブドウ球菌は、鉄が重要な代謝機能と原因疾患を遂行する必要があり、病原性細菌である。人間のホスト内の鉄の最も豊富な貯水池はヘモグロビンのヘム補因子である。ヘモグロビンから鉄を獲得するには、S.黄色ブドウ球菌は、鉄調節表面決定因子（ISD）システム¹として知られている精巧なシステムを採用しています。 ISDシステム最初のバインド、ホスト·ヘモグロビンの構成要素は、次に抽出し、ヘムをインポートして、最終的に細菌の細胞質^2,3にヘムから鉄を遊離する。この経路は、in vitro試験^4-9 の数多く通って解剖されています。さらに、感染症へのISDシステムの寄与を繰り返しマウスモデル^8,10-14で実証されている。ヘモグロビン由来の鉄獲得にISDシステムの寄与を確立し、成長がより困難であることが証明された。唯一の鉄源としてヘモグロビンを用いた増殖アッセイは、b複雑なものyの市販のヘモグロビンの不安定、フリー増殖培地中の鉄、鉄キレート剤に関連する毒性を汚染。ここでは、これらの制限を克服する方法を提案する。高品質のヘモグロビンは、新鮮な血液から調製されており、液体窒素中で保存されています。精製されたヘモグロビンは脊椎動物宿主病原体内部で発生した鉄 - 劣悪な環境を模倣した鉄枯渇培地に補充される。 Sを飢えによって遊離鉄の黄色ブドウ球菌 、我々は、ヘモグロビンを結合するヘムを抽出し、細菌の細胞エンベロープを通ってヘムを通過して細胞質内でヘムを分解する能力に完全に依存した方法で成長を誘発するヘモグロビンの低侵襲操作形で補う。このアッセイは、Sのhemoglobin-/heme-derived鉄獲得のメカニズムを解明しようとしている研究者にとって有用であろうブドウ球菌およびおそらく他の細菌性病原体。

プロトコル

1。新鮮な血液からヘモグロビンの精製

1. 抗凝固剤を補充した新鮮なヒト血液を取得します。浄化を通して氷上もしくは4℃で血液℃で保管してください。
2. 1500×gで20分間血液を遠心分離します。赤血球は（赤血球）チューブの底になります。注意深く上清を吸引し、ゆっくりと氷冷0.9％（w / v）のNaCl溶液中でペレットを再懸濁します。遠心分離を繰り返し、3回洗浄します。
3. 氷冷10mMトリス-HCl（pH8.0）の1ボリュームにペレットを再懸濁します。これは浸透圧に起因する赤血球の溶解を誘導します。 〜20％の最終容量にトルエンを追加します。
4. 一晩ロティサリーで4℃でインキュベートする。
5. 1時間20,000 xgでライセートを遠心分離します。手つかずのトルエン（上フローティング）とペレットを残して真ん中溶血画分を集める。中間留分を収集するために、長い首のピペットを使用しています。
6. 0.44μmのシリンジフィルターを通過します。解決策は、微粒子が含まれている場合物質とは、ステップ1.5を繰り返して、フィルタを通過することはできません。
7. 高速液体クロマトグラフィー（HPLC）、陰イオン交換カラム（Varian、PL-SAX千オングストロームは8μm、150ミリメートル×4.6ミリメートル）とヘモグロビン（Hb）を浄化する。移動相Bは、10mMトリス-HCl（pH8.0）+0.5 M NaClで10mMのトリス-HCl（pH8.0）および移動相である。溶媒Bの0％-100％の勾配は2.0ミリリットル/分の流量で2分間にわたって実行されます。 （：410 nmと280 nmλ）の溶出が吸収に基づいて監視されています。鮮やかな赤い色と著名な吸収ピーク（ 図1）によって特徴付け一部のみを収集します。
8. に対する溶出を透析するリン酸緩衝再び生理食塩水（PBS）で一晩してから数時間。 0.22μmのシリンジフィルターを通過することにより滅菌する。
9. Hb濃度を測定するために、PBS中の既知濃度の標準ヘモグロビン溶液を調製する。標準溶液を混合することにより、試料中のヘモグロビンの濃度を測定（試薬達とテーブルを参照してください。ed）または1:1の比率で2倍Drabkin試薬（粉末から調製）と試料溶液。例えば、96ウェルプレートに100μlの2倍Drabkinの試薬を用いて、100μlのHb溶液を混ぜる。 540nmで15分間測定吸光度インキュベートする。標準曲線をプロットし、試料中のヘモグロビン濃度を測定します。 5〜15 mg / mlの収率は典型的なものである。
10. 重複の15％SDS-PAGE上で15から20μgの精製ヘモグロビンを実行します。ゲルの1を汚し、ヘモグロビンのニトロセルロース膜とイムノブロット（ 図2）の上に別のゲルからタンパク質を転送します。
11. 凍結し、液体窒素中でヘモグロビンの1mlのアリコートを格納します。

2。鉄枯渇増殖培地の調製

1. メーカーと1％cassamino酸（CA）（w / v）のが推奨するように重炭酸ナトリウムを加える、水にRPMI粉末を溶解することによりロズウェルパーク記念研究所（RPMI）ブロスを準備します。 0.2μmフィルターや店舗冷媒を通過させることにより殺菌erated。
2. Chelex 100 7％（w / v）を追加し、撹拌プレート上で一晩混合することにより、金属が枯渇RPMI（NRPMI）を準備します。 0.2μmフィルターや店舗冷蔵を通過することによりChelex 100を削除します。 、25μMZnCl _2を 、無菌の1,000×溶液として予め用意し、25μMのMnCl _2、100 mM CaCl ₂および1mMのMgCl _2：本質的な非鉄金属とメディアを補足するものです。再利用可能な電源からの鉄汚染を避けるために、このステップのための使い捨てのプラスチック容器を使用しています。

ソレ鉄源としてヘモグロビンを用いた3。 黄色ブドウ球菌の成長

1. ストリークS.凍結ストックからトリプシン大豆寒天（TSA）は上の分離のための黄色ブドウ球菌 。 20〜24時間37℃でインキュベートする。
2. 100mmに無水エタノールに再懸濁し、エチレンジアミン-N、N'-ビス（2 - ヒドロキシフェニル酢酸）（EDDHA）。 EDDHAは解決策にはなりませんが、エタノールで滅菌される。
3. 最終濃度0.5mMにRPMIにEDDHAを追加します。許すEDDHAは、次のステップに進む前に、少なくとも30分間溶解する。バッチ間のばらつきにより、最終EDDHA濃度は、細菌の増殖を可能にする0.25 mMまで低下させることが必要になることがあります。
4. Sの単一コロニーを植菌15ミリリットルのスクリューキャップコニカルチューブでRPMI含むEDDHAの5ミリリットルに黄色ブドウ球菌 。 37℃で16から20時間、毎分180回転（rpm）で振盪しながらCを。
5. 7500×gで5分間、一晩培養を遠心NRPMIが0.5mMのEDDHAを含有するペレットを再懸濁します。 〜3のOD _600を正規化_します 。
6. NRPMIはミリリットルHbおよび0.1から1.0 mMのEDDHAあたり2.5μgを含む準備します。バッチ間のばらつきによる、NRPMI内遊離鉄をキレートするために必要なEDDHA濃度は変わる場合があります。
7. 15ミリリットルのスクリューキャップコニカルチューブに1ミリリットルNRPMI EDDHA + + HBにステップ3.5からの細菌懸濁液10μlをサブカルチャー。
8. 180rpmでまたはローリングドラムに振とうしながら、最大48時間まで37℃で培養する。
9. は6月12日すべての時間は、96ウェルプレートで培養液50μlを除去し、PBSを150μlと混合することにより、OD ₆₀₀測定値を取る。

結果

我々は、HPLC（プロトコルステップ1.7）で溶血からヒトヘモグロビンを精製した。 図1は、280および410 nmの波長での溶出液の吸光度を記録した。フラクション5を回収し、他の画分を廃棄した。溶出液のミリリットル当たりのヘモグロビンの五から十五ミリグラムの収量は、一般的に取得される。精製されたヘモグロビンは、重複でSDS-PAGEで分析したところ、ゲルをどちらかのタンパク質を染色またはニトロセルロースおよびイムノブロット（プロトコールステップ1.10、 図2）に転写した。

我々は、野生型の成長をサポートするためにヒトヘモグロビンの精製能力を評価したS. aureusおよびS. ISDシステム（ΔISDB）のISDBコンポーネントを欠いているブドウ球菌 。 ISDBは、ヘモグロビン由来の鉄獲得¹²に必要とされるヘモグロビン受容体である。野生型およびΔISDBは人間hemogを補充鉄欠乏培地中で増殖させた...

ディスカッション

鉄は人生¹⁵のすべての国からの生物が必要とする必須栄養素である。脊椎動物では、鉄は、この要素によって引き起こされる毒性を避けるために隔離されている。この隔離はまた、栄養免疫¹⁶として知られている過程で微生物が侵入してくるから鉄を隠蔽する。応答では、病原体が栄養免疫を回避する戦略を進化させてきた。そのようなメカニズムの1つは、ホスト¹⁷内の鉄の最も豊富な源であるヘモグロビンに依存しています。ヘモグロビンは赤血球の中に含まれている。損傷した赤血球から放出されたヘモグロビンはマクロファージ¹⁸によりハプトグロビン-ヘモグロビン複合体の迅速な除去を通知ホストハプトグロビン、バインドされています。ヘモグロビンへのアクセスを得るために、S.ブドウ球菌は ¹⁹赤血球を溶解ヘモリジンを表現しています。ハプトグロビン誘起ヘモグロビン除去することによって発現される細胞表面受容体によってヘモグロビンの高親和性結合によって対抗さ S.黄色ブドウ球菌。黄色ブドウ球菌は、膜タンパク質を細胞壁タンパク質からそれを渡すことによっ...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
試薬/材料の名称	会社	カタログ番号	注釈
HPLCによる陰イオン交換カラム	バリアン	PL1551-3802
Drabkinの試薬	シグマ	D5941-6VL
ヘモグロビン標準	ポワント·サイエンティフィック	H7506-STD
RPMI	Hyclone社	SH30011.02
Chelex 100ナトリウム型	シグマ	C7901
EDDHA	LGC規格社	ANC 001
ヘモグロビン抗体	Santa Cruz Biotechnology社株式会社	SC-21005
トリプシン大豆寒天	BD	236920