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Summary

前立腺の感染は、慢性前立腺炎における骨盤痛を媒介する要因かもしれません。我々は時間をかけて、マウスにおける接触性アロディニアを測定するための雄マウスと方法論の尿道への細菌の点滴、標準化された細菌の接種物の調製のための手順を記述している。

Abstract

尿路病原性大腸菌 （UPEC）は、尿路感染症や細菌性前立腺炎¹に重要な役割を果たしている病原体である。我々は最近、UPECは、慢性骨盤痛^2、慢性前立腺炎/慢性骨盤痛症候群（CP / ^CPPS）3,4の機能の開始に重要な役割を持っていることが示されている。臨床的に関連UPECによる前立腺の感染は、組織の損傷および自己免疫のメカニズム⁵の開始を含むことができるメカニズムを介して慢性痛を開始し、確立することができます。

前立腺内UPECの病因を理解するための課題は、操作に前立腺の相対的な到達不能です。我々は、それによって前立腺の上行性感染を確立雄マウスにUPECの臨床株を提供するために前述の尿道感染症法^6を利用^した 。ここでは、BAを標準化するための私達のプロトコルを記述cterial接種⁷と同様に細菌の点滴のために麻酔雄マウスをcatheterizingするための手順。

CP / CPPSは主に触覚アロディニア⁴の存在によって特徴付けられる。動作テストは呼ば内臓痛^8-10起因する皮膚の痛覚過敏の概念に基づいていた。内臓組織における過敏焦点は通常非痛み刺激（アロディニア）に誇張された応答を可能にする皮膚の疼痛閾値を低減します。基盤となる内臓痛の強度に伴って増加する傾向がある異常反応で皮膚の結果に垂直力の応用。我々はUPEC細菌を持つ単一の感染に応答して時間をかけて接触性アロディニアを定量化するためのvon Frey繊維を利用したNOD / ShiLtJマウスでの方法論を記述する。

Protocol

1。マウス接種のための細菌の準備

以下は無菌条件下で行わなければなりません。

1. キャップで1 17×100mmのポリプロピレンチューブを取り、新鮮なルリア培地（LB）培地3 mlを加える。オートクレーブしたチップを使用して、ひずみCP1 ²の一部凍結細菌のグリセロールストックを取り、LB培地を含むチューブに培養液の少量を転送します。酸素がまだ管を入力することができるように、チューブのキャップを交換します – 文化は好気的条件下で成長する必要がある。で37箇所管℃で一晩220rpmで振盪インキュベーターのC。
2. 翌日、3 mlのLB培地で新しいチューブに一晩培養した培養液の5μlを転送し、37℃で一晩インキュベーター内の静的条件下で増殖
3. 40mlのLB培地それぞれを含むAA 50mlチューブに培養液40μlの3日目の転送で。一晩37℃のインキュベーター内で静的な場所。
4. 電源をオンにして、4℃に遠心分離機を設定一度遠心機が最終温度に達しており、40ミリリットルナルゲン遠心管にそれぞれ40 mlの培養液を移す。
5. LB培地で音量を調整して、必要に応じて – 遠心分離機のバランスをとるためにチューブの重量を量る。 20分間6,000 rpmでチューブを軽くスピン。
6. 上清を慎重に除去し、穏やかに40ミリリットル滅菌PBSに細菌ペレットを中断します。
7. PBSでステップ1.5を繰り返します。
8. 上清を吸引除去し、500μlの滅菌PBS中の細菌を一時停止。 1.5 mlのマイクロチューブに溶液を移します。懸濁液10μlを取り、氷冷したPBS 990μlに希釈します。接種に必要な量を決定するために、OD _{420 nmを}読み取るために分光光度計を使用しています。の適切な音量を決定するために、氷冷PBSでペレットを一時停止するには：外径_{420 nmの番号} （mlで）に乗り、細菌ペレット[元の推定量を減算します。 ODを_420nmで = 0.545、ペレット約0.075ミリリットル。 0.545から0.075 = 0.470]。
9. 細菌懸濁液10μlを取り出して、ディ990μlの氷冷PBSでリュート。 OD _{420 nmを}お読みください。目標は1.000±0.010希釈懸濁液のOD _{420 nmの}値を達成することです。あなたの希釈の数がこの目標を上回っている場合、懸濁液に複数のボリュームを追加し、別の値を読み取ります。数が0.990を下回っている場合は、懸濁液をスピンダウンし、所望の読み取り値を取得するまで、外径_{420 nmの}読みを繰り返す。

2。動物の感染症

マウス（5から7週齢、グループ当たり10）はジャクソン研究所（バーハーバー、メイン州）から購入した。

1. マウスはプレキシグラス室におけるイソフルラン1〜4％の吸入により麻酔し、リカンベントまで監視されています。
2. 一度マウスはガラスハミルトンシリンジ（1.5〜2.0センチメートルの長さ）の変更された30gの針に取り付けポリエチレン（PE10）カテーテルとカテーテル法によって細菌の点滴のために取られています。カテーテルは針のハブに挿入されます。マウスはplacですedは麻酔下で背側表面にノーズコーンを使用して維持。
3. マウスの陰​​茎は陰茎尿道の入り口の潤滑に使用されている穏やかな圧力と綿棒で、潤滑剤のリベラルな量によって押し出される。
4. 1×10 ^8個の細菌を含有するリン酸緩衝生理食塩水、10μlのカテーテル挿入に続いて麻酔したマウスの尿道内に導入される。
5. 細菌の付着を可能にするために、直ちに排尿を防ぐために、細菌の導入後マウスはプレキシグラス室中で15分間、麻酔状態に維持されている。
6. マウスをケージに戻し、次の24時間監視されています。

3。動作テスト

マウスは、感染前（ベースライン）へと3日、7日、14日、21日、感染後28日に試験した。呼ば痛覚過敏と触覚アロディニアは、腹部と足^11,12 Rに適用von Freyフィラメントを用いて試験した後足¹³ egion。テストは固定時刻、​​標準的な方法論と、すべての動物の単一実験試験採用された時に施行した。グループの盲検試験は、動物モデルにおいて行動ベースの痛み試験の限界と戦うために利用された。グラム（Stoelting、米国）が撤退応答の腹部と周波数に適用されていた0.04、0.16、0.4、1.0、4.0の力を持つ5つの個々のvon Freyフィラメントを算出した。

1. 順応の30分の期間の後、マウスはステンレススチールワイヤーグリッドの床が社内で行われた個々のプレキシグラス室（6×10×12 cm）で配置されます。
2. 呼ば痛覚過敏と触覚アロディニア5 von Freyフィラメントを用いて試験した。各フィラメントは合計10回に5秒の間刺激間隔で1〜2秒のために適用され、毛は力の昇順で試験した。
3. 各フィラメントは前立腺の一般付近で下腹部領域に適用されると注意が脱感作を回避したり、エフェクトを "巻き上げる"ために、この領域内の異なる領域を刺激するために取られた。フィラメントは、10回の合計のための刺激の間に少なくとも5秒の間隔をおいて1〜2秒のための力の低い順に適用された。
4. 行動は、3種類のフィラメント刺激に対する肯定的な反応であると考えています：腹部の1）鋭い引き込み、2）即時舐めるまたはフィラメント刺激の面積の傷、3）ジャンプ。
5. 応答周波数は、肯定応答の割合（10点、10 = 50％の例えば 5回答）として算出したとのデータが応答周波数の平均パーセンテージ±SEとして報告されました
6. 25以上の正の合計ベースライン応答を持つ動物は研究から除外されます。
7. 接触性アロディニアは0.04、0.16、0.4、1.0と4.0グラムの力とvon Freyフィラメントを用いて後肢の足の領域でテストされました。中央値50％引っ込め閾値（5）は、アップダウンを用いて評価したフィラメントが少し曲げるまでテストが0.04グラムのフィラメントで開始されたメソッドは、後肢の足底表面に垂直に印加。フィラメントは、肯定的な反応が観察されるまで、昇順で試験した。フィラメントへの積極的な応答は試験足の足や舐めるのシャープ撤退のいずれかとして定義されていました。肯定応答が記録されたときに次の弱いフィラメントが適用され、否定応答が観察された場合は、次の強いフィラメントを適用した。
8. 記載された実験と方法論は、ノースウェスタン大学の動物のケアと使用委員会によって審査され、承認されています。

Representative Results

Discussion

UPECによるマウス前立腺の感染における生体内細菌性前立腺炎の病態に関与している可能性のある事象のモデリング、CP / CPPSまたは慢性炎症における素因イベントなどが可能になります。方法は女性の尿路感染症^7,14でUPECモデルに文学の大きな体によって細菌準備や点滴の引き分けに記載。モデルは、潜在的なワクチン候補と免疫調節のメカニズムをテストする、病因を研究するための幅広い適用性を持っています。定量化可能な方法で痛みの動作を詳細に追跡する能力は、感染によって誘発される痛みの病因の研究のために、潜在的に痛みの治療をテストするための前臨床モデルとしてできます。

マウス感染モデルの成功を決定するいくつかの重要なステップがあります。揺れや静的文化を持つ3日間の培養方法は、UPECために重要であることが知られている毛の最適な発現のために実行され上皮細胞への付着。それはUPECが成功臓器植民地化のための重要なステップを表します。細菌の成長のための技術は、1×10 ⁸細菌^7を含有^するリン酸緩衝生理食塩水、10μlを得るための最適化された外径₄₂₀ステップ_で UPEC成長のために特別に設計されています。他の種や細菌の菌株は、潜在的に異なる速度で成長し、標準化が1×10 ⁸細菌を与え、適切なODを導出することが重要であろう。細菌の異なる株が¹⁴株で表現病原因子に大きく依存しているユニークな方法で膀胱と前立腺の細胞に付着。マウス前立腺の正常な感染症は、したがって、病原性因子の適切な補体UPEC株の利用に依存するだろう。直ちに感染後、15分間の最小値に対して軽く麻酔状態で動物を維持することは、そのプラグインを確保することが重要である耕作細菌は、排尿の正常なメカニズムは尿道からたらしボリュームを消去する前に、病因を添付して開始する時間を持っています。

マウスにおける接触性アロディニアは、基礎となる内臓病変の結果であり、そういうものとして絶妙な宿主株の特異性によって特徴づけられる。我々は以前、男性、NOD / ShiLtJマウスにおけるUPECの病原性株が同一の菌株がC57BL/67マウス²でアロディニアを誘発することが不可能であるのに対し、3日にピークとが慢性的に持続していることアロディニアを誘発することを説明してきました。我々の研究は、根本的な原因として、NOD / ShiLtJマウスにおける自己免疫プロセスのUPEC誘発の加速を示唆している。したがって、ホストの遺伝的背景は、接触性アロディニアの開発に重要である。アロディニアの公平かつ成功した測定の鍵となり、他の重要なステップは、テスターは、常に治療のアイデンティティに盲目であることを保障している、同じテスターはすべての時間の-pを測定するための責任がある実験では、日中と同様の試験時間の活用、マウスの住宅事情と実験で同様の実験間の両方の時点で標準化の条件を確保する上でoints。

マウス感染モデルは慎重に結果の解釈時に考慮する必要があり、多くの制限があります。細菌はintraurethrally膀胱ならびに前立腺に感染する能力を持って植え付け。基礎病理、複数の臓器から来ているかもしれませんので、これは何らかの全身または一般的なパラメータの解釈を複雑にします。しかし、臨床的および前立腺由来菌株の利用だけでなく、膀胱や前立腺の同時検査は適切な解釈が可能になります。また、感染の方法論は、人間の男性の可能性が高い上行性感染様式をシミュレートします。

ここで説明する感染モデルは、これらの以前に報告されたPRIとは異なりますmarily UPECの株で、培養技術^6、尿道¹⁵に注入細菌のボリュームにホストマウス系統との違いを利用した。本研究は、病気^を媒介すると²よく特徴付け前立腺由来の慢性前立腺炎UPEC株を使用しています。以前の研究では、炎症に関連する事象を調べるために主に利用されますが、接触性アロディニア^6,15で特徴付けされませんでした膀胱の感染症や急性前立腺炎に由来する細菌を使用している。多数の他の動物モデルは、前立腺炎を誘導する自己免疫機序^5,16、ホルモン操作¹⁷および新生児thymectomies ^18を利用^することが報告されています。これらの各モデルは、臓器特異的疾患の病理と、既存の技術の活用を含め、いくつかの肯定的な属性を持っていますがCP / CPPSの実際の病因に、これらのメソッドの関連性は不明である。これとは対照的に、方法論はこの男に記載されてuscriptは、前立腺における疾患の病因の創始者であることが仮定されている潜在的な機構を指す。また、CP / CPPS病因を理解するために、その有用性を超えて、技術はよく前立腺の慢性炎症を確立して、調べることに利用することができるとBPH（前立腺肥大症）と前立腺癌におけるITの役割。

Materials

Culture tubes	BD Falcon	352059
LB Broth Miller	EMD	EM1.10285.0500
Nalgene Centrifuge Tubes	Thermo	3118-0050
Isoflurane	Butler Schein	NDC 11695-6776-1
Catheter needle 30G	Hamilton	91030
PE10 tubing	BD intramedic	427400
Von Frey Filaments	Stoelting	58025-31