マウス心房と心室の心筋細胞における分離とKvチャンネル録音

サマリー

KVチャネル機能不全は、心臓不整脈に関連付けられています。我々はKvをチャネルの補助サブユニットのノックアウトマウスからの心房と心室の心筋細胞を単離するための体系的なプロトコルを利用するような不整脈を引き起こす分子メカニズムを研究するために。隔離された心筋細胞は、その後すぐに携帯電気生理学的研究、生化学的または免疫蛍光法（IF）のアッセイのために使用することができます。

要約

KCNE遺伝子は、それらの機能的特性を変更するためにKvをチャネルαサブユニットとヘテロ複合体を形成したKvチャネルの補助サブユニットの小さな家族のためにエンコードします。 KCNE遺伝子の変異は、QT延長症候群および/または心房細動などの不整脈を有する患者で発見されている。しかし、これらの疾患につながる正確な分子病態は不明なままである。以前の研究では、これらの遺伝子に変異を引き起こす疾患の電気生理学的特性は、主に異種発現系において研究されてきたと報告された影響が直接ネイティブ心筋細胞に変換することができれば、我々は確認することはできません。私たちの研究室では、したがって、異なるアプローチを使用しています。我々は可視化実験誌のこの号で記述する独特の技法-我々は、直接細胞電気生理学によってノックアウトマウスから単離した心筋細胞におけるKCNE遺伝子欠失の影響を研究する。 geneticaから心LLY KCNE組み換えマウスが急速に大動脈カニュレーションにより摘出し、ランゲンドルフ装置に搭載されている。心筋内の遊離Ca ^{2 +が} EGTAによってバインドされており、心筋細胞の解離は、次に特化した低Ca ^{2 +を}含むバッファーコラゲナーゼと冠状動脈の逆行灌流することによって達成される。心房、右心室自由壁と左心室は、その後、顕微技術によって分離することができる。カルシウムは、その後徐々に洗浄操作を構成する複数のステップで孤立した心筋細胞に戻されます。ノー自発収縮との健全な外観の心房と心室の心筋細胞は、その後直ちに分離後の最初の6時間以内にパッチクランプ法や他の生化学的解析により電気生理学的解析に供される。

プロトコル

1。動物の麻酔と臓器摘出

1. ケタミン（200 mg / kg体重）及びキシラジン（20 mg / kg体重）の腹腔内（ip）注射によりマウスをAnaesthetize。
2. anticoagulateする血液凝固および血栓形成を避けるために250 IUのヘパリンipを注入します。
3. 深い昏睡状態に到達するまで反射消失を特徴とする、待つ。そっと尾つまんで角膜やテスト飛行反射をタッチすることで反射消失、角膜反射テストで確認するには。
4. 手術台の上にマウスを移し、仰臥位で固定してください。
5. 皮膚や剣状下腹壁を切開し、二つ折りの開胸を行います。肋骨弓に沿って両側にカットを伸ばし、その後内側腋窩線のリブをカットし、胸郭を上方に偏向させる。
6. 、心を開き、大血管の位置を確認します。優しく良い大動脈を表示するために心臓の尾を押してください。ピンセットを用いて大動脈をクランプします。
7. sのペアの凹部に心を置く cissorsと1シングルカットと接続しているすべての血管を解剖する。ランゲンドルフカニュレーションのため上行大動脈の十分な大きさの部分を維持することを確認します。
8. 冷たい氷とプリoxygenized溶液1（ソリューションについては、 表1を参照）を充填したシャーレに直ちに摘出した心臓を転送します。

結果

in vitroでの関心のある特定の遺伝子の機能を研究するために遺伝子組み換えマウスから成体マウスの心筋細胞の単離は、さらに心臓の病態生理を理解するための強力なツールとなっています。このメソッドは現在、世界中で基本的な科学研究室の唯一の小さいながらも増加によって使用されています。しかし、成体マウス心室の心筋細胞の単離は、トリッキーなことが、経験豊富な手で徹底的に繰り返し行われる必要があることができます。 図1は、新たに単離した模範心房と心室の心筋細胞を示しています。心室の心筋細胞のために私達は唯一のノー自発収縮との健全な外観の棒状、横紋心室筋細胞を使用することをお勧めします。心室筋細胞と比べて、心房筋細胞は短く、薄くしている。心室の心筋細胞の特性ストライと棒状は成人心房マウス心筋細胞に欠けている。単離された心室心筋の収率そのままマウスの心臓から^5×5 - ^{1×10 6。}心房心筋細胞にとっては、かなり少なくなります。 1マウスの心臓から25000心房細胞 - 我々は一般的に約5隔離することを期待しています。一旦単離されると、心筋細胞は電気生理.......

ディスカッション

遺伝子欠失に関連する心機能と心臓の病理を研究する遺伝子改変マウス系統の成長発展に伴い、in vitroで特定の遺伝子欠失の影響を研究するための特殊なメソッドへの関心の高まりもある。我々の研究室では、心臓の再分極にKvをチャネルの補助サブユニットのファミリーの役割を研究しています。 KCNE遺伝子はヒト心室と心房の再分極^{11日、15日}に重要な役割を果たしている5つの遺伝子（KCNE1-5）のファミリーを含む。KCNEsが自分で任意のカリウム電流を渡すことができない単一の膜貫通ドメインたKvチャネルの補助サブユニットであるが、彼 ​​らがすることができますたKvチャネルαサブユニットと複合体を形成し、大幅にそのような細胞内のゲーティング、コンダクタンス、薬理学および人身売買としての機能特性を調節する。例えば突然変異とKCNE2における共通の多型が継承され、取得したフォームOに関連付けられているfはQT延長症候群^{（LQTS）1、16。}

パイオニア異なるのK.......

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
試薬の名称	会社
テトロドトキシン	Alomone
4 - アミノピリジン	ICNバイオメディカル
Heteropodatoxin 2	Alomone
テトラエチルアンモニウム	シグマケミカル
コラゲナーゼタイプ2	ワージントン