CD133の患者由来の細胞培養および分離 ⁺推定されるがん幹細胞

皮膚の悪性黒色腫は皮膚癌の最も一般的でない、まだ最も致命的なタイプです。増加率、死亡の^1,2に関連悪性皮膚腫瘍の75％は悪性腫瘍であり、急速な普及のハイグレード、今やメラノーマアカウントが原因。原発腫瘍の外科的切除、化学療法、放射線療法、免疫療法と組み合わせた化学療法と転移性黒色腫の免疫療法に加えメラノーマ治療^3,4の最先端の戦略があります。しかし、悪性黒色腫は化学療法への反応が不良^{（5-12％）、5,6、}およびのみvemurafenib ^7〜による治療などの新しい標的治療に有望からBRAF V600E遺伝子変異の利益を運ぶメラノーマ患者のものと50から70パーセントによって特徴付けられる全生存期間を改善し、メラノーマ腫瘍形成のメカニズムのより良い理解が必要である。

過去には、十分に確立された商業でそれらのメカニズムを研究するために、cially可能な細胞株を用いた。がんの発生と進行の分子事象を研究するための、より最近のアプローチは、腫瘍組織に直接由来初代培養活用 - 戦略ベアリングマニホールドの利点を：研究者は、患者と組織選択の完全なコントロールを持っています。サンプリングされた細胞は巧妙に選ば腫瘍組織から得られた、そのすべての異質性腫瘍に似ているとフォローアップの患者のデータと詳細な病理学は、文化の特性は元の腫瘍⁸のものと比較することを許容するために利用可能です。

これとは対照的に、がん研究における関連モデルシステムとして確立された細胞株の使用は論争議論されている。すでに1987年にオズボーンらは異なる研究室⁹からMCF-7ヒト乳癌細胞株の間に有意な生物学的な違いについて説明しました。継代中のRNA発現のこの大規模なゲノム不安定性とバリエーションが共同であったHiorns らによるnfirmed。および細胞株は、それによってヒト癌¹⁰のモデルのような確立された文化の直接の関連性を弱める、文化の中で進化しないという証拠のための支援データを提供した。

大部分は長年にわたって無視されてきたもう一つの重要な考慮事項は、最初の細胞株の多数がHeLaによって汚染されたことを実証することによって、20年以上前に強調表示されていた無関係の 'false'細胞と培養液の汚染や増殖のリスクである細胞^8,11。 'false'の細胞株からのデータの誤った解釈は、最近になって再び文学で明るみになってきた。 DNAプロファイリングと分子細胞遺伝学の組み合わせを使用して、マクラウドらは 252の新しい腫瘍由来のヒト細胞株の、微生物や培養細胞（DSMZ）のドイツCollectionに寄託ほぼ18％が種内であることが判明したまたはクロス種差ことを明らかにした·汚染物質^12,13。

これらの問題を回避するためと、上記の利点を活用するために、我々は新たに摘出転移からの低通路メラノーマ細胞株を樹立することを決めた。

強固な細胞分離·解析技術は、同時に特徴的な表面のタンパク質の細胞死と破壊を制限しながら、単一セルの準備が生成する必要があります。単細胞懸濁液中に組織の解離のための自動化されたベンチトップ測定器は、ミルテニー製gentleMACSの解離です。抗原エピトープを維持し、セル損失を低減しつつ、gentleMACS Cチューブ、最適化された解離ソリューションと組み合わせて使用​​すると、クローズドシステム内の腫瘍組織の効果的かつ穏やかな解離が達成される。楽器は、特定のアプリケーションや保証で即時メラノーマ組織¹⁴から単細胞懸濁液の標準製剤の様々な最適化され、あらかじめ設定されたプログラムを提供しています。

メラノーマでCSCの亜集団を表現するために提案された重要なマーカーの一つは、CD133の^16から20です。 CD133（またプロミニン1とも呼ばれます）、pentaspan膜貫通糖タンパク質のメンバーは、造血幹細胞、内皮前駆細胞、ニューロンおよびグリア幹細胞^21から23で表されます。 CD133の発現と相関している非対称細胞分裂^24、CD133のグリコシル化エピトープが細胞分化²⁵時にダウンレギュレートすることが示された。最近では、CD133 ⁺メラノーマ細胞は自己複製および腫瘍イニシエーション容量^19,20を有すること^が示された。

細胞^- CD133の機能⁺推定メラノーマCSCを勉強するために、我々は、CD133 ⁺およびCD133の高濃縮および生存個体を得るためにミルテニーバイオテクから磁気活性化細胞選別（MACS）システムを変更し、最適化しました。

Matheu らによって示されているように磁気ビーズベースの細胞分離はどちら負の選択が可能になります^26、または正の選択我々がここで示しているよう。正の選択中に特定の標的細胞型、 例えば CD133発現する細胞は、磁気に対して非常に特異的な抗体に結合しているMicroBeadsは、50 nmの超常磁性粒子で標識されている特定の細胞表面抗原。非標識細胞が通って流れるのに対し分離中、磁気標識した細胞は、セパレータの磁場中でカラム内に保持されています。洗浄工程の後、カラムセパレータの磁場から削除され、標的細胞をカラムから溶出される。 LSまたはMSカラムは、高純度の標識および非標識細胞の分画における正の選択の結果の間に使用。一方、負の選択に使用されるLDの列、、標識された画分の純度が若干低い結果。その行列のパッキング密度が高いのために、これらの列の流量は、カラムの中に閉じ込められる非標識細胞のリスクが高い低いに起因している。 LDの列は、望ましくない細胞亜集団の厳しいプリーションするためにのみ使用する必要があります。ポジティブ選択incubatio以下MicroBeadsで直接（MicroBeadsに結合した抗体）または間接磁気標識（インキュベーションによって行うことができるn個の一次抗体を使用）。特定のMACS MicroBeadsは前立腺または黒色腫²⁷のような原発腫瘍細胞の多くの種類の細胞の正の選択のために用意されています。

初代培養細胞、線維芽細胞の枯渇とCD133の磁気細胞選別の腫瘍組織、特性評価からの主なシングル細胞の調製を含む実験の全体的なスキームは^、+およびCD133 ^-メラノーマ細胞を図1に示します。

1。サンプル取得

1. 次のステップを検討する前に、倫理的な承認のために確認してください。
2. 手術やチームに上に1％ペニシリン - ストレプトマイシン最終濃度と手を補充滅菌PBSで50mlチューブを準備します。
3. 4℃で手術から細胞培養ラボに腫瘍組織の迅速な輸送を整理

2。腫瘍組織から原発性黒色腫シングルセルを調製し

1. 無菌条件下でのすべての手順を実行します。
2. 腫瘍を切除する前に、1つは解離ミックスを準備する必要があります。 2〜4グラム組織当たり10ミリリットル解離ミックスが必要となります。ミックスはimmediaを使用することができますtelyまたは後で使用するために-20℃で10 mlのアリコートに格納されている。
   1. 150mM塩化ナトリウムを含む溶液を調製します。溶液が透明になるまでボルテックスを用いて混ぜる。 0.22μmのフィルターを使用して、必要な滅菌ろ過液塩化ナトリウム溶液ます。
   2. DNase Iを秤量し、150mMの塩化ナトリウムで10 mg / mlのDNase Iを含む溶液を調製します。溶液が透明になるまで転倒混和する。
   3. PBS中で100mg/mlコラゲナーゼIVを含む溶液を調製します。溶液が透明になるまで転倒混和する。コラゲナーゼ溶液のアリコートは、数ヶ月のために-20℃で保存することができます。
   4. クアンタム263媒体で1 mg / mLのコラゲナーゼIVおよび0.1 mg / mlのDNase Iを、1％ペニシリン - ストレプトマイシンの最終濃度で解離ミックスを調製する。渦を使って混ぜる。オプション：1.5μg/ mlのアムホテリシンBの最終濃度に解離ミックスにスキンアドオンアムホテリシンB溶液由来メラノーマ組織を使用する場合
3. プリ暖かいREQ37〜解離ミックス、PBSおよび量子263媒体のuired金額℃、
4. 滅菌シャーレに腫瘍組織を置きます。組織から過度の液を除き、500μlの解離·ミックスを追加します。新鮮な、滅菌外科用メスを使用して2〜4mmの小さな部分に腫瘍をミンチ。
5. 転送2〜4グラムは5ml解離ミックスを含むgentleMACS Cチューブに腫瘍組織のみじん切り。追加の4.5ミリリットル解離ミックスとペトリ皿をすすぎ、gentleMACS Cチューブに残った組織片を追加します。
6. gentleMACS C管を閉じ、gentleMACSの解離のスリーブの上に逆さまに貼り付けてください。 gentleMACSプログラム "h_tumor_01"を実行します。
7. 解離からgentleMACS Cのチューブを外し、37℃で30分間、サンプルをインキュベート℃で落ち着いた組織片を再懸濁するために、5分毎に最高走行速度（12回転）にするか、手動でチューブを回してMACSmixチューブローテーターを用いた連続回転下。
8. トンのスリーブの上に逆さまにgentleMACS C管を取り付け彼gentleMACS解離とgentleMACSプログラム "h_tumor_02"を実行してください。
9. 解離からgentleMACS Cのチューブを外し、37℃で30分間、サンプルをインキュベート℃で落ち着いた組織片を再懸濁するために、5分毎に最高走行速度（12回転）にするか、手動でチューブを回してMACSmixチューブローテーターを用いた連続回転下。
10. gentleMACSの解離のスリーブの上に逆さまにgentleMACS C管を取り付け、gentleMACSプログラム "h_tumor_03"を実行してください。
11. 解離、再懸濁したサンプルからgentleMACS Cのチューブを外し、50 mlチューブに置か70μmのセルストレーナーに細胞懸濁液を適用します。フィルターの目詰まりが発生した場合、完全な懸濁液が駆け抜けまで、滅菌フィルター先端で細胞懸濁液をかき混ぜる。
12. 5ミリリットルクアンタム263培地で細胞ストレーナーを洗浄します。
13. オプション：あなたはまだ量子263媒体と種子、それらを適切な細胞培養DISでのフィルタ、再懸断片に残って組織片を持っている場合hである。 37℃および5％CO ₂のフラグメントをインキュベートする。
14. セルストレーナーを破棄し、消化細胞懸濁液を50 mlチューブを閉じます。 300 xgで5分間、細胞懸濁液を遠心し、上清を捨てる。
15. オプション：細胞ペレットによる赤血球の大量に赤く表示された場合は、蒸留水で10倍ソリューション1:10に希釈して500μlのPBSに再懸濁し、細胞ペレットを1X赤血球溶解液を調製し、5 mlの1X赤血球溶解を追加ソリューション。 10分間室温でボルテックス5秒間インキュベートする。 300 xgで5分間遠心し、上清を捨てる。
16. クアンタム263およびシード適切な細胞培養フラスコ内の細胞と腫瘍細胞を再懸濁します。彼らは80％のコンフルエンスに到達し37℃、5％CO ₂で、日常的に継代細胞での培養腫瘍細胞。

3。初代培養細胞および線維芽細胞枯渇のキャラクタリゼーション

1. 表現型がmicroscoを使用して初代細胞培養を分析PE。
2. 初代細胞培養の少量（0.5×10 ⁶細胞）を採取し、腫瘍-、メラノーマ、幹細胞と間質細胞マーカー遺伝子のプライマーを用いてRT-PCRを行った。分析するための最も重要な遺伝子は、CD90（線維芽細胞マーカー）、TYR（メラノーマ/メラニン細胞マーカー）、CD133（癌幹細胞マーカー）、CD83（成熟樹状細胞のマーカー）およびハウスキーピング遺伝子（ 例えば HPRTまたはGAPDH）です。
3. RT-PCRの間の微視的分析およびCD90高発現は、線維芽細胞を使用して、プライマリメラノーマ文化の高い汚染が明らかになった場合は、ミルテニーからAnti-線維芽細胞のマイクロビーズとD列を使用した線維芽細胞を枯渇させる必要があります。

4。磁気細胞はCD133 ⁺およびCD133のソート^- LS列を使用したメラノーマ細胞を

1. PBS中2mMのEDTA、5％FCSを含むMACSバッファーを準備します。 0.22μmのSteritop-GPフィルターユニットを使用して反転し、無菌ろ過バッファによるミックス。 4から8℃〜チル·バッファ使用前とドガ。
2. プリ暖かいAccutase、37〜PBSと量子263媒体℃、
3. PBSで80％コンフルエントの細胞を洗浄します。 Accutaseの適切な量を追加し、細胞が培養面からデタッチするまでインキュベートする。クアンタム263培地を用いて50 mlチューブに細胞を回収する。
4. 細胞数を決定し、5分間細胞を必要な数（2×10 ⁹細胞の最大数はLSカラムごとにロードすることができます。セルラインの特定の最適な数値が決定されるべきであるとかなり低くなる可能性がありますMiltenyi社のプロトコルによる。）遠心300 xgで4〜8℃上清を完全に吸引します。
5. 350μlのMACSバッファーを用いて1×10 ^8個の細胞の最大値（より高い細胞数に応じて、以下のすべてのMACSバッファーをスケールアップ、FcRブロッキング試薬CD133/1-BiotinとAnti-Biotin MicroBeadsは、ボリューム用）に再懸濁します。
6. 100μlのFcRブロッキング試薬を追加します。
7. 50μlのCD133/1-Biotinを追加します。 4月8日に渦とインキュベートを使ってよく混ぜ°C Fまたは10分。
8. 300 xgで4〜8℃で5分間、10ミリリットルのMACSバッファーおよび遠心分離機を追加することにより、細胞を洗浄上清を完全に吸引します。
9. 洗浄工程（4.8）を繰り返し
10. 400μlのMACSバッファーを用いて再懸濁した細胞ペレット。
11. 100μlのAnti-Biotin MicroBeadsはを追加します。 15分のための4-8℃で渦とインキュベートを使用してよく混ぜる。
12. 一方、磁気分離におけるMACSセパレータを準備します。 MACSセパレーターマルチスタンドにQuadroMACSを取り付けます。 QuadroMACSの磁場中でのフロントへの列の翼を持つLS必須列の番号を挿入します。各カラムの下に各LSカラムおよび適切なコレクションチューブ（15 mlまたは50 ml）にプレセパレーションフィルター（30μmのナイロンメッシュ付き）を配置します。 3ミリリットルのMACSバッファーでリンスすることにより、フィルタとカラムを準備します。フロースルーを捨てる。
13. 300 xgで4〜8℃で5分間、10ミリリットルのMACSバッファーおよび遠心分離機を追加することにより、細胞を洗浄上清を完全に吸引します。
14. 500μlの細胞を再懸濁MACSはバッファとプレセパレーションフィルターを持つLSカラムに細胞懸濁液を適用します。
15. 列ごとに3ミリリットルのMACSバッファーで3回洗浄する。カラムリザーバが空であるときにのみ、新しいバッファを追加します。
16. 細胞分画^-収集された合計の流出物は、非標識CD133が含まれています。
17. プレセパレーションフィルターを捨てて、セパレーターから列を削除し、適切な収集チューブの上に置きます。
18. 5ミリリットルMACSバッファーを適用します。すぐにしっかりと列にプランジャーを押すことにより、標識されたCD133 ⁺細胞を洗い流す。
19. 陰性分画の純度を高めるために、QuadroMACSに挿入された新しい平衡化したLSカラムに細胞懸濁液を適用します。分数^-排水はCD133が含まれています。
20. 列を破棄します。

腫瘍組織からの単一細胞の調製

図2（B）は、機械的解離は2-4 mmの小片にする前に、（A）と後の後期メラノーマ患者の切除リンパ節転移を例示している。 70μmのナイロンメッシュを通して組織とろ過の酵素的解離の後、細胞をペレットにし、上清を捨てる。このステップでは、我々は、 図2Cの細胞ペレットの赤みを帯びた色で示されるように赤血球と高い汚染を観測しました。その後、我々は、ライトブラウン色（ 図2D）の細胞ペレットをもたらした赤血球を、枯渇。これらの細胞は、℃、5％CO 2、37℃クアンタム263培地で再懸濁し、培養した。

初代培養細胞のキャラクタリゼーション

細胞が腫瘍からではなく、周囲間質に由来するかどうかを検証するために、我々は、RT-PCRを行ったmelanocyte/melanoma-の、線維芽細胞、樹状突起と、幹細胞マーカー遺伝子。アダルトメラノサイトは 、Tyrおよび幹細胞マーカーCD133の陽性コントロールとして、胚性癌細胞株のNCCITのための正常なコントロール細胞を務めていました。 図3に示されているPCRの結果は、いくつかの主要な細胞がメラノサイトの起源確かにある（TYR用正）及び成熟樹状細胞（CD83）のマーカーが陰性であることを明らかにした。また、メラノーマ細胞株は急行CD133、非対称細胞分裂と既知の癌幹細胞マーカーのための重要な遺伝子を発見された。HPRTがローディングコントロールとして使用した。

CD90高発現（ 図3左、上のパネル）によって示されるように、当初、初代培養細胞はまた、線維芽細胞で高い汚染が含まれていました。

線維芽細胞の枯渇後、この細胞培養のみTYR +メラノーマ細胞が含まれていたsともう芽細胞（CD90 - ）（ 図3左、下のパネル）。 図4に示すように、線維芽細胞の不在は、明視野顕微鏡で確認することができた。

CD133 +およびCD133の磁気細胞選別-メラノーマ細胞

-細胞RT-PCR法によって示されるように、CD133発現を示す原発性黒色腫細胞は、CD133 +およびCD133に並べ替えることができます。間接CD133マイクロビーズキット、高純度（> 99.75パーセント）から変更されたプロトコルや、CD133 +およびCD133-フラクションと同様、ソート後の両方の画分の高い生存率、収率が達成される。 図5AおよびBに示すように、ソートの有効性と純度は常に免疫蛍光染色またはウェスタンブロット分析によって検証する必要があります。

図1。実験の全体的なスキームはプライマリメラノーマ細胞培養及びCD133 +推定癌幹細胞の単離はDNase IおよびコラゲナーゼIVおよびgentleMACSのDissociatorと解離ミックスを用いて腫瘍細胞の機械的および酵素的解離続く腫瘍の切除が含まれています。腫瘍細胞は非常に赤血球で汚染されている場合には、赤血球枯渇ステップが推奨されます。初代培養細胞は、その後、彼らはメラノーマ細胞であるかどうか確認するために顕微鏡およびRT-PCR解析によって特徴づけされなければならない。 CD90の発現によって示される線維芽細胞で高い汚染がMiltenyi社の抗線維芽細胞のマイクロビーズを用いた線維芽細胞の枯渇によって除去することができる。最後に、CD133 +およびCD133-メラノーマ細胞はミルテニーから人間の間接CD133マイクロビーズキットを用いて分画することができる。ソート後、純度が確認され、CD133 +D CD133-メラノーマ画分を並べて分析することができます。

図2。腫瘍組織からの単一細胞の調製。 ：単一細胞に解離する前に切除した悪性黒色腫の転移のサンプルB：2つの滅菌外科用メスを使用して2〜4ミリメートル片に腫瘍組織の機械的解離後のメラノーマ転移C：。非常に赤血球Dで汚染された単一細胞のペレット：赤血球枯渇続く単一細胞のペレット。

図3。初代培養細胞の発現解析。メラニン産生に関与する遺伝子のRT-PCR分析（TYR）、線維芽細胞マーカー（CD90）、樹状細胞マーカー（ CD83）と非対称細胞分裂（CD133）のための重要な遺伝子は当初、初代培養細胞は、CD133 +メラノーマ細胞（TYR +）と無樹状細胞（CD83-）を含有していたが、非常に繊維芽細胞（CD90 +）（左上段）で汚染されたことを示した。以下の線維芽細胞の枯渇この細胞培養のみTYR +およびCD90-メラノーマ細胞（左、下のパネル）が含まれていました。 HPRTはローディングコントロールとして使用した。 NCCITと大人のメラノサイトは、それぞれ、CD133とTYRのポジティブコントロールとして役立った。

図4。線維芽細胞の枯渇前後の初代培養細胞の顕微鏡写真。 ：高度に汚染された線維芽細胞と初代培養細胞の明視野顕微鏡写真B：線維芽細胞が枯渇した後、同じプライマリメラノーマ細胞培養の明視野顕微鏡写真。

著者らは、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。