CHEF-tdTomatoを使用してゼブラフィッシュ体性感覚ニューロンのOptogeneticアクティベーション

サマリー

Optogenetic技術は、それが可能動作に固有ニューロンの寄与を研究するために作られました。我々は高速ビデオカメラを用いて行動を誘発したダイオード励起固体（DPSS）レーザーと記録とchannelrhodopsin変異体を発現する単一性感覚ニューロンを活性化させるための幼虫のゼブラフィッシュの方法（シェフ）を記述する。

要約

ゼブラフィッシュ幼生は単純な神経回路の発達と機能を記述するためのモデルとして浮上している。彼らの体外受精、急速な発展、および透明度のために、ゼブラフィッシュは、特に神経回路機能を調べるためにoptogeneticのアプローチに適しています。このアプローチでは、光感受性イオンチャネルを活性化または阻害するそれらの意志で、したがって、特定の行動への貢献を評価するための実験を​​可能にし、特定の神経細胞で発現されています。幼虫のゼブラフィッシュでこれらの方法を適用することは、概念的には単純ですが、技術的な詳細の最適化が必要です。ここでは、ゼブラフィッシュ幼生体性感覚ニューロン、写真活性化単一細胞でchannelrhodopsin変異体を発現させ、その結果の行動を記録するための手順を示しています。以前に確立された方法にいくつかの変更を導入することによって、このアプローチは、最大活性化する単一ニューロンから行動応答を誘発するために使用することができる少なくとも4日後に受精（DPF）へ。具体的には、タグ付けされたchannelrhodopsinバリアント、CHEF-tdTomatoの発現を駆動するために体性感覚ニューロンエンハンサー、CREST3を使用して導入遺伝子を作成しました。共焦点顕微鏡で画像化することができる体性感覚ニューロンにおけるモザイク式、1細胞期胚の結果にこの導入遺伝子を注入する。照明は、光ファイバケーブルを介して導かれ、473 nmのDPSSレーザーからの光を用いて、これらの動物で細胞を同定し、高速度ビデオカメラで記録し、定量的に分析することができる行動を誘発する。この手法は、任意のゼブラフィッシュの神経細胞を活性化することによって誘発行動を研究するために適合させることができた。遺伝的または薬理学的摂動にこのアプローチを組み合わせることで、回路形成と機能を調べるための強力な手段となります。

概要

光の波長と定義されている神経細胞の興奮性を促進または阻害するためoptogenetic方法の開発は、それが可能な行動^{1、19、21を}制御^する神経回路のニューロンの異なる集団の機能を研究するために作られました。この技法はしばしばニューロンのグループをアクティブにするために使用されますが、それはまた、個々の神経細胞を活性化するために使用することができます。彼らは半透明であるため、ゼブラフィッシュの幼虫はこれらの方法に特に適している、彼らの神経系はすぐに開発し、トランスジェニック動物を作成することは、迅速かつルーチンです。しかし、重要な技術的ハードルは確実に単一ニューロンの活性化を実現するために克服しなければならない。

シングルゼブラニューロンのoptogenetic活性化のための手順を最適化するために、私たちは体性感覚ニューロンに焦点を当てた。頭を支配する三叉神経ニューロン、およびRohon·ビアード（：ゼブラフィッシュの幼虫は、2つのニューロンの集団を用いて体性感覚刺激の様々な検出RB）の本体の残りの部分を支配するニューロン。各三叉とRBニューロンは皮膚の広範囲に枝が刺激と下流の神経回路に接続する中央の軸索を検出するために末梢軸索を投射する。動物は、コヒーレント性感覚回路^5、18を形成^していることを示す、21時間後の受精（HPF）には早くもタッチに反応。幼虫の発育中に少なくともマウスナー細胞上にいくつかの三叉神経とRBニューロンのシナプスは^、古典的なエスケープ応答を活性化しますが、エビデンスが蓄積され逃避行動^2、4のバリエーションを引き出すことができる接続のさまざまなパターンを持つ体性感覚ニューロンの複数のクラスがあることを示唆する^{10、12、14、15、16、17。}この方法を開発するための私たちの動機は、体性感覚ニューロンの異なるクラスの行動機能を特徴づけることであったが、この方法は、原理的にはLARのニューロンのほぼすべてのニューロンまたは人口の機能を研究するために使用することができるvalのゼブラフィッシュ。

ダグラスらは、以前に逃避行動^を誘発^する3、青色光チャネルロドプシン-2発現性感覚ニューロンを活性化するための方法を記載した。彼らのアプローチは、体性感覚ニューロンでChR2-EYFPの発現を駆動するためにISL1遺伝子からエンハンサー要素を使用していました。この導入遺伝子は、しかし、ChR2-EYFPを発現する細胞の可視化を可能にするために第二のレポーター、UAS :: GFPの同時注入を必要とする、比較的弱い蛍光を表示することが報告された。このアプローチは、24から48の間にHPF行動応答を誘発するために使用されましたが、72 HPF過去の応答を引き出すことができませんでした。この方法は非常に早い幼生期（24〜48 HPF）で神経回路を研究するために動作しつつ、それは、より多様な行動反応は明らかであり、神経回路は、より成熟している年上の幼虫の神経回路と行動反応を特徴づけるには不十分である。

我々はしようとした幼虫のRBのニューロンの亜集団の機能を特徴付けるために、この技術の感度を向上させる。発現を改善するために我々は蛍光標識された光によって活性化されたチャネルの発現を増幅するためのLexA-VP16とのLexAオペレーター配列のストレッチ^{（4xLexAop）11}の発現を駆動するために体性感覚的エンハンサー^{（CREST3）20を}使用^{していました} 。この構成では、第二のレポーターを共発現し、私たちは直接、各ニューロンのチャンネルの相対量を判断できるようにすることの必要性を排除し、チャネルの発現を増幅した。のLexA / LexAopシーケンスを使用することで、Gal4/UASシステムを使用してゼブラフィッシュレポーターラインに導入遺伝子を導入することを可能にするという付加的な利点を持っていた。この導入遺伝子の一過性発現は、発現のレベルを変化させた結果が、通常は数日間にわたって細胞体および個々のニューロンの軸索突起の両方を視覚化することは十分に堅調に推移しました。感度を最適化するには明るみにITY我々はチャネルシェフ、ヘリックスループEF ¹³でクロスサイトのchannelopsin-1（Chop1）とchannelopsin-2（CHOP2）のキメラから成るchannelrhodopsin変異体を活性化する光を使用していました。このチャネルは、ChR2と同じ波長で活性化しますが、ChR2を含む他の一般的に使用されるチャネル、よりそれがより敏感になるため、活性化のためのより低い光強度を必要としている。シェフのタンパク質は、私たちがチャネルをアクティブにせずにタンパク質の発現をスクリーニングできるように、赤色蛍光タンパク質、tdTomatoに融合させた。光源として、我々はダイオードが幼虫の特定の領域に青色光の正確な、ハイパワーパルスを供給するように、光ファイバケーブルに結合固体（DPSS）レーザ励起に使用。これは、私たちは単一ニューロンにおけるチャネルを発現している稀なトランスジェニック動物を見つけるための必要性を排除し、個々のニューロンにレーザ光の焦点を合わせることができました。このアプローチを使用して、我々は、単一のRBのニューロンを活性化する行動反応を記録することができました高速度ビデオカメラ、および画像共焦点顕微鏡による高分解能で活性化されたニューロンの。

プロトコル

前もって次の準備をします。

1。ファイバケーブルを準備

1. 〜150°の角度を作成するにはブンゼンバーナーの上にガラスパスツールピペットのテーパー首を溶融することによって光ファイバケーブル用のストレージユニットを作成します。
2. ワイヤカッターまたはカミソリの刃を使用して、慎重に二つにファイバーケーブルを切断してください。それぞれの作品は、FC / PCアダプタと1露出端に一端があるはずです。予備ケーブルとして1つの作品を保管してください。
3. ケーブルの切断端の5.0 cmから繊維ジャケットと強化繊維（ 図1A）を除去して被覆管に光ファイバケーブルをストリップ。
4. 準備されたパスツールピペットに光ファイバーケーブルを挿入します。ケーブルは簡単に​​ピペットチップの内外に移動できることを確認します。
5. 光ファイバケーブルは、パスツールピペットの先端から突出して、慎重に切断端から約2mm、ガラス繊維の周囲から光ファイバのクラッドをカットし、削除します。
6. ダイヤモンドペン/ガラスカッター、ニックガラス繊維とブレークoを使用してffはエンドファイバ（ 図1B）の終わりにきれいにカット/サーフェスを作成する。
7. ストレージにパスツールピペットに光ファイバケーブルを収納してください。光ファイバーの先端が不規則に欠けたり休憩される場合は、手順（1.6）を繰り返します。
8. マイクロマニピュレータを用いたパスツールピペットの位置ファイバケーブル（ 図1C）。

手順2-8は、多くのゼブラフィッシュの実験に一般的に適用可能な胚に導入遺伝子を注入する方法を説明します。この方法のバリエーションには、他のJoveのビデオ^{6、7、8、9}に記載のものと同様に^、22は同等に有効である。

2。注射針を引っ張る

1. ニードルプラーを使用して、徐々に先細チップで2注射針にホウケイ酸ガラスチューブを引き出します。プーラーの設定が異なります。 （サターインスツルメンツニードルプラーで私達は設定を使用して、P = 500、ヒート= 720、= 50、速度を引き出し= 70時間= 150）。すべての針プラーのでemがプーラーの設定を最適化し、異なっているpirically。もっとテーパー針については、熱および/またはプルを増やします。少ないテーパー針については、時間および/または減少プルを増やす。
2. 安全な容器に入れ針（ すなわち圧延テープ付きペトリ皿、粘着面アウト）。

3。射出成形金型を注ぐ

1. アガロースが完全に溶解するまで、30ミリリットルの胚/青い水に0.5グラムアガロースを溶かす。
2. シャーレの下半分に注ぐ。
3. 井戸の周りに気泡形成を制限するように注意して、アガロースに井戸（ 図2）を搭載したある場所長方形のモールド。
4. アガロースを固化することができます。
5. 金型を外し、青/胚水でシャーレを埋める。
6. 直立して格納し、同じ日の使用のために室温で、または4℃で将来の使用のために、きれいな水で満たされた。

4。注射用プラスミドDNAのミックスを作る

1. 蒸留H _{2 O}中で1:10フェノールレッドでた50 ng /μlの濃度にプラスミドDNAを希釈のために例：

   1.0ミリリットル	プラスミドDNA（250 ng / ml）を
   0.5ミリリットル	フェノールレッド
   3.5ミリリットル	ddH 2 Oを

2. 数日間のために直ちに使用するか、4℃で保存した場合、DNAの混合物を室温に保つことができる。

5。嵌合ペアを設定

あなたが注射を行うことを計画する前に、これは夕方に行う必要があります。

1. システムの水で繁殖タンクを記入し、オスとメスの魚を一緒に配置します。ライトは分圧器を使用して、施設内の別のオスとメスの魚を上に回すと、注射はできるだけ早く行うことができない場合。

6。 （胚を待っている間に行うことができます）注射の準備をする

1. 圧力インジェクタリグの電源をオンにします。システムはパルスに設定されていることを確認します。 1に設定し、パルス持続時間で始まります。
2. 空気弁の電源をオンにして、〜20 psiにインジェクタに圧力を調整します。
3. 最高倍率で解剖スコープを使用して、鉗子や〜2μmの開口部（ 図3、ムービー1）を作成するために火かき棒で針の先端を破る。
4. によりDNAミックスで針を埋める：1。 DNAのミックスに、針、先端側を上に置くと針が毛細管現象または2で記入させる。 DNAの1から2μlのピペットに長距離チップを使用すると、針に直接混ぜる。
5. 注入する準備が整うまでは、安全な場所に埋め針を置きます。

7。胚を収集

1. 施設のライトがオンになった後、仕切り板（該当する場合）を削除します。ストレーナー/小さなふるいで胚を採取し、新鮮な青/胚水でシャーレに移す。

8。 1から2細胞期胚を注入

1. プラスチック製のピペットを用いて射出成形金型に収穫胚を転送します。
2. 解剖顕微鏡を使って、そっと中に胚をプッシュ鉗子または鈍いポーカーのウェル（ 図4、ムービー2）。
3. 胚オーバーマイクロマニピュレータと位置にロードされた針を置きます。
4. 希望の音量（〜1 NL）を達成するまで、1ステップ単位でパルス幅を調整することにより、注入量のキャリブレーションを行います。これは、前のJoveのビデオ^8、22で説明したように、マイクロスライドでキャリブレーションが、注入量の広い範囲が適切な表現になりますので、この実験の精度のために、必要ではないということです。
5. 〜1 nlのDNAはすべての胚の細胞とリピートに直接混ぜて注入する。 DNAはまた、卵黄に注入しますが、これは（ 図5、ムービー3）効率が悪くなる傾向にあることができます。
6. 青/胚水の穏やかな流れを使用して金型から注入された胚を取り出します。
7. ストアは、暗闇の中で28.5℃で胚を注入した。
8. 定期的に未受精卵、損傷または死亡胚を取り出します。
9. 胚wiを扱う色素沈着を防ぐために18から24の間にHPF番目PTU。

9。導入遺伝子発現のための画面

1. 鉗子を使用して手動でdechorionate 24から48 HPFの胚。
2. tricaine 0.02％を使用して幼虫を麻酔。
3. 蛍光解剖顕微鏡を用いて、RBまたは三叉神経細胞の発現と幼虫を識別し、新鮮なPTUの青/胚水で新しい皿にこれらを転送します。容易に識別できる細胞内のスパース表現した胚は最適ですが、表現の密度の広い範囲が許容されるので、個々のニューロンは、光ファイバケーブルを使用してアクティベーションの対象となります。
4. ストア胚28.5、暗所で℃の希望の実験段階まで。

10。行動実験のための幼虫をマウント

1. 蒸留H ₂ Oおよび固化からそれを防ぐために、42℃のヒートブロックでストアに1.5％低融点アガロースを加えます。
2. 浴槽にガラスパスツールピペット、転送事前にスクリーニングした幼虫のいずれかを使用しできるだけ少ない青/胚水で1.5％低融点アガロースのe。
3. 小さなシャーレ上にアガロースのドロップで幼虫を転送します。
4. 解剖顕微鏡下では、位置の幼虫の背側のアップ。
5. アガロースが固化したとき、全体の幼虫の周りに寒天のくさびを残して、薄いカミソリの刃（＃11メス）でアガロースを切り取った。
6. 卵黄の両側に二つの対角線カットを作る;ニックネームに幼虫の世話をしないでください。
7. 胚/青い水でアガロースを囲む領域を塗りつぶします。
8. 幼虫の体幹と尾（ 図6）からアガロースを引き離す。

11。ハイスピー​​ドカメラとイメージングソフトウェアを準備

1. スコープを解剖に高速度カメラをマウントします。
2. カメラをパソコンに接続する。
3. コンピュータの電源を入れます。
4. 高速度カメラの電源をオンにします。
5. オープンなビデオ/イメージングソフトウェア（我々は、AOSのイメージングソフトウェアを使用し、ここでそれを使用するための手順を説明しますが、他のイメージングソフトウェア）は等しく許容されます。
6. それに応じてカメラの設定を調整します（1秒当たりすなわち千フレーム（fps）、50％トリガバッファやその他の設定を設定します）。
7. 記録を開始します。

12。 473 nmのレーザーを使用した単一ニューロンを活性化する

1. 刺激装置、レーザーと光ファイバケーブルを接続します。
2. 刺激装置の電源をオンにします。
3. 5ボルトの最大値と5ミリ秒のパルス幅に刺激を設定します。
4. 製造元の指示に従って、レーザーをオンにします。
5. CHEF-tdTomato発現（ 図6）とニューロンの細胞体の近くに光ファイバケーブルの先端を配置するために解剖顕微鏡を使用しています。
6. 感覚ニューロンを活性化するために、青色光のパルスを実現します。
7. 高速度カメラを使用してレコードの動作が秒当たり500または1,000フレームに設定。
8. 馴化を避けるために、各アクティベーション間の1分待って、必要に応じて実験を繰り返す。 （我々は、各ニューロンのための3つの応答の最小値を記録）。
9. へリリースの幼虫は、動物を傷つけないように注意しながら、鉗子でアガロースをこじ開ける。この動物は、さらに発展させることができると手順は、行動の発達を特徴づけるために古い段階で繰り返すことができます。胚はまた後述するように、細胞の構造と動作を相関させるための活性化細胞の高分解能共焦点イメージングのために再マウントすることができます。
10. 新鮮な青/胚水で培養プレートに幼虫を移す。我々は個々の幼虫を追跡するために、24ウェルプレートを使用してください。

13。共焦点レーザ顕微鏡を用いた画像ニューロン（S）

1. 0.02パーセントtricaineで幼虫を麻酔。
2. 1.2パーセント低融点アガロースでまたは背型の台紙の幼虫、最大背側、。
3. 画像シェフtdTomato 543 nmのレーザー、適切なフィルタとを目的としたニューロン。我々は20倍対物レンズを使用しています。
4. アガロースから幼虫を取り出して、青/胚水でよく個々に戻ります。
5. 28.5℃で保存fuが暗闇の中で、Crther分析。

結果

図1。ファイバケーブルは、設置した。光ファイバケーブルの（A）のレイヤー。パスツールピペット（B）中の剥奪光ファイバケーブル。 （C）をパスツールピペットでの光ファイバケーブルは、マイクロマニピュレーターを使用して配置。

図2。射出成形金型テンプレート。

ディスカッション

我々は、ゼブラフィッシュのライブで単一のRBニューロンのoptogenetic活性化するためのアプローチを説明してきました。我々の方法は、特定の体性感覚ニューロンに蛍光標識channelrhodopsinバリアント、CHEF-tdTomato ^13を発現する一過性遺伝子導入を採用しています。このアプローチは、簡単に他の幼虫のゼブラフィッシュの細胞集団での使用に適合させることができた。

この手法を用いて、我々は一貫してシェフtdTomatoを表現する34から48のHPF幼虫から行動反応を誘発した。 5 Vで、青色光の5ミリ秒パルスを用いて、我々は、単一のRBニューロン（ 図7）を活性化することができました。動物に沿った様々な点で光ファイバを配置することによって、我々はそれが行動反応を誘発するために、細胞体に直接青色光を目指すことが必要であることがわかった。光パルスは、シェフを発現しなかった幼虫からの応答を誘発しなかった。また、中枢性軸索または末梢軸索に沿った光パルスは、e、応答を誘発したことがない若齢幼虫でVEN（データは示さず...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
試薬/材料の名称	会社	カタログ番号	注釈
			材料
ガラスパスツールピペット	フィッシャー	1367820B	または同等の（10-15 mm径）
200μmの光ファイバー	ThorLabs	AFS200/220Y-CUSTOM	パッチコード、長さ：3 mは、END：FC / PC、端部B：FC / PC、ジャケット：FT030
50μmの光ファイバ	ThorLabs	AFS50/125Y-CUSTOM	パッチコード、長さ：3 mは、END：FC / PC、端部B：FC / PC、ジャケット：FT030
調節可能なストリッピングツール	ThorLabs	AFS900	または3ホールストリッピングツール（FTS4）
ダイヤモンドウェッジスクライブ	ThorLabs	S90W
/ブラウンマイクロピペットプラー燃える	サターインスツルメンツ	P-97	または同等の
フィラメントとホウケイ酸ガラスチューブ	サターインスツルメンツ	BF-100-78から10
射出成形金型	N / A	N / A	図5
1.5 mlの遠心管	任意の	任意の
ペトリ皿（100x15 mm）の	任意の	任意の
ペトリ皿（60x15 mm）の	任意の	任意の
圧力インジェクタ	ASI	MPPI-3	または同等の
マニピュレーターと金属スタンド	持てる	M152	または同等の
使い捨てのプラスチックピペット	Fisherbrand	13-711-7	または同等の
ポーカー（ピンホルダーと昆虫ピン）	ファイン科学ツール株式会社	26018から17と26000から70	または同等の
鉗子	ファイン科学ツール株式会社	11255から20	または同等の
Microloaderピペットチップ	エッペンドルフ	9300001007
28.5℃のインキュベーター	任意の	任意の
42℃のヒートブロック	任意の	任意の
非滅菌メスブレード＃11	ファイン科学ツール株式会社	10011から00	または同等の
sを解剖対処	ツァイス	STEMI	または同等の
標準フィルタと蛍光解剖スコープ	任意の	任意の	または同等の
共焦点顕微鏡	ツァイス	LSMは510または710	またはGFPおよびRFP、及び10倍、20倍と40倍の目標を達成するためのレーザーと同等の
ハイスピー​​ドカメラ	AOSテクノロジーズ株式会社	X-PRI（130025から10）	または同等の
473 nmのポータブルレーザー	結晶レーザー	CL-473から050	TTLオプション付きまたは高電力、
S48スティミュレータ	アストロメッド株式会社草音源部門	S48K	または同等の
FC / FC / PC交配スリーブへのPC	ThorLabs	ADAFC1	月ねファイバケーブルの接続を行うために、ed
レーザー安全メガネ	ThorLabs	LG10	または同等の
24培養プレート	ジェネシー川	25から102	または同等の
シングルうつ病スライド	フィッシャー	S175201	または同等の
			試薬
インスタント海	水生生態系	IS50
メチレンブルー	フィッシャー	S71325
フェノールレッド	シグマ	P4758
アガロース	EMD	2125	または同等の
低融点アガロース	シグマ	A9045	または同等
PTU	シグマ	P7629
Tricaine	シグマ	A5040
青/胚水			10Lの蒸留H 2 O 0.6グラムインスタントオーシャン 6滴メチレンブルー
フェノールレッド			（0.2MのKCl、5 mg / ml）を
100xのPTU			0.150グラムPTU 50ミリリットルddH 2 Oを 70で溶解℃、頻繁に振る -20℃でアリコートとストア
1X PTU			1ミリリットル100xのPTU 99ミリリットル/青魚の水
Tricaine原液			400mgのtricaine 97.9 ddH 2 Oを
〜2.1ミリリットル1Mトリス、pH9.0			〜pHを7.0に調整 長期保存のため4℃または-20℃に保管して