出芽酵母の老化複製の連続高分解能顕微鏡観察

Summary

ここではそれらの完全な複製および/または時系列の寿命の間に単一の出芽酵母細胞の連続的かつ高分解能顕微鏡イメージングを可能にするマイクロ流体装置の動作を説明する。

Abstract

我々は、単一出芽酵母細胞は、それらの全体の寿命にわたって追跡することができるという簡単なセットアップマイクロ流体の使用を実証する。マイクロ流体チップはmicropadsの配列を使用して母と娘細胞間の大きさの違いを利用する。 micropadとカバーガラスとの間の距離は、酵母細胞（3-4ミクロン）の直径に類似しているため、ロード時に、細胞は、これらのmicropadsの下に閉じ込められている。ローディング手順の後、培地を継続的に小さいサイズのためにパッドの下に保持されない新興の娘細胞、うち定数と定義された実験全体を通して環境だけでなく、フラッシュを作成するだけでなく、チップを通してフラッシュされます。セットアップはとても効率的に50個々の細胞まで、単一の実験では5日の完全に自動化された方法で監視されたり、必要であれば、長くすることができ母細胞を保持します。また、チップの優れた光学特性が高いことができ全体の老化のプロセスの間に細胞の分解能イメージング。

Introduction

出芽酵母は、研究^1のエージングのための重要なモデル生物である。最近、酵母細胞の老化複製を勉強するまで、各芽を手動母細胞^2,3から削除された解剖の方法を必要とする骨の折れるプロセスであった。この問題を解決するために、我々は、最近、それらの全体の寿命にわたって⁴個々の母細胞を追跡することができる新規なマイクロ流体セットアップを提示した。

我々のマイクロ流体チップでは、酵母細胞は、エラストマーベースのソフトmicropads（ 図1参照）の下に閉じ込められている。媒体の連続的な流れは、離れて、新たに形成された娘細胞を洗浄し、新鮮な栄養素を細胞を提供する。単一の実験では、最大50の母細胞は、彼らの全体の複製寿命を通して完全に自動化された方法で監視できます。マイクロ流体チップの優れた光学的性質のために、それは同時に、酵母細胞生物学のさまざまな側面（ 例えば、監視することが可能であるの蛍光タンパク質）を用いて。

古典的な解剖の方法に比べ、マイクロ流体セットアップはかなりの利点を提供します。それは全体の高齢化実験中に定義された、一定の環境を確保します。それは高価な特殊な機器を必要とせず、自動焦点と時間経過の能力だけでなく、細胞培養のための温度制御を搭載し....

Protocol

1。シリコンウェーハモールドの生産と準備

マイクロ流体チップは、ソフトリソグラフィーによって生成されたシリコンウェハ型から作成される。これらのウェーハは、マイクロ流体チップを製造するために何回も再使用することができる。それはそれぞれのウェハの製造はマイクロフルイディクス⁶に特化した基により行われることが望ましい。

ウェハはネガ型フォトレジスト二つの異なる層、SU-8 ^7を用いた2段階フォトリソグラフィ工程で行われる。チャネルは、最上層（;高さ10μmのSU-8 2010）で作られているのに対し、;底層が細胞捕捉領域（高さ3-4μmのSU-8 2002）を生成するために使用される。ウェハ製造プロセスの印象がHuang ら ⁸に見出すことができる。マイクロ流体チップの図面は著者と同様に、それぞれのウェーハを取得する方法についてのアドバイスから得ることができる。

1. ウェハが得られると、タフタグintの一枚をカットメスと入口チャネルとmicropad配列（ 図2A）との間のチャネル構造の上にわずかにウェハ上に慎重に置きますと3ミリメートルで約0.5mmのO薄いストリップ。これは、セルのロード中に使用されることはありませんそれぞれのチップに大きな追加チャネルの形成をもたらすが、マイクロ流体デバイス....

Results

このプロトコルでは、細胞を直接中間指数培養物からマイクロ流体チップにロードされる。マイクロ流体チップに捕捉された細胞の年齢分布をロードする前培養と同様であるか否かを確認するために、細胞芽傷を可視化するためにFITCに抱合小麦凝集素（WGA-FITC）で染色した。 図3に見られるように、マイクロ流体チップのmicropads下での細胞の捕捉は、特定の年齢の細胞に付勢されていない。

複製寿命が単に単一母細胞によって産生される芽の数をカウントすることによって決定することができる。このデータは、生成さ芽数に対する生存細胞の割合をプロットすることによって寿命曲線に変換される。例えばKaeberlein らによって行われるような統計的検定^は 、 ^図9には 、異なる実験からの寿命のデータを比較するために使用することができる。 図4は、寿命曲線の一例を示しているWT BY4741酵母株と2変異体（SIR2Δ、FOB1Δ）で得られた。 .......

Discussion

ここで説明したマイクロ流体の方法は、それが継続的な高分解能イメージングとの組み合わせで酵母複製寿命データのシンプルかつ自動生成を可能にするような研究を老化の重要な新しいツールです。これらの属性は、古典的な解剖法の実験的な可能性の上に大きな改善ですが、まだ考慮する必要がある方法のいくつかの制限があります。

micropad下に保持し、すべてのセルは、チップ（ 例えば、隣接セルの出芽細胞はそれから離れてプッシュすることができるから洗い流されるべき一定の確率があります決定複製寿命が母細胞の保持の効率性の影響を受ける可能性があることに注意してくださいmicropad）​​。セルの統合された確率が増加寿命と増加を洗い流すことができます。これにより、短命の細胞は長命細胞よりも洗い流される前に、そのライフサイクルを完了した可能性が高い。実際、同様のリチウム fespanデータは、古典的なマイクロダイセクション法^11-13と同様にマイクロ流体セットアップ⁴で生成された無関係ではない場合は、この潜在的な問題は、わずかであるこ.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENTS
>DC Sylgard 184エラストマーMavom	bv	1060040	このパッケージには、PDMSベースとPDMS硬化剤が含まれています。
ガラスシャーレ 120/20 mm	VWR インターナショナル	391-2850
カバーグラス 22x40 mm	CBN Labsuppliers BV	190002240
タフタグ	シグマ-アルドリッチ	Z359106
アルミホイル
プラスチック使い捨てカップ
セロロジカルピペット 5 ml	VWR インターナショナル	612-1245
ッチテープ	VWRインターナショナル	819-1460
ベイシロンペースト(GEバイエルシリコーン)	シグマアルドリッチ	85403-1EA
PTFEマイクロボアチューブ、0.012インチID x 0.030インチOD	コールパー	マーEW-06417-11	と呼ばれる細いチューブ
タイゴンマイクロボアチューブ、0.030インチID x 0.090インチOD	コールパー	マーEW-06418-03	太いチューブと呼ばれる
	VWR インターナショナル	233-5334
50 ml ルアーロック シリンジ	BD	300137
5 ml シリンジ、ルアー チップ	VWR インターナショナル	613-1599
ピンセット	VWR インターナショナル	232-2132
20 ゲージ ルアー スタブ	Instech Solomon	LS20
シリンジフィルター(細孔径0.20 μm)	Sigma-Aldrich	16534K
ステンレス製カテーテル プラグ、20 ga x12 mm	Instech Solomon	SP20/12
シャーレ	VWR International	391-0892
EQUIPMENT
>Benchtop UV-Ozone クリーナー	NOVA Scan	PSD-UVT
ハーバード ポンプ 11 エリート	ハーバード装置	70-4505
SU-8シリコンマスターモールド(ウェーハ)			自作。詳細については、責任著者にお問い合わせください
バランス	ザルトリウスコーポレーション	ED4202S
真空ポンプ	KNF ノイバーガー	N022 AN.18
デシケーター	VWR インターナショナル	467-2115
ホットプレート	VWR インターナショナル	460-3267
オプション: カバーガラス用メタルホルダー (22x40 mm)			自力;詳細については、責任著者
(蛍光)顕微鏡、60倍対物レンズ、オートフォーカス、タイムラプス機能、できれば自動(電動XY制御)ステージNikon		Eclipse Ti-E