この記事では、初代培養細胞に新たに取得したメラノーマ組織の調製を記述する方法、および腫瘍細胞から赤血球および線維芽細胞の汚染物を除去する。最後に、我々はどのように説明したCD133 +推定メラノーマ幹細胞は、CD133から順にソートされ -磁気活性化細胞選別（MACS）を使用してバルク。
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この記事について
サマリー
要約
利用できるメラノーマ今日のための改良さ治療オプションにもかかわらず、高度な悪性黒色腫の患者は、まだ無増悪生存期間および全生存期間のため予後不良である。したがって、トランスレーショナルリサーチは、悪性黒色腫のための標的療法を改善するためのさらなる分子の証拠を提供する必要があります。過去には、黒色腫に関連する発癌メカニズムが広く確立された細胞株を用いて検討した。個々の遺伝的プロファイルに基づいて、よりパーソナライズされた治療法への道に、私たちは、患者由来の細胞株の代わりに、汎用的な細胞株を使用することを提案する。特に患者のフォローアップ一緒に高品質の臨床データと、これらの細胞は、より良いメラノーマの進行の背後にある分子メカニズムを理解する手段になるでしょう。
ここでは、解剖した新鮮な腫瘍組織からの原発性メラノーマ培養の設立を報告している。この手順は、単一細胞にミンチと組織の解離、再を含む赤血球と線維芽細胞と同様に細胞の悪性黒色腫由来の初代培養で信頼性の検証と汚染のmoval。
最近の報告では、腫瘍の大部分のようなメラノーマ、港もっぱら転移状態に向かって腫瘍の発生と進行を煽るように見える癌幹細胞（CSCが）、少量の亜集団が明らかになった。黒色腫におけるCSCの同定および単離するための重要なマーカーの一つはCD133です。バルク、栽培と機能的に分析することができます-原発性黒色腫の培養液から、CD133 + CSCを単離するために、我々は、CD133の高い選別純度および生存率で+ CSCおよびCD133を生じMiltenyi社からの磁気活性化細胞選別（MACS）の手順を変更し、最適化したその後。
概要
皮膚の悪性黒色腫は皮膚癌の最も一般的でない、まだ最も致命的なタイプです。増加率、死亡の1,2に関連悪性皮膚腫瘍の75％は悪性腫瘍であり、急速な普及のハイグレード、今やメラノーマアカウントが原因。原発腫瘍の外科的切除、化学療法、放射線療法、免疫療法と組み合わせた化学療法と転移性黒色腫の免疫療法に加えメラノーマ治療3,4の最先端の戦略があります。しかし、悪性黒色腫は化学療法への反応が不良（5-12％）、5,6、およびのみvemurafenib 7〜による治療などの新しい標的治療に有望からBRAF V600E遺伝子変異の利益を運ぶメラノーマ患者のものと50から70パーセントによって特徴付けられる全生存期間を改善し、メラノーマ腫瘍形成のメカニズムのより良い理解が必要である。
過去には、十分に確立された商業でそれらのメカニズムを研究するために、cially可能な細胞株を用いた。がんの発生と進行の分子事象を研究するための、より最近のアプローチは、腫瘍組織に直接由来初代培養活用 - 戦略ベアリングマニホールドの利点を：研究者は、患者と組織選択の完全なコントロールを持っています。サンプリングされた細胞は巧妙に選ば腫瘍組織から得られた、そのすべての異質性腫瘍に似ているとフォローアップの患者のデータと詳細な病理学は、文化の特性は元の腫瘍8のものと比較することを許容するために利用可能です。....
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プロトコル
初代培養細胞、線維芽細胞の枯渇とCD133の磁気細胞選別の腫瘍組織、特性評価からの主なシングル細胞の調製を含む実験の全体的なスキームは、+およびCD133 -メラノーマ細胞を図1に示します。
1。サンプル取得
- 次のステップを検討する前に、倫理的な承認のために確認してください。
- 手術やチームに上に1％ペニシリン - ストレプトマイシン最終濃度と手を補充滅菌PBSで50mlチューブを準備します。
- 4℃で手術から細胞培養ラボに腫瘍組織の迅速な輸送を整理
2。腫瘍組織から原発性黒色腫シングルセルを調製し
- 無菌条件下でのすべての手順を実行します。
- 腫瘍を切除する前に、1つは解離ミックスを準備する必要があります。 2〜4グラム組織当たり10ミリリットル解離ミックスが必要となります。ミックスはimmediaを使用することができますtelyまたは後で使用するために-20℃で10 mlのアリコートに格納されている。
- 150mM塩化ナトリウムを含む溶液を調製します。溶液が透明になるまでボルテックスを用いて混ぜる。 0.22μmのフィルターを使用して、必要な滅菌ろ過液塩化ナトリウム溶液ます。
- DNase Iを秤量し、150m....
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結果
腫瘍組織からの単一細胞の調製
図2（B）は、機械的解離は2-4 mmの小片にする前に、（A）と後の後期メラノーマ患者の切除リンパ節転移を例示している。 70μmのナイロンメッシュを通して組織とろ過の酵素的解離の後、細胞をペレットにし、上清を捨てる。このステップでは、我々は、 図2Cの細胞ペレットの赤みを帯びた色で示されるように赤血球と高い汚染を観測しました。その後、我々は、ライトブラウン色（ 図2D）の細胞ペレットをもたらした赤血球を、枯渇。これらの細胞は、℃、5％CO 2、37℃クアンタム263培地で再懸濁し、培養した。
初代培養細胞のキャラクタリゼーション
細胞が腫瘍からではなく、周囲間質に由来するかどうかを検証するために、我々は、RT-PCRを行ったmelanocyte/melanoma-の、線維芽細胞、樹状突起と、幹細胞マーカー遺伝子。アダルトメラノサイト.......
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ディスカッション
腫瘍細胞ペレットから赤血球汚染を除去するために、我々は非常にミルテニーから赤血球細胞溶解液の使用をお勧めします。伝統的なフィコール密度勾配遠心分離の上赤血球を溶解することの利点は、それがより速く、より簡単であることです。さらに、フィコールまたは赤血球細胞と腫瘍細胞の喪失と汚染が回避されます。長すぎる待っているとき、彼らは通常、腫瘍細胞がはびこるので、あなたが初代細胞培養における線維芽細胞の成長を観察するとき、彼らはすぐに削除されるべきである。
ミルテニーのMACS技術を用いて細胞をソートするときに我々は、酵素的に細胞を収穫お勧めします。セルスクレーパーを使用すると、細胞とその表面エピトープに穏やかかもしれませんが、MACSカラムに非特異的に結合し、カラムを詰まらせる細胞断片をも生み出すだろう。従来のトリプシン/ EDTA処理上Accutaseの利点が減少し細胞ストレス、LEAを含める改善された生存率および細胞培養物に外来性物質を導入するリスクを最小化する鼎。 Accutaseの準備は、任意の哺乳動物又は組換え細菌タンパク質28が含まれてい.......
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開示事項
著者らは、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。
謝辞
作者はこの仕事をサポートし、批判的に原稿を読み取るための教授M. Dietelとディルク·シューマッハに感謝します。
これらの結果につながる研究は助成合意nは下革新的医薬品イニシアティブの共同事業からの支持を受けています°の115234は、リソースは、欧州連合（EU）の第7次フレームワークプログラム（FP7/2007-2013）とEFPIA会社の中から拠出金で構成されています現物出資。この作品はまた、ベルリンKrebsgesellschaft（BKG）によってサポートされていました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 試薬 | |||
| Accutase | PAAラボラトリーズ社 | L11-007 | |
| 脱イオン水でアムホテリシンB液250μg/ mLの | シグマアルドリッチ社 | A2942-50ミリリットル | |
| 抗線維芽細胞のマイクロビーズ | ミルテニーバイオテク社 | 130-050-601 | |
| CD133 / 1（W6B3C1） | ミルテニーバイオテク社 | 130-092-395 | |
| コラゲナーゼIV | シグマアルドリッチ社 | C5138 | |
| DNase Iを | Applichem社 | A3778.0050 | |
| は、Ca、Mgを含まないD-PBS | PAAラボラトリーズ社 | H15-002 | |
| エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム塩二水和物エチレンジアミン四酢酸（EDTA） | シグマアルドリッチ社 | E-7889 | |
| FBSスペリオル | Biochrom | S0615 | |
| 間接CD133マイクロビーズキット人間 | ミルテニーバイオテク社 | 130-091-895 | 含まれています：CD133 / 1（AC133）-ビオチン、Anti-Biotin MicroBeadsはとFcRブロッキング試薬 |
| ペニシリン - ストレプトマイシン、液体（100倍） | インビトロジェン社 | 15140-122 | |
| 量子263 | PAAラボラトリーズ社 | U15-815 | |
| 赤血球溶解液（10倍） | ミルテニーバイオテク社 | 130-094-183 | |
| 機器 | |||
| セルストレーナー（70μm）の | BD Biosciences社 | 352350 | |
| gentleMACS Cチューブ | ミルテニーバイオテク社 | 130-093-237 | |
| gentleMACS解離 | ミルテニーバイオテク社 | 130-093-235 | |
| MACSセパレーターマルチスタンド | ミルテニーバイオテク社 | 130-042-303 | |
| MACS Seperation柱25のLSカラム | ミルテニーバイオテク社 | 130-042-401 | |
| MACSmixチューブローテーター | ミルテニーバイオテク社 | 130-090-753 | |
| Natriumchloride | メルク | 567440-1KG | |
| プレセパレーションフィルター | ミルテニーバイオテク社 | 130-041-407 | |
| QuadroMACSセパレータ | ミルテニーバイオテク社 | 130-090-976 | |
| Rotilabo·シリンジフィルター（0.22μmで、PES） | カール·ロート社＆Co KG | P668.1 | |
| Steritop-GPフィルターユニット500ミリリットル | ミルテニーバイオテク社 | SCGPS05RE |
参考文献
- Garibyan, L., Fisher, D. E. How sunlight causes melanoma. Curr. Oncol. Rep. 12, 319-326 (2010).
- Radovic-Kovacevic, V., et al. Survival analysis in patients with cutaneous malignant melanoma. Srp. Arh. Celok. Lek. 125, 132-137 (1997).
- Lens, M. B., Eisen, T. G.
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