体外における筋モータープールのために運動ニューロンの識別<em&gt;アメフラシカリフォルニ</em

Hui Lu; Jeffrey M. McManus; Hillel J. Chiel

doi:10.3791/50189

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方法論記事

体外における筋モータープールのために運動ニューロンの識別

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DOI:

10.3791/50189

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2013年3月25日

Hui Lu¹ , Jeffrey M. McManus¹ , Hillel J. Chiel¹^,²^,³

¹Department of Biology, Case Western Reserve University , ²Department of Neurosciences, Case Western Reserve University , ³Department of Biomedical Engineering, Case Western Reserve University

この記事について

サマリー

大同定ニューロン（と動物では例えば軟体動物）、モータープールの分析は、細胞内の技術を使用して行われ^1,2,3,4。最近、我々は細胞外で個々の神経細胞を刺激し、記録する技術を開発アメフラシカリフォルニ 5。我々は今、一意に識別してモータープール内の運動ニューロンを特徴づけるためにこの手法を使用するためのプロトコルを記述します。

要約

大同定ニューロン（ 例えば軟体動物）、モータープールの分析と動物では細胞内のテクニックに^1,2,3,4を使用^して行われます。最近、我々は細胞外にアメフラシカリフォルニ ⁵で個々の神経細胞を刺激し、記録する技術を開発しました。我々は今、一意に識別してモータープール内の運動ニューロンを特徴づけるためにこの手法を使用するためのプロトコルを記述します。

この細胞外手法には利点があります。まず、細胞外電極は刺激し、記録ニューロンをシース⁵を通っているので、削除する必要はありませんすることができます。このように、神経細胞は、細胞内のものに比べて、細胞外の実験でより健康になります。ガングリオンは、シースのピンニング適切により回転される場合、第二に、細胞外電極は、より容易かつ効率的に同じ準備で複数のニューロンを識別できるようになり神経節、両側の神経細胞にアクセスすることができます。第三に、extracelluLAR電極が細胞に侵入する必要はありません、したがって、容易にそれらにあまりダメージを与え、ニューロン間で前後に移動することができます。一つはわずか数分持続することがある運動パターンを繰り返す中に複数のニューロンを記録しようとするときに特に便利です。第四に、細胞外電極は、筋肉の動きの間に細胞内のものよりもはるかに柔軟です。細胞内電極引き出し、筋肉の収縮時に神経細胞を損傷することがあります。細胞外電極は優しくニューロン上記シースに押し付けているのでこれとは対照的に、彼らは通常、筋肉の収縮時には、同じニューロン上に滞在し、したがってよりそのまま調剤で使用することができます。

ソーマのサイズや位置、軸索投射し、筋肉の神経支配^4：一意細胞外電極を使用してモータープール（特に、 アメフラシでI1/I3筋肉）の運動ニューロンを同定するためには、基準のような細胞内の測定を必要としない機能を使用することができます、6,7。手法を説明するために使用される特定のモータープールのために、我々は軸索突起物を測定するために頬神経から2と3を記録し、個々の運動ニューロンのための筋の神経支配のパターンを決定するI1/I3筋肉の収縮力を測定した。

我々は、迅速な同定のために簡略化された診断法を作成し、運動パターンの間にそれらのタイミングを特徴付ける、筋の神経支配を用いた第1の識別運動神経の完全なプロセスを示しています。簡略化され、より迅速な診断方法は、一時停止頬マス準備⁸ または in vivo で ⁹ 例より完全な準備のために優れています。このプロセスは^、2,3,13,14 アメフラシや他の動物系で^10,11,12他のモータープールに適用することができます。

プロトコル

1。録音皿の調製

力変換器の実験中に、頬神経、脳神経節、頬質量は力の研究に特化していますラウンドパイレックス皿に入れています。
実験でingestiveのようなパターンを誘導するために、我々は脳の神経節¹⁵に非加水分解性コリン作動性アゴニストのカルバコールを適用する必要があります。頬神経と頬マス上にカルバコールからの直接の接触を回避するには、別のチャンバは頬と頬神経塊（ 図1）から脳の神経節を分離するために必要とされている。
頬の質量が頬神経節よりもはるかに厚いので、それらは同じレベルに配置されません。したがって、この皿は脳神経節（図1の面積）、頬側神経節（図1の領域C）、および頬質量（エリアDのためのより深い前室用の中間のプラットフォーム用のバックチャンバーを持つべき図1）。
この料理を作成するには、ラウンド100x15パイレックス皿（高15ミリメートル、直径100mm）で始まります。皿の建設がいくつかはシルガードを注ぐ必要があります。シルガード製品で提供される指示に従ってください。シルガードは異なる注ぐ間に設定することを許可しなければなりません。
第一流動は、中間プラットフォームとバックチャンバーとの間の壁である皿（図1の領域B）におけるシルガードの最高レベルを作成することです。
シルガード壁（図1の領域B）の領域を分離するために2つの粘土のバッキングを使用しています。彼らは容易に除去するためのシルガード連絡を差し上げますラップでコート粘土バッキング。粘土は、漏れを最小限に抑えるために、皿をご連絡いたしエッジでタイトなシールを確認してください。
ほぼアップ皿の上部には2つの粘土バッキングの間の部分にシルガードを注ぐ。シルガードが完全に一晩設定してみましょう。暖かい場所で皿にしておくと誘導する速く設定。粘土バッキングを取り外し、シルガード上の任意の粘土の残留物をクリーンアップします。
次に、真ん中のプラットフォーム（図1の領域C）をバックチャンバー（図1の領域）と注がれるべきである。
離れて真ん中のプラットフォーム（領域C）のセクションのシルガードの表面から約5mm粘土バッキングを置きます。
アップ第一シルガード壁（エリアB）のトップレベルより約3〜5mmの高さに戻し室（面積）と中央プラットフォーム（領域C）のセクションにシルガードを注ぐ。バックチャンバーのシルガード表面は、中間プラットフォームにカルバコールを含むバックチャンバーからの漏れを回避するための中間プラットフォームに比べてわずかに低くする必要があります。再び、シルガードが完全に一晩設定でき、その後粘土バッキングを取り外します。
最後のステップは、行き脳頬側接続詞（CBCS）のためのチャネルを提供するために、シルガードの壁の中央にノッチをカットすることです真ん中のプラットフォームとバックチャンバーの間から。このノッチの幅がCBCSための十分な広さ約3-4 mmでなければなりません。ノッチの底部は、漏れを防ぐために、中央のプラットフォームのシルガード表面よりも低くすべきではない。メスの刃、ノッチをカットするために使用することができます。

2。電極の作製

セクション3.1でマクマナスらによって記載フレイミング·ブラウンマイクロピペットプラー^8を用い^て、単銃身のガラスキャピラリーから外ガラス電極を引き出します。プラーでFT345Bフィラメントにより、当社の代表的なプログラムの設定は、ヒート480、プル50、速度13、時間20であるが、設定が異なるフィラメントに対して異なるであろうことに注意してください。このプログラムではありません火研磨ステージとシングルプルで電極を作成します。電極チップの大きさは細胞体のサイズよりも小さくなければならない。 50μmからソーマ直径、インナーdiameteでは400μmまでの運動ニューロンのために外ガラス電極のrsは約40μmであるべきであり、それらはアメフラシの生理食塩水で満たされているときに彼らの抵抗は約0.1MΩでなければなりません。
ブンゼンバーナーを用いてポリエチレンチューブから吸引電極を引き出します。約10cm長いポリエチレンチューブの部分を切り取ります。両端にチューブを保持し、それが熱から柔らかくなるまでチューブを回転させながら非常にブンゼンバーナーで生成された火炎の近くに置きます。炎から離して移動させながら、その長さに沿って慎重にチューブを伸ばす。チューブの中央部分が細長いチューブが引っ張られるように狭くなります。
2つの吸引電極を形成するために半分にチューブをカットします。彼らは時々 パッサントの途中適用することができますが、吸引電極は、一般的には、神経や筋肉の切断端部に適用されます。
セクション3.2から3.13にマクマナスら ⁸で記述されたプロトコルに従って神経録音用フック電極を作成します。これらの電極はespeciアール神経や筋肉が切断されない場合に便利同盟。

3。フック電極アタッチメント

動物を解剖し、マクマナスらに記載プロトコルに従って口腔内腫瘤を取り除く^。8節4。
記録と刺激のために、フック電極は異なる神経の番号に接続することができます。
Cullinsとチール⁹ によって in vivo で行われていたようなパターンを特徴づけるために、録音が^16を供給^する長期化相、食品グラスパー^17、頬の閉鎖を示しradular神経（RN）を示しているI2の神経や筋肉から得なければなりませんトラクション段階^17,18を示す神経2（BN2）と頬神経3（BN3）。フック電極の添付ファイルは、マクマナスら ^8、セクション5で説明したのと同様の手順に従います。
これらの神経の位置はに示すアメフラシ送り装置の概略を参照してください。マクマナスら ⁸の図2。横溝でI1は筋肉の下に行く前に支店、B、CにBN2 trifurcatesことに注意してください。枝は幹から分離するための最初の分岐であり、BN3に隣接しています。
枝の命名法は、a、b、およびcは戦士とチール¹⁸で使用されていました。枝はa、b、cの Nargeot らによって使用される命名法において、それぞれ枝3,2、および1に対応しています^19。さらに、RNは、BN1、BN2、BN3とはカンデル²⁰とスコットらによって使用される命名法において、それぞれの神経1、6、5、4に対応しています²¹
I1/I3筋の筋神経支配を研究するために、頬神経を除くすべての神経が2回の実験中に頬の塊から切断されます。したがって、私たちは、BN2から録音するフック電極を使用していました。

I2の神経とRNが頬部に取り付けられ、彼らはフック電極を使用してアクセスすることが非常に困難であることはありませんので、代わりにそれらから録音する吸引電極を適用するのが好ましい。私たちは、セクション7で吸引電極のアプリケーションについて説明します。
それは電極のいずれかの種類を使用してアクセスすることが容易であるため、BN3から録音するフック電極または吸引電極のいずれかを使用します。我々は吸引電極を保持するためのマニピュレーターの数を最小限に抑え、他のマニピュレータや機器のためのスペースを節約するためにBN3録音用フック電極を使用することにしました。
実験中に拒絶反応のようなパターンを開始するためにBN2（BN2-）の枝にフック電極を取り付けます。いくつかのニューロンは同側の対反対BN2刺激に対して異なる反応ので、それは、もう一方の側のBN2-への追加フック電極を添付すると便利です。
一方的な対二国間の突起を有するニューロンを区別しやすくするため、それ頬神経の反対側にBN2とBN3にフック電極を接続するためにも有用である。

4。神経と筋肉の準備

頬神経、脳神経節と頬質量は脳神経節のみBN2s経由CBCSおよび頬質量は頬神経に接続されている経由頬神経に装着された、力変換器の実験のために準備されます。
フック電極を取り付けた後、頬に大量付着点で切断、頬神経1（BN1）と両側性食道神経（EN）をカット。
I2は筋肉の道の外に移動を楽しみにし脳神経節を引き出します。 radular嚢以上I2の筋肉にカットして、両方の方向に横方向と前方カットを拡張し、radular神経を露出させるために前方にI2の筋肉のフラップを引っ張る。 2 RNの枝を切って、枝が吸引電極の付着のために十分な長さであることを確認してください。
C言語頬神経とI2の筋肉の付着部分が完全に頬の塊から分離することができるようになるまで、またはBN2s BN3sを切らないように注意して、頬神経の周りに大きな円を描いてI2のカットをontinue。フック電極アタッチメントを超えて、頬に大量付着点で二国間BN3sをカット。
真空グリースのglobをピックアップし、ノッチの上にそれを広めるためにピペットチップを用いて、バックチャンバーとミドルプラットフォームを接続する上記の記録皿のノッチに真空グリースの薄い層を適用します。
ちょうど真ん中のプラットフォームのシルガードベースの前に、頬マスが配置される前室のガラス底にクイック·ゲルスーパー接着剤の薄い層を適用します。
慎重にフック電極のいずれも神経を損傷する恐れがあり、これきつく引っ張られていないことを確認しながら、第2節で説明した記録ディッシュ（ 図1）脳神経節、頬と頬神経塊を転送します。
慎重にその腹面が皿の底に接着されたことを確実にするために、記録の皿の前室に糊で頬の塊を配置します。接着剤に触れ神経と電極を必ず保管してください。接着剤が誘発される皿にアメフラシ生理食塩水^8（460 mMのNaCl、10mMのKCl、22 mMのMgCl _2、33 mMののMgSO _4、10mMのCaCl _2、10mMグルコース、10mMのMOPS、pHが7.4から7.5）を追加設定します。
皿が細胞外ソーマ録画の頬神経を調製するための別の顕微鏡へ転送しなければならない場合は、フック電極には充分に注意してください。グループが一緒に頬の質量の1側の電極、またグループ一緒に頬の塊の向こう側にある電極。慎重に再び電極のいずれもしっかりと引っ張られていないことを確認し、コネクタのピンをカバーラボテープを把握することによって電極を保持。
皿は、顕微鏡、電極の下に配置されている場合sは皿の横のプラットフォーム上皿と残りの辺の上に優しく覆われなければならない。
休憩時間に、実験の段階の間に、水槽のairstoneを使って頬マスチャンバー内に生理食塩水を通気する。
脳の神経の鞘をつかむとCBCSはノッチを通して実行することを保証し、バックチャンバーにそれを引っ張るためにピンセットを使用しています。無傷CBCSへの損傷を避けるためにCBCS以外の神経を使って脳の神経をピン。
CBCSより細かく真空グリースを塗布し、その後、神経が完全に水没されるように、皿の両院にもっとアメフラシ生理食塩水を追加します。漏れがチャンバー間発生しないように真空グリースの上部がシルガード壁よりも若干高くなっていることを確認します。
頬神経を安定させるために、まず、中間プラットフォーム（ 図2）のシルガードベース上BN1sとENSをBN3sの両端をピン。 BN3sは、フック電極を用いて記録されますので、sは、ピンがフック電極の付着点よりも遠位に配置する必要があります。
フックはCBCSを伸ばし、固定するように（ 図2）CBCSが破損されないように、90度曲がって、2つのピンを使用します。
バックチャンバーと頬神経節間のRNの枝を突き止める。次に、I2筋肉は、RNSの上になります。 I2は神経を公開するには、I2は筋肉をつかむと頬神経の上にそれを引っ張って鉗子を使用しています。 I2は神経への損傷を避けるために、I2筋肉の2つの角をピン。
その二つの枝がI2筋に合流する地点に遠I2は神経を断つ。筋肉がまだ生体録音に匹敵するように支配していることを確認します。 I2は筋肉の残りの部分を切り取るとI2神経をバックフリップと2 RNの枝の間にそれを突き止める（挿入図2を参照）。
神経があまりにも緩んでいる場合は、ストレッチや緊張を追加するには、ピンの位置を調整したり、ネルフなら緊張を解放するeはきつすぎる。さらに頬神経を安定させるために、神経間のシースに複数のピンを追加します。
頬神経が尾側を上にして置かれているので興味のあるニューロンは吻側側にある場合は、頬神経を回転させます。 2頬神経節の1を回転させるには、それが頬神経の近くにあるCBCのいくつかの余分な鞘をつかむとBN2とBN3間でそれを突き止めるために細かい鉗子を使用しています。いくつかの節では、CBCとBN3間でそれを突き止める方が便利でしょう。
頬神経の動きを最小限に抑えるための前室に近い側の頬神経の鞘に追加のピンを追加します。
頬神経を覆うシースをトリミングするには、バックチャンバーに近い側に鞘をつかむために細かい鉗子を使用し、細胞体をさらすことなく、細かいハサミで余分なシースを切り取った。被害を最小限にするために、唯一の細胞体を参照するために必要なシースの最小量を削除します。
t後頬神経の鞘がトリミングされています彼は、頬神経を介して、I2神経と看護師を引っ張って、さらに頬神経を回転させるために頬神経節と前室の間にそれらを突き止める。（ 図2を参照）。
解剖前に動物を麻酔するために使用された残りの塩化マグネシウム^8を洗い流すために、新鮮なアメフラシ食塩水で皿にアメフラシ生理食塩水を交換してください。

5。電気フック電極を接続

神経や筋肉の準備が完了した後、慎重に実験用防振テーブルに皿を移す。
アンプ（AMシステムズモデル1700アンプ）に接続するBNCケーブル上のソケットにすべての電極ピンを取り付けます。繰り返しますが、これをしている間に電極がきつく引っ張られないことを確認してください。電極が正しく、適切なケーブルに取り付けられており、極性が正しいことをしていることを確認します。

6。相馬録音のための細胞外ガラス電極のセットアップ
周りに15〜20センチメートルのポリエチレンチューブの部分に取り付けられたシリンジを用いてアメフラシ生理食塩水で電極を埋める。ガラス電極の端部にポリエチレン管の自由端を取り付けます。 アメフラシ生理食塩水で電極を埋めるために、シリンジのプランジャーを引き戻し。
マニピュレータ上のホルダーの切り欠きに満ちた外のガラス電極を配置します。頬神経節を含むアメフラシ食塩水中に電極チップを配置するマニピュレータを使用しています。
記録線として機能する電極にオス金コネクターピンにハンダ付け、銀/塩化銀線を挿入します。基準線として機能するように頬神経節を含む記録皿のセクション内アメフラシの生理食塩水に直接オス金コネクターピンにハンダ付けし、別の銀/塩化銀線を配置します。目の両方を接続するアンプに接続するBNCケーブルへの電子記録と基準線。
もっとマニピュレータのための十分なスペースがある場合は、追加の外ガラス電極は、同時に複数のニューロンを記録するために追加することができます。
7。神経録音用サクション電極のセットアップ
神経の直径と一致するように先端吸引電極の狭い方の端をトリミングします。電極先端の内径は、次のようなタイトなまたは吸引を確保するための神経の直径よりも僅かに小さくする必要があります。
I2は神経とRNは互いに非常に接近しているので、それらの電極は、スペースを節約するため、同じマニピュレータで保持することができます。同じホルダーの2つのノッチに二つの電極を配置します。二つの電極を回転させて、その先端が1近接していることを確認してください。 I2は神経記録のためにそれらの1つは、RN録音のためのいずれかを選択します。
recordin内アメフラシ食塩水に電極チップを置きます頬神経節を含むグラム皿。吸引電極にシリンジにポリエチレン管の自由端を取り付けます。 アメフラシ生理食塩水で電極を埋めるために注射器を使用しています。近い標的神経の端に電極チップを移動し、I2の神経すなわち 、電極に神経を吸うために注射器を使用しています。電極内の神経の長さは、タイトなシールを確実にするために0.5から1.0 mm程度である必要があります。
RNに添付される電極のための吸引を繰り返します。
セクション6.3で説明されるように対応するBNCケーブルに電極を接続してください。
8。 I1/I3筋収縮を測定するためにフォーストランスデューサのセットアップ
筋肉に力変換器を接続するには、絹縫合糸を使用しています。各縫合糸の湾曲針を曲げて、力変換器に縫合糸を結ぶ。そっとつかみ、持ち上げて筋肉量が少ないと鉗子では、鉗子の別のセットに針を保持し、挿入アップ針で屈曲点（ 図1）に筋を通して針。
トランスデューサはI1/I3筋肉のいずれか背部または横方向に取り付けることができます。背部アタッチメントは、筋肉の左右どちらかの側の活性化により誘発される収縮の測定を可能にする。横アタッチメントは、ニューロンの大多数の強い力が表示されますが、変換器が接続されている側の収縮の測定のみを許可します。
I1/I3の前方、後方、または両方の領域を活性化することができる神経細胞を識別するのに役立つ、咽頭組織直前で、筋肉の後部に力変換器を取り付け、前部に別の力変換器を取り付ける筋肉、顎（ 図1;音符フック）であった。
縫合糸がぴんと引っ張られているが、伸び過ぎないまで力変換器を持ち上げます。縫合糸は、iに多少の余裕があるときにこれを確認するには、力変換器からの測定値を表示その後、t、および測定はわずかにこのベースラインレベルを超えるまでトランスデューサーを持ち上げます。
9。モータープール内の運動ニューロンを同定する
このプロトコルは、細胞外にモータープール内での運動ニューロンを同定するためのプロセスについて説明します。我々は個々のニューロンは、複数の神経、筋（EMG信号または収縮力）の活動を監視するためにAxoGraphソフトウェアを使用しました。（説明を参照）、他の実験では、我々としてもEMGを使用し、そのような実験のセットアップは非常によく似ていますが、このプロトコルでは、運動ニューロンを同定するプロセスのための実例として、筋肉の収縮力を使用していました。
候補ニューロンを見つけるには、優しく刺激と記録⁵選択のための最高の場所であるニューロンソーマ^5（ 図3）の中心上にシース外ガラス電極の先端を下に押すようにマニピュレータを使用しています。以来、しきい値電流F電極は、隣接するニューロンに向かって標的ニューロンの中心から離れる方向に移動されたとき、またはニューロンを活性化すること電極対相馬距離⁵とともに直線的に増加し、刺激選択性が悪くなるでしょう。
運動ニューロンを同定するために、最初に直接のみこのニューロンが発火していることを確認し、細胞外ガラス電極を用いた神経細胞を刺激し、それが筋肉を神経支配するかどうかを調べる。また、ニューロンの識別に重要である細胞外のソーマの記録と神経の録音の間に1対1の関係を確立するために、このニューロンから次に、細胞外記録。
最も外のアンプはチャネル内の同時刺激と記録が許されていませんので、刺激し、記録ソーマ（SOMAチャネル）を刺激モードにし、（ アメフラシニューロン⁵の例えば 6ミリ秒）簡単なアノード電流を適用するために使用するチャンネルを設定ソーマ（ 図4A、5A、音符の矢印1のInの両方の数字）、（ 例えば 200μA）、低電流から開始し、徐々に神経細胞のバーストまで電流を増加させる。
ニューロンがバーストに活性化されると、人はすぐに刺激モードから録画モード（;音符の矢印2両図において、図4A、5A）にソーマチャンネルを切り替える必要があります。しかし、それでも人間の応答遅れのため相馬刺激と記録の間に遅延があるでしょう。
妥当な時間のためのニューロンが起動するときは、それはソーマの記録から、神経上の1対1の対応する活動電位を観察することが可能でなければなりません（S）を介してニューロンプロジェクト（ 図4B、5B、注破線）だけでなく、神経細胞（ 図4A、5Aにより発生する力;音符青箱）。ニューロンは、相馬の記録が開始される前に発射を停止した場合、長い時間のためにそれをアクティブにするために電流を増加させる。
細胞外の信号対雑音比録音は電極の位置とソーマのサイズによって異なります。細胞外記録がソーマサイズの増加と電極 - ソーマの距離が小さくなるほど大きくなるだろう。ノイズだけ狭い範囲で変化するので、信号対雑音比もソーマのサイズが大きくなると、電極 - ソーマの距離が減少するにつれて増加します。信号対雑音比の最も一般的な範囲は4:1〜8:1である。
運動ニューロンは、細胞体の位置、神経突起や筋肉の神経支配^4,6,7としての特性に基づいて識別することができます。 2つだけBN2sがBN2s上の活動を監視することにより、頬部に取り付けられているので、1は、筋肉の収縮力が唯一の細胞外刺激により活性化ニューロンによって引き起こされていることを確認することができます。
例えば、B3は頬神経（図3の吻側側に位置し、I1/I3筋（200〜350グラムの重量を量る動物におけるソーマの直径300から400μm）のための大規模な運動ニューロンである）。それが唯一の同側のBN2を通じてプロジェクト、およびI1/I3筋の前部と後部の両方の部分を神経支配する。ほとんどの時間、それをアクティブにすると、後方力（9実験のうち8）より大きい前歯を生成します。
ニューロンが特定された後、その活性は、後述するように誘発することができる細胞外ガラス電極（ 図4、図5）を介して別の摂食のような行動に記録することができます。ソーマで細胞外記録では、さまざまなニューロンの活動を含む神経録音よりもはるかに特定されます。
egestiveような運動プログラムを誘導するために、パルス¹⁹の1から2分（2Hzの、各パルスは1ミリ秒です）BN2-刺激する。この刺激は確実にこの設定でegestiveパターンを生成します。十分な電流で（ 例えば 300μA）、パターンは、刺激の持続時間のために持続することがある。時には直後に発生した複数のパターンがあるだろう刺激が終了します。
ingestiveような運動プログラムを誘導するために、直接脳の神経節¹⁵のシース上に固体カルバコールの少ない結晶を配置します。一つはカルバコール露出のレベルを制御したい場合には、 アメフラシ生理食塩水に1〜10 mMのカルバコールのソリューションを使用しています。濃度が高いほど反応を誘発する可能性が高くなります。反復的なパターンは、一般的に5分以内に開始され、ダウンを実行するために開始する前に、約10〜15分続くかもしれない。
カルバコール数回洗浄し、少なくとも30分間待機した後、カルバコール、その後のアプリケーションは、よりingestiveような運動パターンを誘発する脳の神経節に追加することができます。
特定のモータープールで複数の運動ニューロンが識別され、モーターのプログラム中に特徴付けられてきた後、1つはすぐに将来の仕事でこれらのニューロン（ 図6を識別するための最小限の情報を必要とする非常に単純化された診断法を開発することがあります</ strong>）を、 例えば中断頬量産準備または in vivo インチ基準はソーマのサイズと位置、神経突起、神経のユニットサイズ、および運動パターン間に活動のタイミングを含むことができる。