、正確な短い、洗練された安価な方法は、定量RT-PCRを使用して、複数の組織や種のテロメアの長さを評価することが記載されている。また、テロメアの長さのために相補的なバックボーン試験としてテロメラーゼ活性を評価するための簡単なアッセイについて説明する。
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この記事について
サマリー
要約
テロメアは、先端にDNA配列を繰り返している長さおよび人間が15,000塩基対の長さに達することができるで多様である染色体終了する。テロメアは、それぞれの細胞分裂における染色体の消耗のbioprotectiveメカニズムとして機能します。一定の長さでは、テロメアは、染色体の不安定性や細胞死につながる可能性があり、プロセスの複製を可能にするには余りにも短くなる。摩滅および伸び：テロメアの長さは、2つの対向する機構によって調節される。それぞれの細胞が分裂するように消耗が発生します。対照的に、伸びは染色体の末端に繰り返し配列を付加する酵素テロメラーゼによって部分的に変調される。この方法では、テロメラーゼは、おそらくエージングメカニズムを逆転し、細胞生存率を活性化させることができる。これらは、電池寿命を維持する上で不可欠な要素であり、細胞の老化を評価するために使用される。本稿で我々は、複数の組織ではテロメアの長さを評価するため、正確な短い、洗練された安価な方法を説明するsと種。この方法は、2つの主要な要素、テロメア配列のタンデムリピート及び試験した試料の差コピー数を検出する定量RT-PCRの感度を利用しています。また、テロメアの長さのために相補的なバックボーン試験としてテロメラーゼ活性を評価するための簡単なアッセイについて説明する。
概要
テロメアは染色体の末端にあり、DNA量体（TTAGGG）のシーケンスを繰り返している。各セルの複製では、これらの染色体の端部が短くなる。彼らはあまりにも短くなった場合、染色体テロメア末端融合、異常再結合、および劣化を受けることができる。したがって、十分なテロメア長の維持は、染色体の安定性および細胞保護38において主要な役割を果たしている。 DNA複製が染色体1-2の非常に最後まで続けることができないため、テロメアの長さのメンテナンスは、染色体の末端の近くで見つけた遺伝子のためにも重要です。これにより、テロメアの短縮の防止は、細胞の安定性を改善することができる。
多くの研究では、テロメアの長さは、このような3-4癌、糖尿病5、および心血管疾患6,7のように、生物の寿命や病気の状態と相関していることを報告している。さらに、短縮テロメアは過度のストレスやと関連しているおそらく時期尚早細胞老化と死9を促進することにより不健康なライフスタイル8、。一方、いくつかの研究は、疾患39、40、41に関連テロメアの長さと寿命と年齢との間に有意差がないことを見出した。
テロメアの短縮からの保護の細胞の生来のメカニズムの一つは、独自の酵素テロメラーゼ逆転写酵素（TERT....
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プロトコル
1。テロメアの長さプロトコル19
- DNA単離法
ほとんどのDNAの単離方法を用いることができる。私たちの研究室は、血液ソースのキアゲンDNeasyキット（＃69506）を好む。例えば口腔または他のソースとして、DNAの供給源に応じて、異なる分離法を用いることができる。
- プライマー：
必要になるまで全てのプライマーは、PCRグレード水に100pmoles/μlのストック濃度に希釈し、-20℃で保存されています。プライマーのワーキング株式は新鮮な作られており、20℃で保存する短期間（数ヶ月）のためのCの標準的なプライマーは、キャラハンらで説明したように、SCG、テロメアとβ-グロビンのために使用された20は、 。
プライマー配列：
Telo 1：5'-CGGTTTGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTT-TGGGTTTGGGTT-3 '
Telo 2：5'-GGCTTGCCTTACCCTTACCCTTACCCTTACCCTT-ACCCT-3 '
SCG 1：5'-GCTTCTG....
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結果
テロメアの長さ定量RT-PCRアッセイの例を図1に示されている。左上のパネルで、赤と緑でラベルサンプルは、96ウェルプレート上でテストされた被写体の位置を表しています。右上のパネルでは、増幅曲線が示されています。各被験者は、三重で行われる2つのアッセイ（テロメアとシングルコピー遺伝子）によってテストされています。選択された個体の2つのアッセイで製造異なるDNAコピー数のために、蛍光が検出されるまでのサイクル数は、指数関数曲線がアッセイの間で異なる達する。高いコピー数のチューブ（ すなわちテロメアアッセイ）、蛍光検出の量は、27サイクル後に、その指数曲線に達する。行の2番目のセットはゲノムで唯一つのコピーを持っているシングルコピー遺伝子（SCG）を表し、したがって、はるかに少ない部数テロメアサンプルよりを持っており、唯一の31サイクル後に、その指数曲線に達する。茶色の線は標準を表す既知の試料濃度の連続希釈に基づいているカーブ。右下のパネルは、標準曲線点（直線が最適な連続希釈を示す）の対数濃度を表す。この直線は、テストチューブ（左下のパネル）の濃度を計算するために使用されている。最初に定量.......
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ディスカッション
テロメアの長さはストレスや老化細胞を研究するためのユニークな細胞のマーカーを提供し、老化のメカニズムについての洞察を提供しています。高齢化におけるその役割が最初に示唆されていたので、研究の多くは、年齢にテロメアの長さ、長寿、加齢に伴う疾患、癌、ストレスに関連行われている。何十年もの間、テロメアの長さ測定のゴールドスタンダードは、サザンハイブリダイゼーションを使用して、端末制限断片分析だった。しかし、最近になってCawthonにより、手頃な価格の迅速、かつ実行しやすい方法が進化してきました。定量リアルタイムPCRを使用して、Cawthonは大きなサンプルサイズについての研究が可能となり、テロメアの長さを測定するための有用な代替手段を提供する。
定量RT-PCRを用いて、多くの研究は、テロメアの長さ、特に結果、加齢に伴う種々の疾患の関係を調べるために行われている。より具体的には、この方法は、研究者が大きな疫学学生の実行を許可されているテロメアの長さや種々の疾患の間の相関関係を実証するか拒否集団で死ぬ。少数の、虚血性心疾患7、アルツハイマー病22、
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開示事項
利害の衝突は宣言されていない。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 定量的テロメラーゼ検出 | Allied Biotech | MT3012 | |
| Qiagen DNeasy Kit | Qiagen | 69506 | |
| LightCycler 480 SYBR Green I Master, LightCycler 480 Instrument Roche Diagnostics 4707516を使用したSYBR Green IベースのリアルタイムPCR用のすぐに使えるホットスタート反応ミックス |
参考文献
- Blackburn, E. H. Structure and Function of Telomeres. Nature. 350 (6319), 569-573 (1991).
- Gilson, E., Ségal-Bendirdjian, E. The Telomere Story or the Triumph of an Open-Minded. Research. Biochimie. 92 (4), 321-326 (2010).
- Wu, X., Amos, C. I., Zhu, Y., Zhao, H., Grossman, B. H., Shay, J. W.,....
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再版と許可
