構造研究のためのジスルフィド安定化膜貫通ペプチド複合体の生産

サマリー

膜に埋め込まれたタンパク質ドメイン間の相互作用の生物物理学的および生化学的研究は多くの技術的課題は、適切な教材を入手されているの最初に直面しています。この記事では、ソリューションの核磁気共鳴（NMR）およびその他の分析アプリケーションによる構造解析に適しているジスルフィド安定化膜貫通ペプチド複合体を製造し、精製するためのプロトコルについて説明します。

要約

膜タンパク質の脂質埋αヘリックスドメイン間の物理的相互作用は、膜タンパク質複合体のフォールディングおよびアセンブリに、このような膜貫通（TM）シグナリングと細胞表面のタンパク質レベルの規制などの動的過程において重要な役割を果たしています。特定の配列の関連付けを駆動する構造的特徴を理解することは、TMのペプチド複合体の洗練された生物物理学的および生化学的解析を必要とします。しかし、TMドメインの極端な疎水性は、標準的なペプチド化学の技術を使用して操作するためにそれらを非常に困難にし、適切な勉強材料の​​生産は、多くの場合、法外にやりがいを証明している。ペプチドは、安定した螺旋状のコンフォメーションとフォーム複合体を採用することができる条件を特定することは、 自発的に難易度のさらなるレベルを追加します。ここで我々は、 大腸菌で発現される材料からホモまたはヘテロ二量体のTMペプチド複合体を製造するための手順を紹介鞍部私は、このように比較的安価に核磁気共鳴（NMR）やその他のアプリケーション用の非天然アミノ酸のための安定同位体標識の取り込みを可能にします。この方法で重要な技術革新は、TM複合体が生成され、洗剤、脂質又は他の膜模倣材料に再構成したとき、安定した化学量論的で均質な構造を形成することができる共有結合 （ジスルフィド架橋）アセンブリのように精製されていることである。我々はまた、単一のTMドメインまたは架橋錯体を生成するかどうかも同様に適用可能であり、新しいTMシーケンスにこれらのメソッドを適応させるためのアドバイスを提供発現および精製のために慎重に最適化された手順を紹介します。

概要

このプロトコルは、細部私達は溶液NMRを用いた構造研究のための膜貫通（TM）ペプチドのジスルフィド安定な錯体を生成するために開発した手順を実行します。手順は、ΔtrpLE1413融合システムによってもたらされる堅牢な表現を利用しています（下記参照）と定義された組成のTMペプチド複合体は、現代の多次元NMR実験のために洗練された安定同位体標識技術を使用して生成することができます。私たちは、リンパ球活性化免疫受容体が（最近¹日）は、TMドメイン間の相互作用を介して複数の膜タンパク質サブユニットから組み立てられる方法に関する重要な新情報が明らかになったいくつかのNMR構造を決定するためにこれらの技術を採用してきた。これらの技術は、他の多くの膜タンパク質のシステムだけでなく、溶液NMRに加え下流の分析方法の広い範囲に適用されます。ここに示す例では、ネイティブのシステイン残基を利用している間自然にジスルフィド結合タンパク質を模倣する複合体を作成するために、デザインを使用しても同様に、通常、そのようなホモとのヘテロ二量体TM複合体として弱く、非共有結合性相互作用によって一緒に保持されている複合体を安定化するために設計されたジスルフィド結合を作成するのに最適です上皮成長因子受容体（EGFR）ファミリータンパク質^2-4またはヘテロαβインテグリン錯体^5,6。

そのようなTMのタンパク質の脂質二重膜貫通部分に由来するもののような非常に疎水性のペプチド配列は、生化学的および生物物理学的研究のために非常に困難な課題である。標準タンパク質およびペプチド化学技術を用いて操作することは非常に困難であることに加えて、彼らはしばしば細胞に非常に有毒であり、したがって、組換え的に生成することは困難である。我々 ^7,8と他人^9-11カルボキシ末端フレームのような細菌で、このような困難なペプチド配列を発現させる重要な成功を収めている大腸菌由来ΔtrpLE1413シーケンスの修正版への融合大腸菌trpオペロン^12。この配列によってコードされるポリペプチドtrpLE〜13 kDaのは、T7プロモーターの下で高いレ​​ベルで製造することができると完全に毒性および/または不安定性に関連する問題が回避され、封入体に局在する。 trpLE配列からアミノ末端9 -ヒスチジンタグ¹³と内部メチオニンおよびシステイン残基の除去¹⁴許さtrpLE-ペプチド融合体は、金属イオンアフィニティークロマトグラフィーにより精製し、臭化シアン（CNBrを使用して消化するの添加による配列の改変）は、所望のペプチド配列を解放します。我々は、正常に、最大4つのTMのドメインを（;また、ディスカッションのセクションを参照してください^7,8および未発表の結果）が含まれている膜タンパク質の断片を表すtrpLE融合としてダース以上の異なる配列を発現させるためにこのシステムを使用している。

ザこのプロトコルでは鍵の技術革新は、構造化されていないと非常に難溶性trpLE-TMの融合を効率的に合理化されたワークフローのコンテキスト内でジスルフィド架橋することができる条件の同定である。高収量の発現、取扱い及びペプチド生成物の精製のいくつかの側面も徹底的に最適化されており、ここに示した推奨事項は、非ジスルフィド架橋（モノマー）TMペプチド製品の生産のために均等に関連しているされています。

プロトコル

1。クローニングおよびコンストラクトのデザイン

HindIIIとBamHI制限部位を用いて、PMM-ペプチドベクター（リクエストに応じて提供することができます）（ 図1参照）に興味のある配列をクローン。 ;のCNBr切断のための単一のメチオニンコドン、E. HindIII部位：二本鎖DNAの挿入は、次の順序で、取り入れるべきコード配列を大腸菌コドン最適化ペプチド;終止コドン、BamHI部位。ペプチド内の他のすべてのメチオニンは排除されるべきであり、それはまた、酸性条件下で切断されるように、ジペプチドシーケンスASP-PROは避けるべきである。

ユニークなシステイン残基は最終的な複合体のジスルフィド架橋の所望の位置に応じて、各ペプチド配列中に導入されるべきであり、他のすべてのシステインがセリンに変異されるべきである。プラスミドは、選択のためのカナマイシン耐性カセットを運ぶ。

2。 trpLE-peptiの発現デフュージョン

1. メイクアップし、無菌フィルターM9/Kan最小成長培地（0.1 mMのCaCl _2、2mMのMgSO _4を 、3グラム/ L KH ₂ PO _4、7.5グラム/ LのNa ₂ HPO _{4·2H 2} O、0.5グラム/ LのNaCl、 1g / LのNH _{4 Clを} 、4g / Lのグルコース、50mg / Lの硫酸カナマイシン）。セントラムとサプリメントはビタミンB群や微量金属を提供するために亜鉛を完了して下さい：30分間混合しながら40ミリリットルのH ₂ Oに1錠を溶かし、不溶性物質及び無菌フィルターオレンジ上清を除去するために遠心分離する。 2週間までとM9で4ミリリットル/ Lを使用して、暗所で4℃で保存原液。
   注：必要に応じて¹⁵ N濃縮NH _{4 Clを} ^、13 C濃縮グルコースまたは他の安定同位体で標識された前駆体は、この段階では、M9培地に含まれるかもしれません。
2. 新たに形質転換されたBL21（DE3）株Eから100ミリリットルスターター培養液を接種M9/Kan培地中で大腸菌 。 200rpmで振とうしながら37℃で一晩増殖。
3. 翌朝、スターター培養物のOD _600を確認-これは2以上の範囲でなければならない。セントラム-M9培地1Lの総量に100ミリリットルスターター培養液を希釈します。 2 2Lのバッフル付きフラスコ（各フラスコ内の500mlの培養）に分割して、37で成長℃のOD _600が 0.6に達するまで、140 rpmで振とう。
4. ℃と文化が誘導前に完全に冷却させ、1時間振とうし続けて18にシェーカーの温度を設定します。
5. （OD ₆₀₀ = 1で培養液から50μlの同等品）、SDS-PAGE分析のための事前誘導サンプルを採取し、trpLE-ペプチド融合の発現を誘導し0.1mMの最終濃度になるようにIPTGを加え。 18°IPTG誘導下で一晩C/140回転（16-20時間）で成長し続けています。

3。封入体の調製およびニッケルマトリックスバインディング

1. 最少培地で一晩発現培養の最終OD _600は、変数と笙です自民は2.5と5.0の間である。 SDS-PAGE分析のためのサンプルを取る（OD ₆₀₀ = 1で培養液から50μlの同等品）と5000×gで20分間遠心して細胞を回収します。
2. 再懸濁した細胞ペレットを50mlの溶解緩衝液（50mMトリス-HCl pH 7.5、20mMのβ-ME、0.2MのNaCl）で1リットルの培養液から。細胞懸濁液は、後の処理のために凍結保存することができます。
3. 5分間氷上で1分間、残りの最大出力時の氷上で超音波処理により細胞を溶解する。我々は、½インチ高輝度交換可能なチップとMisonixソニケーター3000（最大出力600ワット）を使用します。 3サイクルの超音波処理/冷却を繰り返します。
4. 20,000 xgで15分間遠心分離して不溶性の封入体（IB）の材料を収集し、上清を捨てる。明るい色の細胞破片の緩い、薄層は緻密IBペレットの上に表示されることがありますが、これは、穏やかに攪拌しながら水または緩衝液を用いて洗い流すことができる。ステップ3.3および3.4​​は、IB画分の純度を向上させるために繰り返すことができる場合デジ赤。ペレットと上清材料の試料を封入体にtrpLE-TM融合局在を確認するために、SDS-PAGE分析のために取られるべきである。
5. 処理された培養液1リットル当たり25〜50ミリリットルを用いて、グアニジン溶液（6M塩酸グアニジン、50mMのトリス-HCl pH 8.0、200mMのNaCl、1％トリトンX-100、5mMのβ-ME）のIBペレットを溶解する。このステップでは、撹拌、時折穏やかな超音波処理して数時間を必要とするでしょう。
6. 75,000-100,000 xgで1時間遠心分離によりIBのライセートをクリアして、20℃ 0.2μmの膜を介して上清とフィルタをデカントします。
7. 50 mlコニカルチューブでクリアIBライセート、または水とグアニジン溶液に平衡で洗浄されたニッケルアフィ​​ニティー樹脂で、しっかりと閉じることができる大きな容器を兼ね備えています。 trpLE-DAP12TMます（ 図3、レーン2）ここに示されているように同程度に表現を融合に処理された培養液1リットル当たり3〜4ミリリットル沈殿した樹脂を使用しています。部屋トンで一晩インキュベートすることにより、バッチ·バインド穏やかに混合しながらemperature。

4。オンカラム酸化架橋

1. ボリューム全体が流れるまで連続的に追加して、多孔質の床支持を持つ空の重力流列にIBの溶解物/ニッケル樹脂懸濁液をロードします。収集し、まだ結合していない融合タンパク質が含まれている場合があり素通りし、脇に置く。
2. 5mMのβ-MEを含む尿素溶液の5ベッド容量（8M尿素、50mMのトリス-HCl pH 8.0、200mMのNaCl）で重力流によってニッケル樹脂を洗浄します。
3. β-MEをせずに尿素溶液の5ベッドボリュームで再びニッケル樹脂を洗浄します。
4. ニッケル樹脂の酸化グルタチオン、20μMのCuSO ₄および2mMを補充された尿素溶液の5ベッドボリュームで三回目を洗ってください。この洗浄後、カラム出口を閉じて最大のジスルフィド結合の形成を可能にするために、室温で30分間インキュベートする。

5。 TFAの溶出および定量

コンテンツ"> 注意：トリフルオロ酢酸（TFA）が皮膚と接触すると、重度の火傷を引き起こし、煙は非常に刺激性がある濃縮TFAが眼の保護と非ラテックス手袋を使用して、承認され化学ドラフト内でのみ使用されるべきであるすべての化学的適合性をチェックします。材料の使用、ポリプロピレンは、このプロトコルのすべてのステップに対応しています。

1. 水10ベッドボリュームで酸化尿素溶液を洗い、カラム出口に真空ラインを適用することにより、カラム床を乾燥させてください。
2. カラム出口を閉じて、きちんとした（99から100パーセント）TFAの1.5ベッドボリュームを追加します。酸にさえ露出を確保し、5分間インキュベートするための小さなスパチュラでニッケル樹脂をかき混ぜる。カラム出口を開き、すべての液体を押し出すために必要に応じて注射器や圧縮空気ラインで軽く圧し、酸溶出液を集める。
3. きちんとしたTFAのさらに1.5ベッドボリュームと酸溶出ステップを繰り返します。 beadeの完全な溶解を回避するために、この段階で迅速に作業Dアガロースマトリックス。タンパク質収量はランバート - ベールの法則とtrpLEペプチド配列の理論モル吸光係数によれば、この時点で決定することができます。トリフルオロエタノール中のTFA溶出液（1:20〜1:50）（TFE）のサンプルを希釈し、ブランクと同じ希釈でのTFA / TFEを用いて、280nmの吸光度を測定します。

6。のCNBr消化

注意：臭化シアン（CNBr活性）は非常に有毒であり、承認された薬品はドラフト内でのみ扱われるべきである。安全メガネ、白衣、非ラテックス手袋などのPPEは絶対に必要です。 CNBrでは水分に反応性であり、開口部の前に室温に戻しておいてください。中和/ CNBrで汚染されたソリューションや物質の廃棄方法については、お使いの制度上の安全のオフィスへお問い合わせください。

1. 穏やかに混合しながら水を滴下して80％のTFAの最終濃度になるように酸溶出液を希釈します。沈殿物が形成した場合は、ddは戻ってきちんとしたTFAの小さな体積（0.5〜1ml）の溶液を水で80％に再正しいその後、明確になるまで。液体窒素で凍結し、直ちに試料を凍結乾燥、SDS-PAGE分析のための5μlのプレダイジェストサンプルを取る。
2. クローズド、予め秤量管で安全に有毒化学物質の重量を量るために世話をして、または化学ヒュームフード内バランスを使用して、約0.2グラム/ mlまでのCNBr結晶を追加します。完全に溶解するまで静かに混和します。洗ったあと、不活性ガス（窒素やアルゴン気流）の下で、反応容器を密封し、光から保護し、室温で3〜4時間インキュベートする。
3. SDS-PAGE解析のために5μlのポストダイジェストサンプルを取るとフリーズし、直ちに凍結乾燥。予想されるペプチド複合体の大きさに応じて、3.5 10kDa以下の分子量カットオフを有する再生セルロース透析カセットやチューブ（セルロースアセテート濃酸に溶解する）にダイジェスト反応を転送します。で水4Lに一晩透析TFA濃度を減少させ、未反応のCNBr活性を分解する化学ヒュームフード。一晩透析中にボリュームが大幅に増加（同じくらい2〜3倍など）の透析カセットやチューブ内の空きスペースを残しておきます。
4. 透析カセットやチューブから中断した沈殿物（TFA濃度が減少したときにタンパク質のほとんどが沈殿する）で透析した反応溶液を除去し、50 mlコニカルチューブに懸濁液を移す。凍結と水CNBR / TFAの痕跡を除去する凍結乾燥。このステップは数日を要する可能性があります。
   注意：この透析ダイジェスト反応、透析水の両方が有毒で、適切な予防措置で配置/処理済みとして扱われることを継続する必要があります。
5. プリ誘導や収穫の段階、封入体上清とペレット、TFA溶出液とCNBr活性消化された物質からの文化の試料をSDS-PAGEによって分析することができる。 95加熱することにより試料を調製インビトロジェンNuPAGE LDS sampl℃·電子バッファー。 TFA溶出液とダイジェストのサンプルが酸化架橋の製品識別と評価を容易にするために還元および非還元の両方の条件で準備する必要があります。
6. 最小ダイジェスト製品の最適な解像度のMES-SDS泳動緩衝液を用いて12パーセントNuPAGEビス - トリスプレキャストアクリルアミドゲル上でサンプルを分離します。

7。ジスルフィド架橋ペプチド複合体の逆相HPLC精製

1. 溶媒（典型的には10〜20％のアセトニトリルまたは5に分取スケール（21.2×150 mm）をAgilentのZORBAX SB-300、C3 PrepHT分カラムに2〜3ミリリットル端正なギ酸及び負荷に凍結乾燥されたダイジェストの製品の100 mgまで溶かす0.1％TFAを含む水でイソプロパノール-10％）。
2. 少なくとも5カラム容量以上の溶媒Bの勾配（0.1％TFAを含むアセトニトリル又はイソプロパノール）でダイジェスト製品を溶出します。異なるペプチド配列に対する最適勾配条件の選択についての提案のための議論を参照してください。
3. 取るSDS-PAGE分析及び凍結用の各HPLC画分を50から100μlのサンプルと直ちに凍結乾燥。 HPLCの溶媒の除去は急速であり、1〜2時間で完了しなければなりません。
4. ノー還元剤とインビトロジェンNuPAGE LDSサンプルバッファーで95℃に加熱することにより、SDS-PAGEのために凍結乾燥のHPLCサンプルを準備します。それらのいずれかに100mMのDTTを追加し、再加熱簡潔に、クールと2マイクロ遠心チューブに均等に各サンプルを分割します。
5. MES-SDSは、上記のようにバッファを実行していると12パーセントNuPAGEビス - トリスプレキャストアクリルアミドゲル上で還元および非還元HPLCのサンプルを分離します。小さな疎水性ペプチドはしばしばうまく染まるクマシーを取らないとその期待される分子量で実行されない場合があります。しかし、還元および非還元試料の比較は、架橋ペプチド製品および純度の査定の識別を容易にする必要があります。
6. マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型（MALDI-TOで候補ペプチドを含有する画分を分析F）の質量分析（説明を参照）興味の種を同定し、その予想される質量を確認する。
7. 組み合わせ、純粋な、架橋TMペプチド複合体を含むHPLC画分を凍結し、凍結乾燥し、収量を決定するために、最終製品の乾燥重量を取る。高いイソプロパノール含量を有する画分は、冷凍のままではないかもしれません。ペプチド画分は、純粋なヘキサフルオロイソプロパノール（HFIP）少量の完全に再溶解するフィルムは、フィルムではなく、ふわふわした凍結乾燥品まで凍結乾燥して、再度凍結乾燥した場合。 HFIP処理物は簡単にひっくり返して秤量する小さな白い円錐形にする必要があります。

結果

trpLE融合に達成発現のレベルは、変数および接続されたペプチドのアミノ酸配列に大きく依存しています。 図3に示すプレ誘導のSDS-PAGE分析（レーン1）とTime-of-収穫（レーン2）文化の1リットルと4ミリリットルのニッケルマトリックスからの純粋な、無傷trpLE-DAP12TM融合の約120 mgを得た培養物からのサンプル。上清（レーン3）とは対照的に、trpLE-DAP12TM融合のすべてが封入体ペレット（レーン4）に局在していた。

ニッケル精製trpLE-DAP12TM融合の約70％がダイマー（：TFA溶出液の非還元および還元サンプル図3、レーン5および6）にジスルフィド架橋であった。これはtrpLE-DAP12TM融合のための典型的な結果であるが、架橋効率は、操作されたシステインの配置によって異なります。 DAP12TMペプチド製品は、合計のCNBrダイジェ​​ストサンプル（レーン7と8）で容易に識別できませんは低下ダイジェストサンプル（レーン8）内にそのまま融合とtrpLE断片のバンドを比較する...

ディスカッション

trpLE-TM融合の発現は我々の経験では、trpLE-TM融合が不十分37℃で豊かな培養培地中で表現され、ここに記載の培養条件は、利回りが及ぶと一から四、TMドメインを含有する多くの異なるシーケンスのために成功した証明した50〜150ミリグラム/純粋、無傷の融合のL。 3つまたは4つのTMのGPCRの断片（それぞれヒトCCR5 TM1〜TM3とTM4-TM7、）またはヒトシグナルペプチドペプチダーゼのコア触媒断片（4 TMのドメイン; refは^15を参照）をコードする融合体は、式のこの範囲内の最低を表すレベルは、密接に配列に関連DAP12TM変種が範囲（未発表データ）の最高の終わりを表してここで使われている。最適なIPTG濃度は、それぞれの新しいシーケンスのために実験的に決定されるべきである。当社の標準は0.1 mmであり、高濃度（1mmまで）は通常による低い発現レベルと下位文化密度の両方に有意に減少し収量をもたらすトンの収穫（参考⁷の例図1Aを参照のこと）。

提示プロトコ...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
試薬/材料の名称	会社	カタログ番号	注釈
臭化シアン	アルドリッチ	P.No-C91492、CAS-506-68から3	有害物質。危険貨物。猛毒吸入、飲み込んだり皮膚に接触したり。酸と接触すると、非常に有毒なガスを発生する。水生生物に非常に有毒で、水生環境に長期にわたり悪影響を与える恐れがあります。
トリフルオロ酢酸	シグマアルドリッチ	P.CODE-1000984387、CAS番号76-05-1	有害物質。危険物とは。、重度の火傷を起します。吸入すると有害。水生生物に対して有害、水生環境中で長期にわたり悪影響を与える恐れがあり。
2 - メルカプトエタノール	シグマアルドリッチ	P.No M7154、CAS番号60-24-2	有害物質。危険貨物 。吸入、皮膚に接触すると飲み込むと有毒。皮膚を刺激する。眼に重傷のおそれ。皮膚接触により感作を引き起こすことがあります。水生生物に非常に有毒で、水生環境に長期にわたり悪影響を与える恐れがあります。
1,1,1,3,3,3 - ヘキサフルオロ-2 - プロパノール	シグマアルドリッチ	製品番号52512、CAS番号。 920-66-1	有害物質。危険貨物 。吸入すると有害と飲み込む。火傷を起します。
ギ酸	メルク	K41186564	引火性の高い液体および蒸気。重篤な皮膚の薬傷·眼の損傷。
尿素	Univarのは、AJAXファインケム	製品番号、817、CAS番号57-13-6	加熱され、12月二酸化炭素とアンモニアにomposes;燃やした場合、窒素酸化物の少量を発する。発赤、皮膚や目の炎症を引き起こすことができます。
塩酸グアニジン	Amresco	P.No-M110、CAS番号：50-01-1	飲み込むと有害、重篤な眼の炎症を起こす、皮膚の炎症、急性毒性経口、皮膚刺激、眼刺激を引き起こす。
TRITON X-100	SIGMA	製品番号T8532-CAS番号：9002-93-1	トリトンX-100は、非イオン性界面活性剤、しばしばタンパク質を可溶化するために生化学的な用途で使用される100％の活性成分である。トリトンX-100は抗菌特性を持っていない、比較的軽度の非変性洗剤を考慮
彼のセレクトニッケルアフィ​​ニティーゲル	シグマアルドリッチ	カタログのNum-P6611	IS-セレクトニッケルアフィ​​ニティーゲルは、固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィー（IMAC）製品です。 HISセレクトニックエルアフィニティゲルは特にヒスチジン含有タンパク質を結合するように設計されているニッケルで起訴ビーズアガロース上で独自の四座キレートである。
（ - ） - グルタチオン、酸化された	シグマアルドリッチ	カタログNUM 150568
Misonix S-3000ソニケーター	QSONICA	S-3000（販売終了）	最大出力600ワット。 2インチ交換可能なチップ·プローブは、2インチの高輝度、高ボリュームのヒントや、高輝度、低ボリュームのヒントの範囲をとります。この会社の現在利用​​可能な最も近いモデルは、Q500とQ700です。
RP-HPLC：生物学的DuoFlowクロマトグラフィーシステム、ソフトウェアバージョン5.3	バイオ·ラッドラボラトリーズ	カタログヌム760-0047は、Configいいえ：AU500571、シリアル番号：484BR3705	ペプチドは高い水溶液に相HPLCカラムを逆に結合するueous移動相と高有機移動相でのRP HPLCカラムから溶出される。 RP HPLCでペプチドは、疎水性の特徴に基づいて分離されています。ペプチドは、有機溶剤の直線勾配を実行することによって分離することができる。
プレップHT C3 ZORBAX 300SB-分析用HPLCカラム、21.2×150 mmの5μmの粒径	アジレント	製品番号：895150から909	逆相HPLCコラム
NuPAGE 12パーセントBis-Trisゲル	ライフテクノロジーズ	NP0341BOX	タンパク質電気泳動のための事前キャストゲル
スライド-A-アナライザG2の透析カセット、3.5K MWCO	サーモサイエンティフィック	製品番号：87724	サンプル透析