で逃避行動のOptogenetic刺激<em&gt;キイロショウジョウバエ</em

サマリー

遺伝的にコードされoptogeneticツール内の特定の神経細胞の非侵襲的な操作を可能にショウジョウバエ脳。このようなツールは、そのアクティベーション、特定の行動を誘発または抑制するのに十分である神経細胞を識別することができます。ここでは、自由に歩いてハエの標的ニューロンに発現しているChannelrhodopsin2を活性化するための方法を提案する。

要約

遺伝的にコードされたツールの数が増えてキイロショウジョウバエ ¹における特定のニューロンの神経活動の非侵襲的な操作を可能にすることを利用可能になっています。これらの中で最も重要なのはそのままで特定のニューロンの活性化またはサイレンシングを有効にして、自由に明るい光を用いて動物を移動optogeneticツールです。 Channelrhodopsin（ChR2）は青色光によって活性化されると、それを表現するニューロンの脱分極を引き起こし、光活性化陽イオンチャネルである。 ChR2は、CO _2の回避、口先拡張と巨大な繊維媒介驚愕反応^2月4日などの特定の行動のための重要な神経細胞を同定するために有効であった。しかしながら、また、ChR2を刺激する光受容体を刺激するために使用される強烈な光源として、これらoptogenetic技術は以前に視覚システムで使用されていない。ここで、我々はデモに光情報伝達を阻害する変異を有するoptogeneticアプローチを組み合わせるハエの視葉は、FOMA-1ニューロンにおける織機敏感なニューロンのクラスターの活性化をnstrate、衝突を回避するために使用されるエスケープ動作を駆動することができます。我々は盲目の飛んでもフォマ-1にChR2の発現を駆動するためにGAL4-UASは転写活性化システムを使用してレンダリングするnorpA遺伝子によってコードされたホスホリパーゼC-β、、、光情報伝達カスケードの重要なコンポーネントのヌル対立遺伝子を用いニューロン。個々のハエは、青色LEDに囲まれた小さなプラットフォーム上に配置されています。 LEDが点灯しているときに、視覚的に駆動織機逃避行動と同様に、飛行中に素早く離陸飛ぶ。我々は、この技術が簡単に自由に飛んで移動中に他の行動を調べるように適合させることができると信じています。

概要

遺伝的にコードされたツールの成長武器は、 キイロショウジョウバエの ¹で、特定の細胞の神経活動を操作するために開発されてきた。これらのツールは、無傷で自由に移動する動物の特定の神経細胞の非侵襲的な活性化またはサイレンシングを有効にしてください。それは時間的に制御し、迅速に誘導することができるので、これらのうち、Channelrhodopsin2（ChR2）、光活性化陽イオンチャネルは、重要な利点を提供しています。時急行ChR2それらが急速に脱分極および^3-5高架発射速度を示す明るい青色（470 nm）の光にさらされていることをニューロン。自由に移動する動物における特定のニューロンのような標的と活性化は、CO _2の回避^3、口吻伸展^2,4、および巨大な繊維媒介驚愕応答⁴などの行動のための特定のニューロンの十分性を明らかにした。しかし、ChR2を刺激するために必要な強烈な光源としてもオペアンプを適用し、光受容体を刺激する視覚系にtogenetic技術が限られていました。光情報伝達を阻害する変異を有するoptogeneticアプローチを組み合わせることで、我々はハエの視葉のニューロンの特定のクラスターの活性化が衝突^6を避けるために使用されるエスケープ動作を駆動することができることを実証した。

ほとんどが、すべてではありませんが、視覚的な動物が近づいてくるオブジェクトとの衝突を避けるために逃避行動を示す。迫り来る衝突が表示されたときに、ハエを歩いたり、静止した、離れて対向衝突^7月9日から、飛行中に離陸。これらの離陸は離陸と不安定な飛行軌道^10,11の前に隆起した翼によって特徴付けられる。この応答は、巨大な繊維媒介驚愕反応、隆起した翼が付いていませんジャンプとは区別され、通常は自由落下転倒^4,9になる。 uniquアール視葉、FOMA-1ニューロンで織機感受性ニューロンの特定のクラスタを特定したエリーが近づいてオブジェクトをエンコードするように調整され、我々はハエの織機の逃避行動への関与を調べるためにしようとした。ここでは、選択的に、これらのニューロンを活性化し、ハエの逃避行動を誘発するoptogeneticsの使用例を示します。

我々は、FOMA-1ニューロンでChR2の発現を駆動するためにGAL4-UASの転写活性化システムを使用しています。 ChR2は補因子は全トランスレチナールが必要であり、これはショウジョウバエ中枢神経系における低レベルで検出されたとしてそれはハエの食事で補わなければなりません。明るい光がChR2を活性化するために使用し、ハエが強い走光の挙動を示すされている^3,4のように^12、我々は、刺激に対する視覚反応の可能性を排除するように努めた。これを行うには、我々は、光情報伝達カスケードの重要なコンポーネントで、ホスホリパーゼC-βをコードしてnorpA遺伝子のヌル対立遺伝子のホモ接合体変異た動物を使用していました。このような変異ハエにおける光受容体は責任することができませんdは^13を点灯させる。エスケープ応答のoptogenetic刺激をテストするために、我々は1つのフライを隔離し、明るい青い光でそれを入浴する必要があります。これを行うには、我々は、ピペットチップ内の個々のハエを配置します。一つのピペットチップは、フライがgeotactically長方形のプラットフォーム上にチップと外を歩いていくようなカスタムホルダーに置かれます。ハエが自由にこのプラットフォームの上に歩くことができる。プラットフォームは、そのプラットフォームの上に焦点を当てた4つの青いLEDアレイ、それぞれ含む3つのLEDに囲まれています。ハエがプラットフォーム上に準備したら、LEDが点灯していると、フライの応答は、高速度カメラ^6を使用^して記録されます。

プロトコル

1。 Channelrhodopsinハエを生成

1. あなたが選んだのGal4ドライバーとクロスUAS-ChR2ハエは、我々は視葉では、FOMA-1ニューロンに発現しているG105-GAL4を使用しています。
2. 青色光刺激に対する視覚反応の可能性を排除するには、両方のフライラインはAW ⁺ norpA背景にあります。
3. 最終結果：W ⁺ norpA; G105-Gal4/UAS-ChR2 +
4. 大人が孵化するの便を運行する航空会社の後、行動分析を実行する前に、3日間、10μM全トランスレチナール（ChR2ために必要な補因子）と光から保護を補った生鮮食品、上で選択しメスを入れた。

2。 10μMのオールトランスレチナール強化食品を作る

1. 20mMのは網膜なるように95％エタノール17.6ミリリットルの全トランスレチナール100mgを溶解します。全トランスレチナールは、すべての回で光から保護しておく。
2. 電子レンジで標準のコーンミールフライ食品を溶かし、触ると暖かくなるまで冷ます。
3. 20mMの50μlを混ぜるフライ食品10mlのバイアルに全トランスレチナール。
4. バイアルが冷却し、光から保護しておくましょう。

3。機器

1. ピペットチップ：標準千μlのピペットチップは〜2.25ミリメートルの細孔径を作成し、先端付近にカットされています。
2. プラットフォーム（ 図1を参照）。
   1. デルリンベース、17センチ×25センチメートルは、¼ "NPTクーラントホースコネクタに合わせて、各角にネジ穴を使用して構築されました。
   2. デルリンから作られた縦型ホルダは、ベースの中央に取り付けられています。全体の寸法は、X 40ミリメートルX 65ミリメートル（幅×奥行き×高さ）25 mmである。 10mm幅の溝は下部のつまみねじで、ホルダーの長さを実行します。プラットフォームは、ホルダの上部に取り付けられたホルダの溝に整列さ3.5ミリメートル径の穴と25ミリメートル×40ミリメートル×10ミリメートル、されています。
3. LEDアレイ（ 図1を参照）。
   1. クーラントホースの4つのアームは、約18センチ、プラットフォームBASに貼付されているクーラントホースコネクタを使用して、e。クーラントホースは、構造的なサポートとしてのみ使用され、冷却目的のために使用されていません。
   2. 適切に等間隔溝は各アームの先端に固定するために、各アームのヒートシンクをつけ込まれることクーラントの最後のピースにカットされています。
   3. 青色LED反乱トライスターはプレカット熱接着テープを使用して、それぞれのヒートシンクに取り付けられている。 Carclo 18°トライレンズがそれぞれトライスターに貼付されています。
   4. LEDのトライスターがBuckPuck DCのドライバと指定どおりに電源に配線されています。我々は、各BuckPuck直列に2トライスターに電力を供給するとのセットアップを配置している。
   5. すべての4つのLEDがトライスターの照明は700 mAでは、我々のプラットフォームで713 W / m ²の照度が得られた。
4. カメラ：カメラは、小型三脚に取り付けられ、プラットフォームの上に置いています。

4。行動アッセイ

1. 簡単に言えば氷の上のハエをanaesthetize。
2. 閉じるには、テープを使用して、ピペットチップ内の個々のハエを配置双方は、先端の終了。
3. ハエが起こされており、積極的にピペットチップを模索していた後、テープを取り出して、垂直ホルダーの溝にピペットを置く。つまみは、所定の位置にピペットチップを保護するために、チップの底を閉じるために使用されます。
4. ハエがピペットチップ（一般に30から60秒）を探るように、ハエがプラットフォームに先端から出てくる直前にカメラの記録を開始します。
5. ハエがプラットフォーム上に浮上した後、1から2セコ待ってから、青色LEDの電源をオンにします。ハエが飛行を開始するまで手動で時刻を測定するためにタイマーを使用します。

結果

ブラインドはどちらChR2または単独G105ドライバ明るい青色光と、その照明に続いて離陸率の低さを示してを表現飛ぶ。ブラインドは、これらのテイクオフは青色光ではなく、自発的な照明によるものであったことを示唆しているにかかわらず、照明（ 図2）の離陸の同じ割合を示し飛ぶ。 ChR2がFoma1ニューロンに発現しているときは、しかし、青色光による照明は、エスケープ応答を誘発する。テストしたハエの50％以上は、照明の1秒以内に離陸し、5秒以内に75％（ 図2）。対照的に、対照ハエのわずか10％は、1秒以内に離陸し、5秒以内に20パーセント。 G105のドライバは、FOMA-1ニューロンとキノコ体のγ-葉の両方で表現されるように、我々は特に付加的な制御としてキノコ体（201Y-GAL4）のこの部分で表現ドライバを使用していました。これらのハエは、（ 図2を実行し 、他のコントロールと同様に、離陸の速度を示した）、FOMA-1ニューロンのoptogenetic活性化はエスケープ応答を誘発したことを具体的に示す。 ...

ディスカッション

私達は明るい青い光でハエを歩いて自由に入浴することによってエスケープ行動のoptogenetic刺激を実証している。このアプローチは、簡単に自由に歩くハエに他の行動を調べるために適合させることができ、単純に我々はより大きな面積で使用されるLEDアレイをタイリングすることにより、より広いプラットフォームにスケーリングすることができます。私たちが説明する安価なカメラのどちらかを使用して、または利用可能な他のカメラシステムは、ユーザーがフレームレートや金利の挙動に合わせて取得された画像の空間分解能を調整することができます。青色LEDは、カメラ用の照明だけでなく、ChR2のアクティベーションを提供するようにさらに、当社のイメージングは​​、LEDが点灯している時間後に制限されています。これが私たちの行動には十分ですが、それ以前のLED照明へ飛ぶの位置や動きを記録する必要がある場合には、カメラの適切なフィルタリングと組み合わせる赤外線範囲の信号を提供する追加の光源は、組み込むことができる。

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材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
			試薬
網膜全トランス	アドバンス科学＆ケミカル株式会社	R3041
			機器
熱は9.2℃/ Wのシンク	Luxeonstar	LPD30-30B	高30mm角X 30ミリメートル
Carclo 18°トライレンズ	Luxeonstar	10507
ブルーRebelはトライスターベースのLED	Luxeonstar	MR-B0030-20T	470nmと、174 LM @ 700ミリアンペア。
700ミリアンペアBuckPuck dcドライバ	Luxeonstar	3021-DE-700
BuckPuckドライバ用ワイヤーハーネス	Luxeonstar	3021-HE
プレカット熱接着テープ	Luxeonstar	LXT-S-12	20ミリメートル六角ベース
スナップ-Locのクーラントホース、¼ "のID	マクマスター - カー	5307K49
スナップ-Locのクーラントホースコネクタ	マクマスター - カー	5307K39	¼ "NPTおねじ
実験室グレードスイッチングモードプログラマブルDC電源	BKプレシジョン	1698
EXILIMカメラ	カシオ	EX-FH20