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方法論記事

細胞培養におけるRNA合成、処理およびディケイの高解像度遺伝子発現プロファイリングのための新規転写されたRNAの代謝標識

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DOI:

10.3791/50195

⸱

2013年8月8日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Max von Pettenkofer Institute, 2Department of Medicine, University of Cambridge, 3Institute for Informatics, Ludwig-Maximilians-University Munich

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

全細胞RNAは、短期的RNA合成と崩壊の変化と同様に、RNAプロセシングの動態を研究するための貧乏人のテンプレートが用意されています。ここでは、これらの制限を克服することができ、新たに転写されたRNAのチオール特有のビオチン化および精製し、4 - チオウリジンと新しく転写されたRNAの代謝標識を記述します。

要約

全トランスクリプトームマイクロアレイや次世代シーケンシングの開発は、細胞の遺伝子発現の複雑さの理解に革命をもたらしました。関与する分子機構の理解を深めるとともに、下地動態の正確な測定がますます重要になってきた。ここでは、これらの強力な方法論は、テンプレートサンプルそれら研究、 すなわち全細胞RNAの本質的な特性のための主要な制限に直面しています。多くの場合、全細胞RNAの変化が十分な解像度で、基礎となる分子事象とその動態を表現するためにいずれか遅すぎるか早すぎる起こる。また、RNA合成、加工、及び減衰の変化の寄与を容易に区別されていない。

最近では、これらの制限を克服するために、高解像度の遺伝子発現プロファイリングを開発した。我々のアプローチは、4 thiouriで新しく転写されたRNAの代謝標識に基づいていますチオール - 特異的ビオチンとストレプトアビジンでコートした磁気ビーズを使用して、新しく転写されたRNAの厳格な精製しダイン（ひいては4SUタグ付けとも呼ばれる）。それは、脊椎動物、 ショウジョウバエ 、および酵母を含む生物の広い範囲に適用可能である。我々は正常、転写因子活性のリアルタイム動態を研究するRNA半減期の正確な測定を提供し、RNAプロセシングの動態に新規な洞察を得るために4SU​​タギングを適用した。最後に、計算モデルは、基礎となる分子機構の統合された包括的分析を生成するために使用することができる。

概要

遺伝子発現プロファイリングは、細胞プロセス及び関連する複雑な相互作用ネットワークを研究するために使用される重要なツールである。 mRNAの存在量に関する研究は、通常、基礎となる分子メカニズムに基本的な洞察を得るための最適な方法となっている。全トランスクリプトームマイクロアレイ1と、RNA（RNA-seqの）2-4より最近では、次世代シーケンスの開発は、このアプローチを燃料とする。これらの技術は、細胞の遺伝子発現の複雑さの理解に革命をもたらしているが、彼 ​​らは、テンプレートサンプル、 すなわち全細胞RNAの本質的な特性のための主要な制限に直面しています。トータルRNAレベルで最初の、短期的な変化は、転写率の変化と一致していませんが、それぞれの転写産物のRNAの半減期に本質的に依存している。転写因子のための短命のトランスクリプト、 例えばエンコードの五倍誘導は、トータルRNAで容易に検出される一方時間以内に、長命の転写産物の同じ誘導、代謝酵素のための例えばエンコードは、実質的には不可視のままです。加えて、たとえ完全なシャットダウン（> 1,000倍ダウンレギュレーション）五時間のRNAの半減期と平均遺伝子の転写率は、単にだけ二重減少するために、その全RNAレベルに5時間かかりますで。従って、トータルRNAの分析は、調節機能5と転写因子や遺伝子をコードする多くは短命転写産物のアップレギュレーションの検出に有利で ​​ある。また、規制の真の運動カスケードが隠されている、プライマリシグナリングイベントは二次と区別することはできません。両方、順番に、下流のバイオインフォマティクス解析の大幅な偏りが生じる可能性があります。第二に、トータルRNAレベルの変化は、RNAの合成または減衰の変化に起因することはできません。後者の測定はtranscriptiをブロック細胞侵襲アプローチ、 などを必要とするアクチノマイシンD 6、そして時間をかけて継続的なRNA崩壊の拡張監視を使用してください。 5の哺乳類細胞における平均mRNAの半減期で- 10時間5,7、ほとんどの遺伝子のmRNAレベルは、二重転写逮捕の数時間後に未満減少しております。これらむしろ小さな違いは、基礎となる数学の方程式の指数関数的性質に起因する細胞遺伝子の大多数のmRNAの半減期の著しく不正確な測定値になる。我々の遺伝子の約半分が選択的スプライシングイベント8の対象であることを最後に、全細胞RNAのRNA-seqのが明らかになっている間には、基本となる動力学と同様、組織とRNAプロセシングのコンテキスト固有の規制を導くダイナミックメカニズムはよくわかっていないままです。また、特に非コーディングRNA用の差動遺伝子発現に対する処理RNAの寄与は、決定されていない。要するに、これらの制限のためには大きな障害を表す基盤となる分子機構のバイオインフォマティクス運動モデリング。

我々は、最近のアプローチを開発し、これらの問題を克服するために、5,7,9、高解像度の遺伝子発現プロファイリングと呼ばれる。なお、4 -チオウリジン（4SUタギング）、天然に存在するウリジン誘導体を使用して、新しく転写されたRNAの代謝標識に基づいており、細胞増殖および遺伝子発現の干渉を最小限（ 図1参照）5と新たに転写された転写物への直接アクセスを提供する10-12。その急速な取り込み、4SU-三リン酸へのリン酸化、および新たに転写されたRNAへの取り込みにおける4SU結果に真核細胞の暴露。全細胞RNAの単離の後、4SU-標識されたRNA画分はチオール - 特異的ビオチンと新たに転写されたRNA間のジスルフィド結合を生成するビオチン化される。 '全細胞RNA'は、その後、定量的にラベル分け（ '新たに転写'）とラベル付けされていない（ 'プレexistinすることができますストレプトアビジンでコーティングされた磁気ビーズを用いて高純度グラム '）RNA。最後に、標識されたRNAは、単にジスルフィド結合を切断する還元剤（ 例えば、ジチオスレイトール）を添加し、ビーズから新たに転写されたRNAを解放することによってビーズから回収される。

新たに転写されたRNAは4SU暴露期間中にすべての遺伝子の転写活性を示しています。分のタイムスケールで4SUタギングは、このように、真核生物の遺伝子発現のスナップ写真とダウンストリームバイオインフォマティクス解析（ 例えばプロモーター解析）のための理想的なテンプレートを提供しています。定常状態が想定される場合、新たに転写/合計の比率では、新たに転写/非標識及び非標識/全RNAは、正確なRNAの半減期7,13への非侵襲的なアクセスを提供します。また、4SUタギング（5分4SU-RNA）の、わずか5分で15歳未満と60分4SU-RNAである。後精製し、その新たに転写されたRNAを注意することが重要です超短と次第に長く4SUタギングRNA-seqのと組み合わせて、単一の実験設定で両方を行う場合は、RNAプロセシングの動態は、ヌクレオチド分解能9で明らかにされています。最後に、計算モデルと組み合わせて新たに転写され、総RNAの経時的分析は、RNA合成と崩壊14の統合的な分析を可能にする。

結論として、このアプローチは、真核細胞におけるRNA合成、加工、及び劣化のダイナミクス直接分析を可能にする。これは、哺乳類、昆虫（ ショウジョウバエ ）、両生類（ アフリカツメガエル ）、および酵母5,15,16を含むすべての主要なモデル生物で適用されます。これは、マイクロアレイ解析5,17、RNA-seqの9,13,14と直接互換性があり、 生体内で 12,15 に適用されます。ここでは、詳細な方法論を、ラベルを分離、培養した哺乳動物細胞で新たに転写されたRNAを精製する。また、ポテンショらの問題や落とし穴が議論されています。

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プロトコル

1。 4チオウリジンで代謝標識

実験装置/スケジュールの詳細な計画を作成し、細胞培養に4SUを追加するときに、サンプルを収穫するときなど 。各条件の間には少なくとも5分間プラン。一度に一つの条件のセルを扱う。最大を扱う。 3 - 特定の時点で5皿。温度とCO 2濃度の変化を最小限に抑えるために、できるだけ早く、細胞を扱う。これは細胞タンパク質へ4SU標識RNAの架橋につながる可能性があるので4SUが追加された後に明るい光に細胞をさらすことは避けてください。

ラベリングの開始

  1. ただ滅菌ファルコンチューブに各条件のための使用と4SUのピペット必要量の前に解凍4チオウリジン（4SU）。
  2. 料理オフ細胞培養培地（10cmディッシュあたり5 ml）を必要量を取り、4SU含有ファルコンチューブに追加し、徹底的に混ぜる。食器から残りの培地を除去し、廃棄する。
    3. <李>皿に戻し4SU含有培地を適用します。

ラベリングの終わり

  1. 細胞から細胞培養培地を除去する。各プレートにトリゾール5mlのを追加します。複数の時点または条件を含む複雑な実験では、このステップは最高の2人、培地を除去し1、他追加トリゾールによって行われ、ライセートを収穫されています。
  2. 完全な細胞溶解を室温で5分間インキュベートする。
  3. 追加トリゾールで慎重プレートをすすぎ、10ミリリットルピペットを使用してください。これは完全な細胞溶解と試料回収を助ける。皮膚や目に接触して取得するときトリゾールは極めて危険であるように取り扱いに注意して！手元フェノール火傷（ 例えばポリエチレングリコール300または工業変性 ​​アルコール（70:30）で400）のための解毒剤を持っている。ポリプロピレンチューブにサンプルを転送します。標準のファルコンチューブ）は、これらの高グラム力に抵抗はありませんのでご了承ください。サンプルは私が全RNAまで少なくとも1ヶ月、-20℃で保存することができますsが用意しました。

2。修正トリゾールプロトコルを使用したRNAの準備

  1. 1ミリリットルのクロロホルムを（MLトリゾール当たり0.2 ml）を加え、15秒間激しく振り。 3分 - 2室温でインキュベートする。
  2. 4℃で15分間、13,000×gで遠心℃、
  3. 新しい15ミリリットルのポリプロピレンチューブに水上相を（RNAを含む）を転送します。
  4. 追加½RNA降水バッファとイソプロパノールの双方の反応ボリューム（3ミリリットル上澄みに例えば 1.5ミリリットルRNA降水バッファー、1.5 mlのイソプロパノールを追加します）。
  5. よく混ぜる。 10分間室温でインキュベートする。
  6. 4℃で10分間、13,000×gで遠心℃、上清を捨てます。
  7. 簡単にスピンダウン（5,000×gで30秒間）と200μlのピペットで残留イソプロパノールを除去。
  8. 75％エタノールを等量を追加し、ペレットデタッチまでチューブを振る。これは残滓の除去を行うことができるように多くの小さな部分にそれを壊すことは避けてくださいリットルエタノール難しい。
  9. 4℃で10分間、13,000×gで遠心℃、上清を捨てます。
  10. 簡単にRNAをスピンダウンし、200μlのピペットで残りのエタノールを除去。ステップを繰り返して、20μlのピペットで残りのエタノールを除去。この2つの手順の後、ペレットのさらなる乾燥が行われるべきではない。
  11. 100μgの予想RNA収量当たりのH 2 Oを100μLを加え、5を上下にピペッティングでよく混ぜる- 6回RNAを溶解を助けるために。
  12. 溶解し、65に加熱したRNAを変性℃で10分間（シェーカー）のため、すぐに氷上に置きます。を
  13. 製造元の指示に従って、光度計分光光度計を用いて260nmのRNA濃度を測定します。このRNAは、少なくとも一ヶ月-80℃で保存することができる。

3。新たに転写されたRNAのチオール特有のビオチン化

  1. 60で始まる - 全細胞RNAの80μgのを。
  2. ラベリング反応を構成する。以下の中でピペットオーダー（μgのRNAあたり）：
    1. 1μlの10倍のビオチン化バッファー
    2. 7μlのRNA（ヌクレアーゼフリーのH 2 Oで希釈した1μgのRNAを含有）
    3. 2μlのビオチンHPDP（1 mg / mlのDMF）

常に最後ビオチンHPDPを追加し、ピペッティングにより直ちに混ぜる。ビオチンが沈殿する場合には、DMF含有量は、40％の最終濃度まで増加させることができる。

  1. 回転に伴って1.5時間室温でインキュベートする。
  2. 等量のクロロホルムを加える。精力的に混ぜる。相を分離し始めると泡が消え始めるまで3分 - 2インキュベートする。
  3. 4℃で5分間、20,000×gで遠心慎重に新しいチューブに上部の水相を転送します。
  4. 一度ステップ3.4と3.5を繰り返します。あなたは、RNAの損失を減らすために2 mlの位相ロックジェルヘビーチューブに、この手順を実行することがあります。
  5. RNA沈殿物：追加1/10の5のNaClの量と等量の水相にイソプロパノール。
  6. 4℃で20分間、20,000×gで遠心上清を捨てます。
  7. 、75％エタノールを等量を追加4℃で10分間℃で20,000×gで遠心分離し、上清を捨てる。
  8. 簡単にスピンし、200μlのピペットで残留エタノールを除去。
  9. 簡単にスピンし、20μlのピペットで残留エタノールを除去。
  10. RNAは乾燥させないでください。 50でそれを再懸濁する- 100μlのH 2 O（1μgの入力RNA当たり約1μL）。 6回 - 5を上下にピペッティングしてよく混ぜる。
  11. RNAの分解を除外するelectrophoretical分析によってRNAの品質を確認してください。

4。 4SU​​-組み込み（オプション）のドットブロット分析

4SU​​取り込みを容易にビオチン化RNAのドットブロット分析によって決定することができる。これは、トラブルシューティングおよびビオチン化DNAオリゴコントロールに対する4SU取り込み率の推定を可能にするオプションの手順です。このアッセイのために我々Rステップ3.2 4SU標識RNAのビオチン化のために代わりにビオチンHPDPのヨードアセチル - ビオチン使っecommend。 4SU​​-RNAの不可逆的なビオチン化でこの結果。したがって、カラムベースの方法（ 例えば 、RNイージー）ビオチン化RNAの非常に小さい量（ 例えば、5μgの）の回収に使用することができる。 RNAはビオチンHPDPを用いてビオチン化しながらも、このアッセイに適しており、結果として得られる信号が弱いと不利な信号対雑音比（ 図3）である。

  1. セクション1と2に記載されているように4SU標識及び全細胞RNAを単離するためのプロトコルに従ってください。
  2. ヨードアセチル-ビオ​​チンとビオチンHPDPを交換するセクション3で説明し、完全に過剰なヨードアセチル-ビオ​​チン残渣を除去するために2つのクロロホルム抽出を行うようにビオチン化RNA 4SU標識。
  3. 記載またはRNAの場合、少量（<10μgのでカラムベースのアプローチを（ 例えばをRNeasy）使用としてイソプロパノール/エタノール沈殿によりビオチン化RNAを回復）が使用されます。
  4. 10分間ロッキングとヌクレアーゼフリー水でゼータメンブレンをインキュベートする。
  5. ヌクレアーゼフリー水の膜を取り出し、両者の間にきれいなペーパータオルで膜を配置し、しっかりと押して、過剰な水分を除去する。空気乾燥で5分間膜するとよりよいのドットになります。
  6. 各サンプルについて、氷冷ドットブロット結合バッファー（10 mMのNaOHを、1mMのEDTA）を使用して、200 ngの/μlのRNAを20μlを準備します。ピペッティングによりゼータ膜にこの希釈液5μl（RNA すなわち 1μgの）と同様に3以降の10倍希釈（ すなわち 、それぞれ100、10、および1 ngのRNAを、）を適用します。ピペットチップの空のラックを介してピペットを均等に分散間隔を提供するために使用することができる。あるいは、製造元の指示に従ってドットブロット装置を用いる。
  7. 正CONTとして20〜ng /μLの20 PG /μL（ すなわち 0.1〜100 ngのオリゴ）の範囲の濃度でビオチン標識DNAオリゴを5μlを適用ピペッティングにより膜へROL。ネガティブコントロールとしてビオチン化、4SU-ナイーブサンプルを使用してください。
  8. 空気乾燥5分間メンブレン。
  9. ロッキングと40ミリリットルブロッキング緩衝液中で30分間メンブレンをインキュベートする。
  10. 15分（5 mlのPBS + 5ミリリットルの20％SDS +10μlのストレプトアビジン - ホースラディッシュペルオキシダーゼ）が1:1000ストレプトアビジン - ホースラディッシュペルオキシダーゼ10mlのメンブレンをインキュベート
  11. 5分間40ミリリットルPBS + 10％SDS（20ミリリットルPBS + 20ミリリットルの20％SDS）で二回膜を洗浄してください。
  12. 5分間40ミリリットルPBS + 1％SDS（38 mlのPBS + 2ミリリットルの20％SDS）で二回膜を洗浄してください。
  13. 5分間40ミリリットルPBS + 0.1％SDS（40ミリリットルPBS + 200μlの20％SDS）で二回膜を洗浄してください。
  14. 2清潔なペーパータオルの間に膜を置き、しっかりとそれらを押すことによって、過度の流体を除去。
  15. メーカーの指示に従ってECLを用いた膜結合HRPを可視化する。
  16. プラスチックフォイル/袋にメンブレンを置き、気泡を除去し、暗所で2分間インキュベートする。
  17. 膜にさらさ1用フィルム - 5分。

5。ストレプトアビジンコート磁気ビーズを用いて標識し、非標識RNAの分離

  1. 熱は℃の水浴中で65に（サンプル当たり3ミリリットル）洗浄バッファー。
  2. ヌクレアーゼフリーH 2 Oの中で新鮮な100mMのジチオスレイトール（DTT）を準備超微細スケールの上に置かれ、クリーン50ミリリットルファルコンチューブにDTTパウダー30mgの - 15デカントによってそう。ヌクレアーゼフリーのH 2 Oの必要量を計量して加える
  3. 熱は10分変性し、直ちに氷上に場所にするために、65℃にRNAサンプルをビオチン化。
  4. 磁気スタンドにμMACS列を置きます。 （ - 8サンプル最適である6）我々は一度に12以上のサンプルを処理しないことをお勧めします。
  5. 1ミリリットルの室温洗浄バッファーでミルテニー列を事前平衡。これは、約15分かかります。
  6. 一方、50にストレプトアビジンビーズを100μlを加える - ビオチン化RNAを100μl。回転で15分間室温でインキュベートする。
    7. <リチウム>列のいずれかが、今では排出開始していない場合、これは穏やかに手袋をはめた指でカラムの頂部を押すことによって容易にすることができる。いったん流れが列が容易に排水を開始しました。
  7. 列にRNA /ビーズを適用します。フロースルーは未標識RNA画分を回収したい場合を除きます（セクション7を参照）捨てる。
  8. 65°Cの洗浄緩衝液（65℃のバッファをペッティングするとき1ミリリットルピペットチップが縮小℃）0.9ミリリットルで3回洗浄する。
  9. 0.9ミリリットルの室温洗浄バッファーで3回洗浄する。
  10. ピペット新しい2 mlチューブに700μlのBuffer RLT（をRNeasyのMinEluteクリーンアップキット、キアゲン）と列の下に配置します。
  11. 列にの100mM DTTを100μlを加えることによりRLTバッファに新たに転写されたRNAを溶出。
  12. の100mM DTTの別の100μlのを追加することで、同じチューブに3分後に2回目の溶出ラウンドを行う。

6。新たに転写されたRNAの回収

ontent ">製造者の指示に従ってのRNeasyのMinEluteクリーンアップ（キアゲン）プロトコルを続行します。光度計分光光度計を用いて25μlのヌクレアーゼフリーH 2 Oを測定RNA濃度の溶出。提出する前に、RNAを解凍し、再凍結する必要性を回避するためにそれは、ハイスループットアッセイに、我々は新たに転写されたRNAを精製された直後にcDNAを準備をお勧めします。製造元の指示に従ってcDNA合成のために、20μlのcDNA合成ミックスで新たに転写されたRNAの2.5μlを使用する1を用いて定量RT-PCRのコントロールを実行：cDNAのミックスの10希釈-80で保存RNA℃まで。

7。ラベルなし、バインドされていないRNAの回収（オプション）

結合していない場合には、RNAを回収する必要があり、フロースルー（列にRNA-ストレプトアビジンビーズ溶液を添加した後）およびその後の沈殿のための最初の洗浄を収集し、組み合わせる。通常、それはTHIとして結合していないRNAの50％だけ沈殿するのに十分であるsが出発物質の> 80％が含まれています。

  1. 等体積のイソプロパノールを追加する（まだ塩が洗浄緩衝液は、すでに1MのNaClを含有するように添加する必要はない）。
  2. 4℃で20分間、20,000×gで遠心上清を捨てます。
  3. 、75％エタノールを等量を追加4℃で10分間℃で20,000×gで遠心分離し、上清を捨てる。
  4. 簡単にスピンし、200μlのピペットで残留エタノールを除去。
  5. 簡単にスピンし、20μlのピペットで残留エタノールを除去。
  6. RNAは乾燥させないでください。 100μlのH 2 Oに再懸濁し6回 - 5を上下にピペッティングしてよく混ぜる。振とうしながら10分間65℃でインキュベートし、氷に直接転送します。
  7. RNAの分解を除外するelectrophoretical分析によってRNAの品質を確認してください。

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結果

1。出発物質と期待利回り

4SU​​暴露の1時間（時間）に続いて新たに転写されたRNAは、約1を表す - 全細胞RNAの4％。彼らはもはや細胞増殖/複製を考慮してRNAを合成しないので、これは成長逮捕細胞で低くなります。全RNAの80μgの - 1時間ラベリングするとき、我々は60でアッセイを開始をお勧めします。ビオチン化工程の後に参照するのは難しいです小さなRNAペレットの総RNAの結果未満の30μgの始まるので、簡単に失われる可能性があります。入力RNAレベルは、ラベリングの非常に短い期間（10 - 10分間、 例えば 、5）のような多くの150のような目安に増加させることができる。 RNAラベリングの持続時間は、1時間に5 ​​分〜60％〜80％、9〜新たに転写されたRNAが増加に短命のイントロン配列の寄与から短縮された場合。イントロンは、実質的に長いコード配列、ならびに5'-および3'-UTRを、新しく転写の量と比較される短期あるいは超短4SUタグ付け後に精製することができるRNAは、直線的に低下しない。このように、我々...

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ディスカッション

新たに転写されたRNAの代謝標識は、実質的に興味のある生物学的な問題に対処するためのより適切なテンプレートを提供することで、マイクロアレイとRNA-seqのようなハイスループット技術の能力を強化しています。現在のプロトコルでは、広範な最適化を行った。これは、新たに転写されたRNAの> 1,000倍濃縮を可能にし、再現性の高い結果を提供します。

新たに転写されたRNAは4SUへの細胞の曝露時間の間だけリアルタイム転写活性を描写するよう4SUタギング実験の実験計画は非常に重要である。刺激後に転写率の実際の変更は、すでに沈静化している場合は、合計RNAレベルでの変更がまだ検出可能であっても新たに転写されたRNAを解析する際に、これらは惜しまれることでしょう。したがって、基本的な生物学をよく理解は実験と同様に最適な期間Oを定義することが重要です4SU​​露出のためのF時間。以下では、お薦めなどの最も重要な手順については、一般的な落とし穴を避けるための方法を提供します。

原液とプラスチックの構造の作製

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開示事項

著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。

謝辞

私たちは、原稿を注意深く読むためアミエリーガンに感謝したいと思います。この作品は、CCFにLDとDFG助成FR2938/1-1にNGFNプラス助成金＃01GS0801、MRCフェローシップ助成G1002523とNHSBT助成WP11-05でサポートされていました

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
4-チウリジンカーボシンスT4509滅菌H2Oに50 mMストックを準備し、-20°Cで保存します。50-500 のアリコートの C μl、未使用の試薬を廃棄し、再凍結しないでください。
TrizolInvitrogen15596026 (100 ml)、15596018 (200 ml)WARNING - 腐食性で健康に有害! フェノール解毒剤 (PEG-メタノール) への即時アクセスを確保します。4°Cで保管してください。
クロロホルムシグマ372978警告 - 健康に有害
イソプロパノールシグマ650447
エン酸ナトリウム、ヌクレアーゼフリーシグマC8532ヌクレアーゼフリーの水を使用して 1.6 M ストック溶液を調製します。
5M ヌクレアーゼフリー NaClSigma71386ストック溶液
ヌクレアーゼフリー H2OSigmaW4502ヌクレアーゼフリーのチューブに1mlのアリコートを作ります。
RNA沈殿バッファー1.2M NaCl、0.8 Mクエン酸ナトリウム、ヌクレアーゼフリー水中。事前にヌクレアーゼフリーの条件で準備してください。50mlのファルコンチューブに室温で保存してください。
エタノールシグマ459844ヌクレアーゼフリーの水と一緒に使用して80%エタノールを調製し、-20°Cで保存してください。
1 M ヌクレアーゼフリー Tris Cl、pH 7.5Lonza51237原液
500 mM ヌクレアーゼフリー EDTA、pH 8.0Invitrogen15575-020原液
10x ビオチン化バッファー (BB)100 mM Tris pH 7.4、10 mM EDTA ヌクレアーゼフリー水溶液中で、1 mL のアリコートを作成します。
ジメチルホルムアミド(DMF)SigmaD4551
EZ-Link ビオチン-HPDPPierce2134150 mg ビオチン-HPDPを50 ml DMFに溶解し、1 mg/mlのストック溶液を調製します。やさしい加温により、可溶化が促進されます。4°Cで保管します。1mlのアリコート中のC。
フェーズロックゲル ヘビーチューブ 2.0 mlEppendorf0032 005.152クロロホルム抽出ステップのオプション。
ゼータ膜BIORAD162-0153
10x ドットブロット結合バッファー100 mM NaOH, 10 mM EDTA
ビオチン-オリゴ5'-ビオチン, 25 ヌクレオチド, 任意の配列
ドデシル硫酸ナトリウムフィッシャーBPE9738100 ml 20% ストック溶液の場合、20 g SDS を 80 ml PBS pH 7-8 に添加し、容量を 100 ml に調整します。 すべての高パーセンテージ SDS 溶液を 20°C 以上に保ちます。解決策はわずかにSDSが沈殿するはずです。
EZ-Link Iodoacetyl-LC-BiotinPierce2133350 mg iodoacetyl-biotin を 50 ml DMF に溶解して、1 mg/ml ストック溶液を調製します。やさしい加温により、可溶化が促進されます。4°Cで保管します。1mlのアリコート中のC。不可逆的なチオール特異的なビオチン化を生じます。
リン酸緩衝液 生理食塩水Gibco10010-015
ドットブロットブロッキング緩衝液20 ml 20% SDS と 20 ml 1 x PBS pH 7-8 を混合し、EDTA を最終濃度 1 mM まで添加します。
ストレプトアビジン-西洋ワサビペルオキシダーゼ ベクターラボラトリーズSA5004-20°Cで保存 10 ml 20% SDS を 10 ml 1 x PBS と混合します。20 μ を加算します。l ストレプトアビジン-HRP 使用前に。
ECL試薬GEヘルスケアRNP2109メーカーの指示に従って使用してください。
スーパーRX、X-RAフィルム、18x24 cm富士フイルム47410 19236
μMacs Streptavidin KitMiltenyi130-074-101ビーズを4°Cで保管します。
Tween 20SigmaP1379
洗浄バッファー100 mM Tris pH 7.4、10 mM EDTA、1 M NaCl、0.1% Tween 20 ヌクレアーゼフリー H2O 溶液。
ジチオスレイトール (DTT)シグマ43817ヌクレアーゼフリーのH2Oで100 mM DTTとして調製し、使用前に常に新鮮に調製してください。
RNeasy MinElute KitQiagen74204カラムを 4 °C で保存します。C、室温でのキットの残りのコンポーネント。
1.5mlスクリュートップポリプロピレンチューブSarstedt72.692.005ジメチルホルムアミドに対応
2.0mlスクリュートップポリプロピレンチューブSarstedt72.694.005ジメチルホルムアミド
15mlチューブBDファルコン352096ジメチルホルムアミド
50mlチューブBDファルコン352070メチルホルムアミドと互換性があります
すべての溶液/試薬は、特に指定のない限り室温で保存する必要があります。
Equipment
UV/VIS分光光度計Thermo ScientificNanoDrop 1000または同等品。少量(1-2μl)過度のサンプル損失を避けるための低RNA濃度の測定用。
ポリプロピレン15ml遠心分離管VWRインターナショナル525-0153標準的な15mlチューブとは対照的に、これらは最大15,000 × g
遠心分離機ベックマン・コールターアバンティJ-25または13,000×に達することができる同等の機器。g
ローターベックマンコールターJLA-16250または13,000×に達することができる同等の機器。g
15mlチューブ用アダプターLaborgeräte Beranek356964または13,000×に達することができる同等の機器。g
冷蔵卓上遠心分離機Eppendorf5430 Rまたは同等品。
サーモミキサーエッペンドルフサーモミキサー コンパクトまたは同等品。
マグネットスタンドMiltenyi Biotec130-042-1091つのスタンドは8 μMacの列。
WaterbathGrantSUB Aqua 5または同等品。
超微細スケールA&DGR-202または同等品。
E-Gel iBase Power SystemInvitrogenG6400UKRNAゲル用、または同等品です。
E-Gel EX 1% アガロースプレキャストゲルInvitrogenG4020-01RNA ゲル用、または同等品。
クに対応 に対応 ジ高速高速

参考文献

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