アストロサイトは、脳の正常な発達と機能、および中枢神経系の修復に欠かせない基本的な生物学的プロセスに参加して多目的な細胞であると認識されてきた。ここでは、中枢神経系細胞のこの主要なクラスの生物学を研究するために純粋なマウスアストロサイトの培養液を得るための迅速な方法を提示します。
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この記事について
サマリー
要約
アストロサイトは、哺乳類の脳に豊富に細胞型で、まだ多くのそれらの分子的および機能的特性について学んだことが残っている。 体外アストロサイト細胞培養系では詳細にこれらのグリア細胞の生物学的機能を研究するために使用することができます。このビデオプロトコルは仔マウスの混合皮質細胞の単離および培養により純粋アストロサイトを取得する方法を示します。法は生存ニューロンの欠如およびアストロサイト、オリゴデンドロサイトおよびミクログリア、文化の中枢神経系の3つの主要なグリア細胞集団の分離に基づいています。文化の最初の日中に代表的な画像は、混合細胞集団が存在することを実証し、アストロサイトがコンフルエントになるとミクログリア、オリゴデンドロサイトから分離する必要があるとき、時点を示しています。また、純度と十分に確立されたために免疫組織化学染色を用いて培養アストロサイトのアストロサイトの形態を示し、新たにアストロサイトのマーカーを説明した。この培養系は簡単に星状膠細胞生物学の様々な側面を研究するための純粋なマウスのアストロサイトおよびアストロサイト馴化培地を取得するために使用できます。
概要
アストロサイトは、中枢神経系（CNS）において非常に豊富な細胞型である。人間の大脳皮質のニューロン1あたり1.4アストロサイトが存在するのに対し、ニューロンへのアストロサイトの比率は、マウスおよびラットの大脳皮質で1:3である。アストロサイト機能に興味は近年劇的に増加している。アストロサイトの主な機能は、ニューロン2,3に構造的および代謝のサポートを提供する上で自らの役割である。アストロサイトのための新たに発見された役割は、機能の広いスペクトルをカバーしています。これらは、開発4月6日の間に開発の軸索と特定の神経芽細胞の遊走を誘導、シナプス伝達関数、神経回路7から9によるシナプス強度と情報処理、血液脳関門における役割（BBB）の形成10と整合性11月13日を含む脳血管トーン14と規制。アストロサイトのもう一つの大きな特徴は、傷害への応答です。 astrocyt病的条件下でES反応となり、さらに中間フィラメントグリア線維性酸性タンパク質（GFAP）と抑制性細胞外マトリックス（ECM）タンパク質15,16の発現をアップレギュレートする。反応性アストロサイトは、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（CSPG）家族のアストロ分泌ECMタンパク質、CNS損傷15から17の後に軸索の再生を阻害する主要な要因の主に構成されていますグリア瘢痕を形成することによって、健康な組織から損傷部位の境界を定める。
アストロサイトは後期胚発生および出生後の早い時期に放射状グリア（RG）の細胞に由来する。アストロサイトの仕様が発生した後、アストロサイト前駆体は、彼らは終末分化のプロセスを開始し、最終的な位置に移動する。 生体内では 、アストロサイトは彼らの典型的な形態18,19によって示されるように3〜4週間、出生後成熟したように見える。 RGの細胞の亜集団は、脳室下帯のアストロサイト（タイプB細胞）に変換します。 BOTH、RGとB型細胞はそれぞれ、開発中および成人におけるアストロサイトのような神経幹細胞（NSC）として機能します。アストロサイトと同様に、RGとB型細胞はまた、これらのマーカーはもっぱら特に成人星状膠細胞を標識するために使用できないことを示す、アストロサイト特異的グルタミン酸トランスポーター（GLAST）、脳脂質結合タンパク質（BLBP）、およびGFAPを発現している。健康な脳、RGとB型細胞では分裂しない大人実質アストロサイトとは対照的に、自己再生する能力のような幹細胞の可能性を示す。アストロサイトの異常は、アルツハイマー病20,21、ハンチントン病22、パーキンソン病23、レット症候群24とアレキサンダー病25を含む、数多くの病態に関与している。また、アストロサイトはアストロサイトの活性化とアストログリア瘢痕形成16,26につながる、CNSのすべての侮辱に反応します。以下の脳trを形成アストロサイトグリア瘢痕アウマまたは脊髄損傷は、神経再生15を防止プライム障壁であると考えられている。
細胞の精製された集団を分離し、維持するための信頼できる方法の開発は、神経系の我々の理解に不可欠となっています。マッカーシーとde Vellisによる先駆的な仕事は、新生児ラット組織27からアストロサイトのほぼ純粋な培養物を調製するためにこれまでに研究者を可能にします。多くはマウス大脳皮質アストロサイトを単離するためのわずかに修正された形でここに提示され、この方法を用いて、星状膠細胞生物学を学んだされています。 in vivo試験、アストロサイトと同様にin vitro培養で説明を使用して得られた馴化培地中で補完して、アストロサイト機能にさらなるゲイン洞察に貴重なツールです。
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プロトコル
1。混合皮質細胞の単離及びメッキ
星状膠細胞の培養のための混合皮質細胞の分離は、P4の仔マウスにP1を用いて行うことができる。適切なアストロサイト密度を達成するためには、T75組織培養フラスコあたり4マウス子犬皮質を使用する必要があります。したがって、次のプロトコル内のボリュームは4仔マウスを用いた細胞調製のために計算される。
- 解剖の手順を開始する前に、星状膠細胞培養培地のprewarm 30ミリリットル（DMEM、高グルコース+ 10％熱不活性化ウシ胎児血清+ 1％ペニシリン/ストレプトマイシン、表を参照してください）37℃ 37℃で1時間のための細胞培養グレードの水で50μg/ mlの濃度°CO 2インキュベーター中でCのポリ-D-リジン（PDL）の20mlで1コートT75フラスコ。
- 解剖の手順については、必要なすべての試薬および材料を準備します。次のものが必要となります外科用ハサミ、滑らかな細かい鉗子、フラットチップピンセット、紙タオル、ゴミ袋、70％エタノール氷の上のd 2解剖皿（3.5 cmの直径）が2 mlのHBSSそれぞれでいっぱい。
- 優しくホールドし、70％エタノールで仔マウスの頭と首をスプレーします。動物は、はさみを使用して断頭により屠殺されています。
- 頭蓋骨を明らかにするために頭皮に沿って前方に後方正中切開し、実行します。
- 首から鼻に慎重に頭蓋骨を切った。二つの追加カットは、脳へのさらなるアクセスを許可するために実行されます：最初のカットは、嗅球、頭蓋底から頭蓋を切断する小脳の劣る他の1の前方作られています。
- フラットチップピンセットを用いて、頭蓋のフラップはそっと側にフリップされ、脳を取り出し、HBSSで充填された第1解剖皿に置かれます。氷の上に戻って皿に置き、すべての4頭脳を収穫し続けています。
- 解剖手順の残りの部分は実体顕微鏡下で行われる。まず、嗅球、小脳は罰金を使用して除去される解剖用ピンセット（ 図1B）。
- 、皮質を取得微鉗子による脳の後端をつかむためには、半球の間の正中切開を行い、作成した木立に鉗子の2番目のセットを挿入し、剥がれから皮質の板状構造脳。
- 慎重に細かい鉗子（ 図1D '）で引いて皮質半球から髄膜を切開する。このステップでは、髄膜細胞および線維芽細胞による最終アストロ文化の汚染を避けることができます。 HBSSで充填された第2の皿に準備された皮質半球を移し、氷の上にそれを返します。全4皮質とそれに応じて続行します。
- 最後に、鋭い刃（約4〜8倍）を使用して小片に各皮質半球を切った。
- 無菌条件下で、1 50mlのFalconチューブに皮質の部分を転送し、22.5ミリリットルの総量にHBSSを追加します。
- 2.5％トリプシン、ミックスの2.5 mlを加え、インキュベート37℃の水浴中で組織℃で30分間。 10分毎に揺れ、時折混和する。
- ペレット皮質組織片を300×gで5分間遠心します。
- 慎重にデカンテーションにより上清を除去します。組織ペレットを失うことを避けるためには、機械的にそれはピペットを用いて保持することができる。組織片は単一の細胞（20〜30倍）に解離されるまで、10ミリリットルのプラスチックピペットを用いて10ミリリットルアストロメッキ媒体と活発なピペッティングを追加することによって、単一の細胞懸濁液に組織を解離する。アストロメッキ培地を用いて20mlに音量を調整します。あなたは、血球計数器を用いて計数することにより、単一細胞に証明皮質組織の解離をすることができます。 4マウス子犬皮質の一つ準備は10-15×10 6解離単一細胞が得られるはずです。
- T75培養フラスコからPDLを吸引し、プレートを37℃で解離単一細胞懸濁液とインキュベートし、CO 2インキュベーター内のC。
2。 ENRを取得ichedアストロ文化
- その後混合皮質細胞と全3日間のめっき後の培地2日を変更します。
- 星状膠細胞はコンフルエントとオーバーレイミクログリアアール星状膠細胞層に露出して座ったり、すでにアストロ層（ 図2）から切り離されて7から8日後、ミクログリアを削除するオービタルシェーカーで30分間180rpmでT75フラスコを振る。を含む上清を捨て、ミクログリアや、文化に希望とミクログリアを調べる場合は、それをスピンダウンと文化28,29用のプレート。
- 20ミリリットル新鮮なアストロサイトの培養液を追加し、オリゴデンドロサイト前駆細胞（OPC）を除去するために6時間240rpmでフラスコを振って続行します。いくつかのOPCは完全にアストロ層からデタッチされませんので、OPCの汚染を防止するために1分間手で激しく振り続けています。あなたは文化OPCの29にしたい場合、上清を捨てるか、またはそれをスピンダウンし、プレート。
- 残りconflueをすすぐPBSで2回NTアストロ層、PBSを吸引除去し、37℃のCO 2インキュベーター中で5ミリリットルトリプシン-EDTAとインキュベートを追加℃に星状膠細胞の剥離を5分毎にチェックして、あなたの手の手のひら（2-3倍）に対してフラスコを押すことで、星状膠細胞の剥離を施行。
- 星状膠細胞を培養フラスコから切り離された後、5分間180 xgで星状膠細胞の培養培地5ml、スピンセルを追加し、上清を吸引し、40 mlの新鮮なアストロメッキmediumを加えてください。一つT75組織培養フラスコは、最初の細胞分裂後、6×10の周りの細胞が得られるはずです。 37℃で2 T75培養フラスコとインキュベートで細胞をプレート°CO 2インキュベーター内のC。 2〜3日ごとに培地を変更します。
- 最初の分割アストロサイトは、実験を行う前に、適切な細胞濃度は24〜48時間でメッキされて12から14日後。一つT75組織培養フラスコは、第2のセル分割後1.5から2×10 6個の細胞の周りが得られるはずです。
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結果
完全なマウス脳（ 図1A）、小脳、嗅球の分離の際（ 図1B）が除去されなければならない。皮質は、マウス脳幹（ 図1C）と個々の皮質（ 図1D '）の髄膜の剥離し慎重に（ 図1E）は削除されます。髄膜は、硬膜動脈系と髄膜の細胞や線維芽細胞による最終アストロサイト培養の汚染の除去が不完全の結果は明白です。
混合皮質の細胞懸濁液をメッキした後、いくつかのアストロサイトはすでに24時間（ 図2A）内で培養フラスコに取り付けます。培養培地は、グリア細胞の生存と成長に有利に働くしかし、細胞培養上清は、最初の3〜5日間（ 図2A-C）を細胞の破片や瀕死のニューロンが含まれています。一度アストロサイトはコンフルエントとミクログリアアールastrocytに露出座るE層は、通常、混合皮質細胞の単離後7日目に、星状膠細胞（ 図2D）
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ディスカッション
ここに概説された方法は、もともと1980年に27マッカーシーとde Vellisによって記述げっ歯新生児の脳からアストロサイトの培養準備に基づいています。生後P1からP4をマウス脳に皮質星状膠細胞の分離と培養の変法は速いここに提示された、純粋な一次星状膠細胞を生み出す、再現性の高いです。この手法は、簡単にこのようなラットやブタ由来や脊髄などの他の脳領域からなどの他の種からアストロサイトを分離するために転送することができます。マッカーシーとdeVellis法による新生児の脳からアストロサイト前駆細胞の分離は非常に増殖細胞を生成するのに対し、出生後のP1〜P4の仔マウスの単離されたアストロサイトの細胞増殖および伝播は限定されています。分割アストロサイトはかつて、in vitroで 7日（DIV）で、コンフルエントと成熟に成長していきます。 生体内では後、ほとんどの星状細胞増殖は、P14〜32でほぼ完了です。彼再び、我々は孤立した星状細胞の成熟した表現型を確実にするために一日21から28のDIV（図2F）での実験のためにアストロサイトを使用することをお勧めします。...
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開示事項
特別な利害関係は宣言されません。
謝辞
1442キロバイトと欧州委員会のFP7のグラントPIRG08-GA-2010から276989、NEUREX、そしてドイツ研究財団助成SCHAにSS、教育研究連邦省（BMBF 01 EO 0803）にFazit財団大学院フェローシップでサポートされている/ CS 3-1〜著者らは相反する経済的利益を持っていません。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| ワーキングソリューションの名前 | 会社 | カタログ番号 | 最終濃度 |
| 星状膠細胞培養培地 | |||
| DMEM、高グルコース | ライフテクノロジーズ | 31966-021 | |
| 熱不活性化FBS、 | ライフテクノロジーズ | 10082-147 | 最終濃度：10％ |
| ペニシリン - ストレプトマイシン | ライフテクノロジーズ | 15140-122 | 最終濃度：1％ |
| 脳組織の発掘のためのソリューションestion | |||
| HBSS | ライフテクノロジーズ | 14170-088 | |
| 2.5％トリプシン | ライフテクノロジーズ | 15090-046 | 最終濃度：0.25％ |
| その他 | |||
| 70％（vol / vol）のエタノール | ロート | 9065.2 | |
| ポリ-D-リジン | ミリポア | -003-E | 50μg/ mlの |
| 水 | PAA | S15-012 | 細胞培養グレード |
| PBS | PAA | H15-002 | 細胞培養グレード |
| 0.05％お試しくださいpsin-EDTA | ライフテクノロジーズ | 25300-062 | |
| 0.45μmの滅菌フィルター | 縫工筋 | 16555 | |
| 3.5センチメートルシャーレ | BDファルコン | 353001 | |
| 15mlファルコンチューブ | BDファルコン | 352096 | |
| 50mlのFalconチューブ | BDファルコン | 352070 | |
| 75cm 2の組織培養フラスコ | BDファルコン | 353136 | |
| 細かい鉗子、 | デュモン | 2から1032まで、2から1033まで | ＃3cは、第5 |
| 鉗子、フラットチップ | KLSマーティン | 12-120-11 | |
| 13センチメートル手術用のハサミ | AESCULAP | BC-140-R | |
| 実体顕微鏡 | ライカ | MZ7.5 | |
| 実体顕微鏡+カメラ | ライカ | MZ16F; DFC320 | |
| 顕微鏡+カメラ | ツァイス、キヤノン | プリモヴェール、のPowerShot A650 ISを | |
| 遠心 | エッペンドルフ | 5805000.017 | Centrifuge5804R |
| オービタルシェーカー | サーモサイエンティフィック | SHKE 4450-1CE | MAXQ 4450 |
| 水浴 | JULABO | SW20、37℃ |
参考文献
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