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方法論記事

体外における筋モータープールのために運動ニューロンの識別

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DOI:

10.3791/50189

2013年3月25日

この記事について

サマリー

大同定ニューロン(と動物では例えば軟体動物)、モータープールの分析は、細胞内の技術を使用して行われ 1,2,3,4。最近、我々は細胞外で個々の神経細胞を刺激し、記録する技術を開発アメフラシカリフォルニ 5。我々は今、一意に識別してモータープール内の運動ニューロンを特徴づけるためにこの手法を使用するためのプロトコルを記述します。

要約

大同定ニューロン( 例えば軟体動物)、モータープールの分析と動物では細胞内のテクニックに1,2,3,4を使用して行われます。最近、我々は細胞外にアメフラシカリフォルニ 5で個々の神経細胞を刺激し、記録する技術を開発しました。我々は今、一意に識別してモータープール内の運動ニューロンを特徴づけるためにこの手法を使用するためのプロトコルを記述します。

この細胞外手法には利点があります。まず、細胞外電極は刺激し、記録ニューロンをシース5を通っているので、削除する必要はありませんすることができます。このように、神経細胞は、細胞内のものに比べて、細胞外の実験でより健康になります。ガングリオンは、シースのピンニング適切により回転される場合、第二に、細胞外電極は、より容易かつ効率的に同じ準備で複数のニューロンを識別できるようになり神経節、両側の神経細胞にアクセスすることができます。第三に、extracelluLAR電極が細胞に侵入する必要はありません、したがって、容易にそれらにあまりダメージを与え、ニューロン間で前後に移動することができます。一つはわずか数分持続することがある運動パターンを繰り返す中に複数のニューロンを記録しようとするときに特に便利です。第四に、細胞外電極は、筋肉の動きの間に細胞内のものよりもはるかに柔軟です。細胞内電極引き出し、筋肉の収縮時に神経細胞を損傷することがあります。細胞外電極は優しくニューロン上記シースに押し付けているのでこれとは対照的に、彼らは通常、筋肉の収縮時には、同じニューロン上に滞在し、したがってよりそのまま調剤で使用することができます。

ソーマのサイズや位置、軸索投射し、筋肉の神経支配4:一意細胞外電極を使用してモータープール(特に、 アメフラシでI1/I3筋肉)の運動ニューロンを同定するためには、基準のような細胞内の測定を必要としない機能を使用することができます、6,7。手法を説明するために使用される特定のモータープールのために、我々は軸索突起物を測定するために頬神経から2と3を記録し、個々の運動ニューロンのための筋の神経支配のパターンを決定するI1/I3筋肉の収縮力を測定した。

我々は、迅速な同定のために簡略化された診断法を作成し、運動パターンの間にそれらのタイミングを特徴付ける、筋の神経支配を用いた第1の識別運動神経の完全なプロセスを示しています。簡略化され、より迅速な診断方法は、一時停止頬マス準備8 または in vivo 9 より完全な準備のために優れています。このプロセスは、2,3,13,14 アメフラシや他の動物系で10,11,12他のモータープールに適用することができます。

プロトコル

1。録音皿の調製

  1. 力変換器の実験中に、頬神経、脳神経節、頬質量は力の研究に特化していますラウンドパイレックス皿に入れています。
  2. 実験でingestiveのようなパターンを誘導するために、我々は脳の神経節15に非加水分解性コリン作動性アゴニストのカルバコールを適用する必要があります。頬神経と頬マス上にカルバコールからの直接の接触を回避するには、別のチャンバは頬と頬神経塊( 図1)から脳の神経節を分離するために必要とされている。
  3. 頬の質量が頬神経節よりもはるかに厚いので、それらは同じレベルに配置されません。したがって、この皿は脳神経節( 図1の面積)、頬側神経節( 図1の領域C)、および頬質量(エリアDのためのより深い前室用の中間のプラットフォーム用のバックチャンバーを持つべき図1)。
  4. この料理を作成するには、ラウンド100x15パイレックス皿(高15ミリメートル、直径100mm)で始まります。皿の建設がいくつかはシルガードを注ぐ必要があります。シルガード製品で提供される指示に従ってください。シルガードは異なる注ぐ間に設定することを許可しなければなりません。
  5. 第一流動は、中間プラットフォームとバックチャンバーとの間の壁である皿( 図1の領域B)におけるシルガードの最高レベル....

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結果

図4および図5は、2 I1/I3運動ニューロンを識別するために使用される代表的な結果を示している。 図4は egestive様およびingestive状のパターン( 図4C、4D)の間に大規模な運動ニューロン、B3のソーマの記録を示しています。 B3ソーマ記録の特異性はパターンの間に維持されたことソーマ·チャネル上の1対1対応するスパイクと同側のBN2チャネル( 図4E)ショー。 B3は、パターンの途中から後半トラクション段階に発光します。 図4およびその他の結果(図示せず)から、我々は、B3のBN2ユニットは常に最大のBN2ユニットであることがわかった。したがって、それはまた、BN2録音から直接検出することができます。

図5は egestive様およびingestive状のパターン( 図5C、5D)の間に、B.......

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ディスカッション

そのような軟体動物(例えば、Lymnaea、らせん 、とアメフラシ )、モータープールの分析などの大型同定ニューロンを持つ動物では、通常、細胞内記録1,2,3,4を使用して行われます。このプロトコルでは、我々は独自に外技術を使用してモータープールのための運動ニューロンを同定する方法を説明します。我々は、このプロセスの実例として力の測定値を使用していました。一つは、筋肉の神経支配を測定する筋電図を使用することができます。簡単に言えば、これを行うには、プロトコルは、EMGのレコーディングにI1/I3筋肉の異なる領域にフック電極を取り付けるように変更する必要があります。

細胞外の技術は既に上述してきたそのうちのいくつかは細胞内の技術上のいくつかの利点があります。まず、細胞外の手法は、実験のために神経を準備するより少ない時間と労力を必要とし、ニューロンへのダメージが少なくなります。通常、それはBUCを準備するために20〜30分かかります外実験や細胞内の実験のために頬のマスに接続されている頬神経を準備するには、約.......

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開示事項

我々は、開示することは何もない。

謝辞

この研究は、NIHの助成金NS047073とNSFの助成DMS1010434によってサポートされていました。

....

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
名前 会社 カタログ番号 注釈
塩化ナトリウムフィッシャー·サイエンティフィック S671 生物学、認定
塩化カリウムフィッシャー·サイエンティフィック P217 認定のACS
塩化マグネシウム六水和物アクロスオーガニック 19753 99パーセント
硫酸マグネシウム·7水和物フィッシャー·サイエンティフィック M63 認定のACS
塩化カルシウム二水和物フィッシャーScientifc C79 認定のACS
グルコース(ブドウ糖) シグマアルドリッチ G7528 BioXtra
MOPSはbuffeR アクロスオーガニック 17263 99パーセント
カルバコールアクロスオーガニック 10824 99パーセント
水酸化ナトリウムフィッシャー·サイエンティフィック SS255 認定された
塩酸フィッシャー·サイエンティフィック SA49 認定された
単銃身のガラスキャピラリー AMシステム 6150
フレイミング·ブラウンマイクロピペットプラーモデルP-80/PC サターインスツルメンツフィラメント使用:FT345B
エナメルコーティングされたステンレス鋼線カリフォルニアファインワイヤー 0.001D、コーティング時間
家庭用シリコーン二グルー GE
デュロクイックジェル瞬間接着剤ヘンケル社。
AMのシステムモデル1700アンプ AMシステムフィルタ設定:I2神経/筋肉のための10から500 Hzであり、他のすべての神経のための300から500 Hzの
Pulsemasterマルチチャンネルミュレータワールド·精密機器 A300
刺激アイソレータワールド·精密機器 A360
AxoGraph X AxoGraph科学録音用のソフトウェア
金色のコネクタピン丸型 SA3148 / 1
ゴールドコネクタソケット丸型 SA3149 / 1
シルガード184シリコーンエラストマーダウコーニング
100×15ミリメートルCrystalizingディッシュパイレックス
高真空用グリースダウコーニング
ピペットチップフィッシャー·サイエンティフィック 21-375D
Minutienピンファイン科学ツール 26002から10
モデリングクレイサージェントアート 22から4400
エアーポンプをささやくテトラ 77849
水族館チューブ EHEIM 7783 12月16日mm
エリートAirstone ハーゲン A962
Vannas春はさみファイン科学ツール 15000から08
デュモン5位ファイン鉗子ファイン医学工学総合研究電子ツール 11254から20
キムワイプキンバリークラーク 34155

参考文献

  1. McCrohan, C. R., Benjamin, P. R. Synaptic relationships of the cerebral giant cells with motoneurones in the feeding system of Lymnaea stagnalis. J. Exp. Biol. 85, 169-186 (1980).
  2. Benjamin, P. R., Rose, R. M. Central gen....

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再版と許可

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