マウス大脳皮質アストロサイトの単離および培養

サマリー

アストロサイトは、脳の正常な発達と機能、および中枢神経系の修復に欠かせない基本的な生物学的プロセスに参加して多目的な細胞であると認識されてきた。ここでは、中枢神経系細胞のこの主要なクラスの生物学を研究するために純粋なマウスアストロサイトの培養液を得るための迅速な方法を提示します。

要約

アストロサイトは、哺乳類の脳に豊富に細胞型で、まだ多くのそれらの分子的および機能的特性について学んだことが残っている。 体外アストロサイト細胞培養系では詳細にこれらのグリア細胞の生物学的機能を研究するために使用することができます。このビデオプロトコルは仔マウスの混合皮質細胞の単離および培養により純粋アストロサイトを取得する方法を示します。法は生存ニューロンの欠如およびアストロサイト、オリゴデンドロサイトおよびミクログリア、文化の中枢神経系の3つの主要なグリア細胞集団の分離に基づいています。文化の最初の日中に代表的な画像は、混合細胞集団が存在することを実証し、アストロサイトがコンフルエントになるとミクログリア、オリゴデンドロサイトから分離する必要があるとき、時点を示しています。また、純度と十分に確立されたために免疫組織化学染色を用いて培養アストロサイトのアストロサイトの形態を示し、新たにアストロサイトのマーカーを説明した。この培養系は簡単に星状膠細胞生物学の様々な側面を研究するための純粋なマウスのアストロサイトおよびアストロサイト馴化培地を取得するために使用できます。

概要

アストロサイトは、中枢神経系（CNS）において非常に豊富な細胞型である。人間の大脳皮質のニューロン¹あたり1.4アストロサイトが存在するのに対し、ニューロンへのアストロサイトの比率は、マウスおよびラットの大脳皮質で1:3である。アストロサイト機能に興味は近年劇的に増加している。アストロサイトの主な機能は、ニューロン^2,3に構造的および代謝のサポートを提供する上で自らの役割である。アストロサイトのための新たに発見された役割は、機能の広いスペクトルをカバーしています。これらは、開発^4月6日の間に開発の軸索と特定の神経芽細胞の遊走を誘導、シナプス伝達関数、神経回路^7から9によるシナプス強度と情報処理、血液脳関門における役割（BBB）の形成¹⁰と整合性^{11月13日を}含む脳血管トーン¹⁴と規制。アストロサイトのもう一つの大きな特徴は、傷害への応答です。 astrocyt病的条件下でES反応となり、さらに中間フィラメントグリア線維性酸性タンパク質（GFAP）と抑制性細胞外マトリックス（ECM）タンパク質^15,16の発現をアップレギュレートする。反応性アストロサイトは、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（CSPG）家族のアストロ分泌ECMタンパク質、CNS損傷^15から17の後に軸索の再生を阻害する主要な要因の主に構成されていますグリア瘢痕を形成するこ....

プロトコル

1。混合皮質細胞の単離及びメッキ

星状膠細胞の培養のための混合皮質細胞の分離は、P4の仔マウスにP1を用いて行うことができる。適切なアストロサイト密度を達成するためには、T75組織培養フラスコあたり4マウス子犬皮質を使用する必要があります。したがって、次のプロトコル内のボリュームは4仔マウスを用いた細胞調製のために計算される。

1. 解剖の手順を開始する前に、星状膠細胞培養培地のprewarm 30ミリリットル（DMEM、高グルコース+ 10％熱不活性化ウシ胎児血清+ 1％ペニシリン/ストレプトマイシン、表を参照してください）​​37℃ 37℃で1時間のための細胞培養グレードの水で50μg/ mlの濃度°CO ₂インキュベーター中でCのポリ-D-リジン（PDL）の20mlで1コートT75フラスコ。
2. 解剖の手順については、必要なすべての試薬および材料を準備します。次のものが必要となります外科用ハサミ、滑​​らかな細かい鉗子、フラットチップピンセット、紙タオル、ゴミ袋、70％エタノール氷の上のd 2解剖皿（3.5 cmの直径）が2 mlのHBSSそれぞれでいっぱい。
3. 優しくホールドし、70％エタノールで仔マウスの頭と首をスプレーします。動物は、はさみを使用して断頭により屠殺されています。
4. 頭蓋骨を明らかにするために頭皮に沿って前方に後方正中切開し、実行します。
5. 首から鼻に慎....

結果

完全なマウス脳（ 図1A）、小脳、嗅球の分離の際（ 図1B）が除去されなければならない。皮質は、マウス脳幹（ 図1C）と個々の皮質（ 図1D '）の髄膜の剥離し慎重に（ 図1E）は削除されます。髄膜は、硬膜動脈系と髄膜の細胞や線維芽細胞による最終アストロサイト培養の汚染の除去が不完全の結果は明白です。

混合皮質の細胞懸濁液をメッキした後、いくつかのアストロサイトはすでに24時間（ 図2A）内で培養フラスコに取り付けます。培養培地は、グリア細胞の生存と成長に有利に働くしかし、細胞培養上清は、最初の3〜5日間（ 図2A-C）を細胞の破片や瀕死のニューロンが含まれています。一度アストロサイトはコンフルエントとミクログリアアールastrocytに露出座るE層は、通常、混合皮質細胞の単離後7日目に、星状膠細胞（ 図2D）

ディスカッション

ここに概説された方法は、もともと1980年に²⁷マッカーシーとde Vellisによって記述げっ歯新生児の脳からアストロサイトの培養準備に基づいています。生後P1からP4をマウス脳に皮質星状膠細胞の分離と培養の変法は速いここに提示された、純粋な一次星状膠細胞を生み出す、再現性の高いです。この手法は、簡単にこのようなラットやブタ由来や脊髄などの他の脳領域からなどの他の種からアストロサイトを分離するために転送することができます。マッカーシーとdeVellis法による新生児の脳からアストロサイト前駆細胞の分離は非常に増殖細胞を生成するのに対し、出生後のP1〜P4の仔マウスの単離されたアストロサイトの細胞増殖および伝播は限定されています。分割アストロサイトはかつて、in vitroで 7日（DIV）で、コンフルエントと成熟に成長していきます。 生体内では後、ほとんどの星状細胞増殖は^、P14〜32でほぼ完了です。彼再び、我々は孤立した星状細胞の成熟した表現型を確実にするために一日21から28のDIV（図2F）での実験のためにアストロサイトを使用することをお勧めします。.......

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ワーキングソリューションの名前	会社	カタログ番号	最終濃度
			星状膠細胞培養培地
DMEM、高グルコース	ライフテクノロジーズ	31966-021
熱不活性化FBS、	ライフテクノロジーズ	10082-1​​47	最終濃度：10％
ペニシリン - ストレプトマイシン	ライフテクノロジーズ	15140-122	最終濃度：1％
			脳組織の発掘のためのソリューションestion
HBSS	ライフテクノロジーズ	14170-088
2.5％トリプシン	ライフテクノロジーズ	15090-046	最終濃度：0.25％
			その他
70％（vol / vol）のエタノール	ロート	9065.2
ポリ-D-リジン	ミリポア	-003-E	50μg/ mlの
水	PAA	S15-012	細胞培養グレード
PBS	PAA	H15-002	細胞培養グレード
0.05％お試しくださいpsin-EDTA	ライフテクノロジーズ	25300-062
0.45μmの滅菌フィルター	縫工筋	16555
3.5センチメートルシャーレ	BDファルコン	353001
15mlファルコンチューブ	BDファルコン	352096
50mlのFalconチューブ	BDファルコン	352070
75cm 2の組織培養フラスコ	BDファルコン	353136
細かい鉗子、	デュモン	2から1032まで、2から1033まで	＃3cは、第5
鉗子、フラットチップ	KLSマーティン	12-120-11
13センチメートル手術用のハサミ	AESCULAP	BC-140-R
実体顕微鏡	ライカ		MZ7.5
実体顕微鏡+カメラ	ライカ		MZ16F; DFC320
顕微鏡+カメラ	ツァイス、キヤノン		プリモヴェール、のPowerShot A650 ISを
遠心	エッペンドルフ	5805000.017	Centrifuge5804R
オービタルシェーカー	サーモサイエンティフィック	SHKE 4450-1CE	MAXQ 4450
水浴	JULABO		SW20、37℃