複合体形成シグナリングT細胞のリアルタイムのライブイメージング

サマリー

我々は、T細胞活性化プロセスの間にタンパク質のダイナミクスについての洞察を提供して生細胞撮像方法を説明する。私たちは、定量的な結果は、T細胞活性化の全体の複合体形成のシグナルに従う得T細胞拡散アッセイ、共焦点顕微鏡と画像解析を組み合わせた使用法を示す。

要約

感染症に対する防御を、免疫系^1,2によって媒介される。 Tリンパ球は^、3,4、複数の免疫細胞の活性化および応答を調節、免疫系のマスターコーディネーターである。 T細胞活性化は、抗原提示細胞（APC）によって表示される特定の抗原の認識に依存する。 T細胞抗原受容体（TCR）は、各T細胞クローンに固有のもので、抗原特異性^5を決定します。抗原への結合は、TCR TCR複合体の成分のリン酸化を誘導する。 T細胞の活性化を促進するために、この信号は、TCRにシグナル伝達タンパク質の補充などの様々な重大な反応を開始する、膜から細胞質及び核に導入されなければならない。APCサイト（免疫シナプス）、それらの分子の活性化は、細胞骨格の再配列、細胞内カルシウム濃度の上昇、および遺伝子発現の変化^6,7。で正しい活性化シグナルのitiationと終了は、適切なT細胞応答のために重要です。シグナル伝達タンパク質の活性は、タンパク質-タンパク質相互作用の形成および終端に依存する、例えば、タンパク質リン酸化、タンパク質複合体、タンパク質のユビキチン化および種々の細胞のサイト⁸へのタンパク質の動員の形成などの翻訳後修飾を書き込む。 T細胞活性化プロセスの内部の仕組みを理解することは免疫学研究と臨床応用の両方に重要です。

種々のアッセイは、タンパク質 - タンパク質相互作用を調査するために開発されてきたが、そのような広く使用されている免疫共沈降法などの生化学的アッセイは、タンパク質の位置を識別することができないように、従って、細胞の動態に貴重な洞察の観察を排除メカニズム。さらに、これらのアッセイは、通常、バルク、tのさまざまな段階であるかもしれない多くの異なる細胞からのタンパク質を結合する彼は、細胞のプロセスを検討した。これは、時間分解能に悪影響を及ぼすことができます。生細胞のリアルタイムイメージングの使用は、従って、プロセス^9,10のダイナミクスに光を当て、タンパク質の空間時間的に追跡およびシグナル伝達事象を区別する能力の両方を可能にする。我々は、T細胞活性化の間のシグナル伝達複合体形成のリアルタイムイメージングの方法を提案する。一次T細胞又は例えばJurkat細胞などのT細胞ラインは、非生理的なオリゴマー^11を予防、単量体蛍光タンパク質に融合された関心のあるタンパク質をコードするプラスミドでトランスフェクトされる。フォトT細胞は、抗原特異的活性化の必要性を克服しながら、T細胞活性化を誘導し、CD3/TCR複合体に結合し、T細胞活性化抗体^8,9、カバースリップでプレコートされた上でドロップされる。活性化細胞は常に共焦点顕微鏡を用いて結像​​される。撮像データは、コルなどの定量結果を得るために分析されるシグナル伝達タンパク質のocalization係数。

プロトコル

1。 T細胞トランスフェクション

1. クレオソリューションにキットの "サプリメント"溶液を混合することによって活性化Amaxaヌクレオソリューションを準備します。活性化する溶液を4℃で3ヶ月までの℃で保存することができる。
2. [10％ウシ胎児血清（FCS）、1％ペニシリン - ストレプトマイシン溶液、及びRPMI中の2mMのL-グルタミン]培地でジャーカットT細胞を成長させる。最適には、細胞を1〜2週間解凍後に使用されるべきである。対数増殖中の細胞培養物を使用すると、高いトランスフェクション効率および細胞の生存に重要である。あるいは、わずかな修正で、このプロトコルは、前述し⁸のように、一次T細胞を使用することができる。これは、全体の一次T細胞の活性化プロセスの持続時間が長くジャーカットT細胞（〜30分）に比べて、顕微鏡ステージは、培養システムが搭載されていることを強調すべきであるCO _2を維持するために使用しなければならない、湿度および温度アクティベーションプロセス。
3. 5を収集15 mlチューブへのトランスフェクション当たり×10 ⁶対数期T細胞。
4. 400で7分×gで室温で細胞を遠心分離します。
5. 遠心分離の間に、6ウェルプレートを準備します。 5ミリリットルの培地でそれぞれのトランスフェクションのために1つのウェルを記入し、37℃でプレインキュベート℃に
6. 遠....

結果

我々は、ライブT細胞イメージングと解析例を提示する。撮像実験に先立ち、SLP76欠損T細胞（J14）は、蛍光タンパク質（ 図1）の発現を決定するために、FACSを用いて分析した。タグ付けされたシグナル伝達タンパク質mCFP-NckのSLP76と、mYFPでトランスフェクトしたT細胞を活性化するスライド上に堆積され、T細胞拡散（ 図2）の間に画像化した。収集された画像は、活性化します（ 図3）拡散を通してタンパク質の局在のダイナミクスを示す。コンピュータ化された画像処理、人間のバイアスを最小限に抑えながら、可視化細胞から新たな洞察や定量的な情報を提供します。細胞活性化プロセスを通じて2つのタンパク質の局在を調べるために、我々はImarisソフトウェア（ビットプレンAG、チューリッヒスイス）の局在ツールを利用した。撮像されたセル間の異なる時点間の共局在係数を比較することによって、我々はなかった NckのとSLP76の共局在は、T細胞活性化（P> 0.3）（ 図4）全体に大きく変化しないこと.......

ディスカッション

複数の細胞プロセスの制御と機能は、タンパク質 - タンパク質相互作用の形成および終了に依存する。顕微鏡イメージングは​​、生きている細胞内の蛍光標識タンパク質のリアルタイム追跡を可能にします。タグ融合タンパク質の共局在は、タンパク質間の直接的または間接的な相互作用を示唆することができ、例えば、免疫沈降などの生化学的方法によって得られた知見を補強するために使用することができる。生化学的方法とは異なり、生細胞イメージングでは、これらのタンパク質間相互作用が発生したときに、生理学的プロセスの監視を容易にし、タンパク質の細胞分布を検出し、空間的かつ時間をかけて観察することができる。共局在の定量分析のための様々なツールが開発されている。ピアソンの相関係数は、2つのタンパク質が^12〜共局在の程度の定量化のための非常に魅力的であり、広く利用可能な方法のままである。一方、蛍光共鳴電子NERGY移動（FRET）実験近接（10nm以下）ことを特徴とするタンパク質間相互作用の検出を可能にする、この方法は、特殊な設定（使用される蛍光タギング​​の機器との互換性）と複雑なデータ処理を必要とする。ほとんどの用途、局在解析のために、生化学的方法.......

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
試薬/材料
Amaxa ヒト T 細胞 nucleofector kit	Lonza	VCA-1002
Anti CD3 (UCHT1 clone)	BioLegend	300432
Falcon FACS Tubes	Becton Dickinson	352058
FCS	HyClone	SV30160.03
G418	Calbiochem	345810
ドイツのカバーガラスシステム4チャンバースライド	Lab-Tek II	155382
HCl	Bio Lab	8410501
Hepes	Biological Industries	03-025-1B
Hygomycin	Enzo	ALX-380-306
L-グルタミン	Sigma	G7513
PBS (10X)	Sigma	D1408
ペニシリン-ストレプトマイシン		Σ P0781
ポリ-L-リジン 0.1 % (w/v) in H2O	Sigma	P8920
RPMI	Σ	R87589
アジ化ナトリウム		Σ S2002
Equipment
Accublock デジタル ドライバス	Labnet	D1105A
遠心分離機	エッペンドルフ	遠心分離機 5810 R
共焦点顕微鏡	ツァイス	LSM 510 メタ
加熱式取り付けフレーム - 加熱インサート P S	PeCon	130-800-031
TempModule S (加熱式取り付けフレームに必要)	ツァイス	411860-9010-000
エレクトロポレーション装置	アマクサ	・ヌクレオフェクター I
蛍光活性化セルソーター	ベクトン・ディキンソン	FACSVantage SE
画像解析ソフトウェア	Bitplane	7.0.0