マウス心房と心室の心筋細胞における分離とKvチャンネル録音

サマリー

KVチャネル機能不全は、心臓不整脈に関連付けられています。我々はKvをチャネルの補助サブユニットのノックアウトマウスからの心房と心室の心筋細胞を単離するための体系的なプロトコルを利用するような不整脈を引き起こす分子メカニズムを研究するために。隔離された心筋細胞は、その後すぐに携帯電気生理学的研究、生化学的または免疫蛍光法（IF）のアッセイのために使用することができます。

要約

KCNE遺伝子は、それらの機能的特性を変更するためにKvをチャネルαサブユニットとヘテロ複合体を形成したKvチャネルの補助サブユニットの小さな家族のためにエンコードします。 KCNE遺伝子の変異は、QT延長症候群および/または心房細動などの不整脈を有する患者で発見されている。しかし、これらの疾患につながる正確な分子病態は不明なままである。以前の研究では、これらの遺伝子に変異を引き起こす疾患の電気生理学的特性は、主に異種発現系において研究されてきたと報告された影響が直接ネイティブ心筋細胞に変換することができれば、我々は確認することはできません。私たちの研究室では、したがって、異なるアプローチを使用しています。我々は可視化実験誌のこの号で記述する独特の技法-我々は、直接細胞電気生理学によってノックアウトマウスから単離した心筋細胞におけるKCNE遺伝子欠失の影響を研究する。 geneticaから心LLY KCNE組み換えマウスが急速に大動脈カニュレーションにより摘出し、ランゲンドルフ装置に搭載されている。心筋内の遊離Ca ^{2 +が} EGTAによってバインドされており、心筋細胞の解離は、次に特化した低Ca ^{2 +を}含むバッファーコラゲナーゼと冠状動脈の逆行灌流することによって達成される。心房、右心室自由壁と左心室は、その後、顕微技術によって分離することができる。カルシウムは、その後徐々に洗浄操作を構成する複数のステップで孤立した心筋細胞に戻されます。ノー自発収縮との健全な外観の心房と心室の心筋細胞は、その後直ちに分離後の最初の6時間以内にパッチクランプ法や他の生化学的解析により電気生理学的解析に供される。

プロトコル

1。動物の麻酔と臓器摘出

1. ケタミン（200 mg / kg体重）及びキシラジン（20 mg / kg体重）の腹腔内（ip）注射によりマウスをAnaesthetize。
2. anticoagulateする血液凝固および血栓形成を避けるために250 IUのヘパリンipを注入します。
3. 深い昏睡状態に到達するまで反射消失を特徴とする、待つ。そっと尾つまんで角膜やテスト飛行反射をタッチすることで反射消失、角膜反射テストで確認するには。
4. 手術台の上にマウスを移し、仰臥位で固定してください。
5. 皮膚や剣状下腹壁を切開し、二つ折りの開胸を行います。肋骨弓に沿って両側にカットを伸ばし、その後内側腋窩線のリブをカットし、胸郭を上方に偏向させる。
6. 、心を開き、大血管の位置を確認します。優しく良い大動脈を表示するために心臓の尾を押してください。ピンセットを用いて大動脈をクランプします。
7. sのペアの凹部に心を置く cissorsと1シングルカットと接続しているすべての血管を解剖する。ランゲンドルフカニュレーションのため上行大動脈の十分な大きさの部分を維持することを確認します。
8. 冷たい氷とプリoxygenized溶液1（ソリューションについては、 表1を参照）を充填したシャーレに直ちに摘出した心臓を転送します。

2。ハートとランゲンドルフ灌流の調製

1. 1.8F鋼カニューレと大動脈カニューレを挿入。空気塞栓を避けるようにしてください。
2. 溶液1の1ミリリットルと外科用縫合糸とフラッシュ冠状動脈と大動脈カニューレ上を固定します。
3. ランゲンドルフ装置でカニューレを接続します。
4. 胸からランゲンドルフ挿管までの時間が心筋に長時間虚血/再灌流傷害を避けるために120秒を超えないようご注意ください。
5. Ca ^{2 +}の10mlの灌流心臓^{+ freeの}溶液2（4ミリリットル/分）。
6. 8分間（4 ml /分）のコラゲナーゼ溶液3を灌流心臓。

心腔のLE "> 3。顕微解離

1. 低Ca ^{2 +}溶液4を含む予め温めておいた100mmのペトリ皿に心を移す。
2. 慎重にはさみで大動脈弁および他の非心臓組織を除去し、それを捨てる。
3. 別個の心房と心室とは別に、各チャンバに進みます。溶液4に浸細胞を維持。少量（未満5ミリリットル）を使用してください。

4。心筋細胞のさらなる解離

1. 心房心筋：
   1. 個別化する心房心筋細胞は別あらかじめ温めておいた100mmの培養皿に心房を転送し、優しく細かい鉗子でそれを引き離すを通して組織を解離させる。組織のほぼ完全解離を確認します。
   2. 5分間溶液5を1mlの細胞を中断するには拡大されたファイアーポリッシュプラスチックピペットチップで1mlのピペットを使用しています。
   3. セルフィルター（200μmのメッシュサイズ）を使用して、破片から細胞を分離。
   4. 5 mlの細胞懸濁液への解決策5、室温で16×gで2分間遠心分離器を追加します。
   5. 次の手順は、細胞培養、ボンネットの下に運営されています。上清を捨て、溶液6 5mlにペレットを再懸濁する。
   6. 15 mlのチューブに10分間、重力によって沈降した後、室温で16×gで1分間遠心します。上清を取り除きます。溶液6の1-5 mlにその量に応じて細胞を再懸濁する。
2. 心室心筋細胞：
   1. 溶液4の5ミリリットルの微細鉗子との利害の左心室領域を解剖。
   2. ほとんどの細胞が分離されるまで、ゆっくりピペッティングにより細胞を一時停止します。 50 mlチューブに（200μmのメッシュサイズ）フィルタリング後に細胞溶液を移し、25ミリリットルの容量を追加します。
   3. 室温で16×gで2分間遠心分離します。
   4. 次の手順は、細胞培養、ボンネットの下に運営されています。上清を除去し、25 mlにペレットを再懸濁溶液6と10分間細胞の沈降が可能になります。
   5. 細胞をカウントし、上清を除去し、25を追加 - 50ミリリットルの溶液6を細胞に。

5。細胞電気生理学、生化学的またはIF研究のための心筋細胞の調製

1. 電気生理学的研究のために、50 mlチューブに溶液6の心筋細胞を維持し、沈降を抑制する。
2. ラミニンコート細胞培養ディッシュ（最終濃度PBS中に20μg/ mlのラミニン）の生化学的研究、 例えばカルシウムイメージング、板筋のために。
3. 免疫蛍光染色用ガラスカバースリップとラミニン溶液（最終濃度PBS中で50μg/ mlのラミニン）でコーティングを有する細胞培養皿プレートを準備します。
   1. メッキ筋前に溶液を除去します。顕微鏡を用いて、プレート細胞と対照細胞密度。
   2. _2％CO 2中37℃で1時間のスリップ℃をカバーするために筋細胞が付着してみよう、溶液を除去および標準染色手順プロトコルで直ちに開始します。
   3. 室温で10分間、PBS中の固定剤、 例えば、4％PFA（pH7.5）を用いてインキュベートし、5分間ごとに3 PBSでの洗浄工程に従ってください。
   4. 細胞を透過すると非特異的結合抗体が10％血清、0.3％トリトン、室温で30分間、PBS中の0.2％BSAを用いて心筋細胞をインキュベート阻害する。
   5. 37℃で1時間のために一次抗体とインキュベート℃、前述したように洗ってください。
   6. 室温で1時間、二次抗体とインキュベートします。核を対比染色し、α-アクチニン使用DAPI蛍光色素と共役ファロイジン（のAlexa Fluor 488、Invitrogen）に。
   7. 洗浄後、ガラスカバーが蛍光封入剤でシラン処理された顕微鏡スライドとembed細胞上に慎重に滑る移す。

6。細胞の電気生理学

1. 周波数にホールセルパッチクランプ記録を行うshly室温で心房と心室の心筋細胞を単離した。
2. 外浴溶液の定義されたボリュームでいっぱい灌流チャンバーに健康現れる心筋細胞を移す。 117 mMのNaCl、4mMののKCl、1mMのKH ₂ PO _4、4mMのNaHCO _3を 、1.7 mMのMgCl _2、3mMののCoCl _2、10mMのHEPES、10mMグルコース、0.02 mMのテトロドトキシン（TTX）、液（pH7.4） 。 pH値調整のためNaOHを使用してください。
3. 適切なパッチクランプ装置（ すなわち IX71倒立顕微鏡、Multiclamp 700Bアンプ、pClamp10.3ソフトウェア（Molecular Devices）を持つDigidata 1440A収集システムとPC）を使用します。
4. 130のKCl、2mMのMgCl _2、11mMのHEPES、11mMのEGTA、5mMののNa ₂のATP、0.4mMの硫酸_{ナトリウム} 、GTP、5mMののNa ₂ CPを含む細胞内液で満たされたときMΩ3-5の抵抗とパッチピペットを使用して、および4.9 mMのCaCl _2（pH7.2）で。 pH値調整のためにKOHを使用します。
5. 外向きK +電流デュを呼び起こす20ミリ秒、-40 mVにプレパルス後に70mVの保持電位から10 mV刻みで-60から+50 mVの電位をテストするためのリングは4.5秒の電圧ステップ。
6. リーク電流は常に<100 pA以下であることを確認します。
7. 、Heteropodatoxin 2（HpTx2; Alomone）やテトラエチルアンモニウム（TEA;シグマ）;異なるK +電流は、4 - アミノピリジン（ICNバイオメディカル、アーバイン、カリフォルニア州、米国の4-AP）などの特異的阻害剤を使用するの解離ストック溶液は、細胞外浴溶液で調製し、 "ベースライン"のレコーディング後にマイクロチップを介して細胞のできるだけ近い付近に直接適用されるべきである。平衡化は "薬物"のレコーディングの前に2〜3分間認められるべきである。
8. 分析のためのセルサイズに個々の細胞（全細胞膜容量）の電流振幅を正規化します。 pClamp10.3ソフトウェア（Molecular Devices社）または同等のソフトウェアを使用して、オフラインのデータを分析します。

結果

in vitroでの関心のある特定の遺伝子の機能を研究するために遺伝子組み換えマウスから成体マウスの心筋細胞の単離は、さらに心臓の病態生理を理解するための強力なツールとなっています。このメソッドは現在、世界中で基本的な科学研究室の唯一の小さいながらも増加によって使用されています。しかし、成体マウス心室の心筋細胞の単離は、トリッキーなことが、経験豊富な手で徹底的に繰り返し行われる必要があることができます。 図1は、新たに単離した模範心房と心室の心筋細胞を示しています。心室の心筋細胞のために私達は唯一のノー自発収縮との健全な外観の棒状、横紋心室筋細胞を使用することをお勧めします。心室筋細胞と比べて、心房筋細胞は短く、薄くしている。心室の心筋細胞の特性ストライと棒状は成人心房マウス心筋細胞に欠けている。単離された心室心筋の収率そのままマウスの心臓から^5×5 - ^{1×10 6。}心房心筋細胞にとっては、かなり少なくなります。 1マウスの心臓から25000心房細胞 - 我々は一般的に約5隔離することを期待しています。一旦単離されると、心筋細胞は電気生理...

ディスカッション

遺伝子欠失に関連する心機能と心臓の病理を研究する遺伝子改変マウス系統の成長発展に伴い、in vitroで特定の遺伝子欠失の影響を研究するための特殊なメソッドへの関心の高まりもある。我々の研究室では、心臓の再分極にKvをチャネルの補助サブユニットのファミリーの役割を研究しています。 KCNE遺伝子はヒト心室と心房の再分極^{11日、15日}に重要な役割を果たしている5つの遺伝子（KCNE1-5）のファミリーを含む。KCNEsが自分で任意のカリウム電流を渡すことができない単一の膜貫通ドメインたKvチャネルの補助サブユニットであるが、彼 ​​らがすることができますたKvチャネルαサブユニットと複合体を形成し、大幅にそのような細胞内のゲーティング、コンダクタンス、薬理学および人身売買としての機能特性を調節する。例えば突然変異とKCNE2における共通の多型が継承され、取得したフォームOに関連付けられているfはQT延長症候群^{（LQTS）1、16。}

パイオニア異なるのK...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
試薬の名称	会社
テトロドトキシン	Alomone
4 - アミノピリジン	ICNバイオメディカル
Heteropodatoxin 2	Alomone
テトラエチルアンモニウム	シグマケミカル
コラゲナーゼタイプ2	ワージントン