方法論記事

使用して樹状細胞の移行の監視 19 F / 1 H磁気共鳴イメージング

DOI：

10.3791/50251

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2013年3月20日

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1Experimental and Clinical Research Center, A joint cooperation between the Charité Medical Faculty and the Max Delbrück Center for Molecular Medicine, 2Berlin Ultrahigh Field Facility (B.U.F.F.), Max Delbrück Center for Molecular Medicine

この記事について

サマリー

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MRIを用いて細胞の追跡は、過去数年間に顕著な注目を集めている。このプロトコルは、フッ素と樹状細胞のラベルを記述する（ 19 F）に富む粒子、これらの細胞のin vivoでの応用、で排出リンパ節への移動の程度を監視する 19 F / 1 H MRIと 19 F MRS。

要約

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このような磁気共鳴などの非侵襲的イメージングモダリティの継続進歩はイメージング（MRI）は、大幅に生活生物の生理的または病理学的プロセスを研究するために我々の能力を改善している。 MRIはまた、in vivoで移植された細胞を捕捉するための貴重なツールであることが証明されて。 MR緩和時間に影響を与える造影剤のMRIなさ使用する初期細胞標識戦略（T1、T2、T2 *）と標識された細胞が存在するシグナルの増強（T1）又は枯渇（T2 *）につながる。このような超酸化鉄剤（USPIO）は細胞遊走およびいくつかを研究するために用いられてきたとしてT2 *増強剤は、臨床応用のためにFDAによって承認されている。 T2 *剤の欠点は、血液凝固、マイクロ出血や気泡等の他のアーティファクトから標識された細胞によって作成された信号消光を区別することが困難である。本稿では、 生体内でトラッキング細胞についての新興技術を記述するフッ素（19 F）が豊富な粒子で細胞をラベルに基づいています。これらの粒子は、パーフルオロカーボン（PFC）の化合物を乳化することにより調製し、その後MRI 19 Fによって画像化することができる標識細胞に使用される。 生体内では、（i）は、その後19 F MR分光法による細胞シグナルを定量化するために、背景のない画像と完全セルselectivityand（ii）の可能性をもたらし、生体内での炭素に結合した19 F、非存在下で細胞を追跡するためのPFC類の重要な利点。

概要

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生体内での細胞の追跡は生物医学のいくつかの分野において重要な側面である。このために、選択的に、ある期間にわたって細胞をローカライズすることができ非侵襲イメージング技術は非常に貴重である。 3次元磁気共鳴イメージング（MRI）の開発に先立ち、免疫細胞遊走の追跡は、顕微鏡の分析又は組織生検に限られていた。 MRIの助けを借りて追跡細胞は、 生体内の免疫細胞の挙動を研究するための免疫学者だけでなく、臨床および幹細胞の研究者だけでなく、過去数年間で莫大な注目を集めている。 90年代半ばの間に、酸化鉄の最初の研究では、MRIで追跡セルに対して開発のカスケードを開始した1ナノ。酸化鉄粒子は、標識された細胞のMR緩和時間（T2 *）短縮し、従って、MR画像の信号枯渇を招く。酸化鉄粒子は、ラベルマクロファージ2、オリゴデンドロサイトウェブに採用されているrogenitors 3および他の多くの細胞型。これらの粒子の一部は、臨床的にメラノーマ患者4のセルラワクチンを標識するためにFDAによって承認されている。 インビボで発信または酸化鉄粒子による細胞のex vivoでの標識は、T2 *信号の短縮に依存しており、後者はまた、マイクロ出血、鉄沈着物や気泡等のインビボ感受性に関連したT2 *効果によってもたらされることができるそれは、他のバックグラウンドT2 *信号絶滅

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プロトコル

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全ての動物の手順は、実行前に地元機関動物福祉委員会によって承認されなければならない。 MR測定中麻酔生理学的モニタリングの適切なレベル（体温、呼吸数）は必須の要件である。

1。マウス骨髄由来樹状細胞の生成

  1. 以前に12を説明したように、このプロトコルは1992年13にまで遡り、もともとラルフM. Steinman氏（1943年から2011年）、樹状細胞14の発見者のグループによって記述されていた 。C57BL / 6マウスから骨髄細胞を抽出します
  2. 簡単に説明すると、マウスを犠牲にした後すぐに脛骨と腓骨を抽出します。層流フード（微生物汚染を防止するため）の下で働く、洗浄媒体（5％FBS、RPMI中1％ペニシリン/ストレプトマイシンおよび1％HEPES）12の小さなペトリ皿に骨髄を洗い流す。
  3. ストラセルを介して細胞懸濁液を転送する慣性力（100μmのメッシュサイズ、ナイロン）滅菌50 mlの遠心チューブに骨と残りの組織を除去するため。いくつかの洗浄工程および溶解ステップ12の後、トリパンブルーと血球計数器を用いて生細胞を数える。
  4. マウス顆粒球の75 ngの溶液-1を含む培養培地40万細胞ml -1

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結果

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皮内適用 ​​後十八に二〇から一時間、19 F標識樹状細胞（DC）は、排水膝窩リンパ節に移行します。排出politealリンパ節へのリンパ管を介してDCの移動は、19 F DC画像（ 図2A）と1 H解剖画像を重ねることによって理解することができる。我々は以前に、in vivoでのこれらの細胞の遊走、ならびに吸収効率11を含むDC免疫生物学上の19 F-粒径の影響を報告している。リンパ節へのDCの移動の程度を定量化するために、我々は、流入領域リンパ節を取り出し、19 F MRSを（ 図2B）を行う。我々は推測することができ、同じPFCE粒子（検量線、 図2C）で標識されたDC異なる数から得られた19 F信号と各リンパ節から得られた19 F信号を比較する排出リンパ節に到達19 F-ラベルされたDCの数。 図2A.......

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ディスカッション

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リンパ節へのDCの移動に追従する19 F / 1 H MRIを用いるこの方法は、 生体内で免疫細胞の移動パターンを検討する機会を与える。樹状細胞は急速に緊密に特定の基材17に付着することなく3次元構造を通して操縦することができる免疫細胞の移行の優れた例である。記載された技術の低い空間分解能（μmの範囲は）多光子顕微鏡で達成することができる高分解能（nmの範囲）と同等ではありませんが、この技術では、 生体内で以上の細胞移動の性質を研究することも可能です長期間。さらに、顕微鏡は生体内イメージング大きな領域のため、それが現在は適さない、限られた深さの浸透とビューの限られたフィールドがあります。

技術の非侵襲性のために、共通に可能である調査の後、マウスを犠牲にすることなく数日間デンサ免疫細胞の遊走を。手法の別の利点は、それによって生体内での細胞の正確な位置決めを可能にする、解剖学的1 Hスキャンと遊走細胞を捕獲19 F画像をオーバーレイする可能性.......

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開示事項

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著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。

謝辞

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本研究では、ベルリンの分子医学とシャリテ医学部センターをDelbrückの実験的および臨床研究センター、マックスの協力からSWにドイツ学術振興（DFG WA 2804）とSWに大学の助成金によって賄われていた。資金提供者は、研究デザイン、データ収集と分析、公表することを決定、または原稿の準備で何の役割を持っていた。我々は我々の研究室で彼のインターンシップ中に技術的なサポートのために氏ロバート·ウェストファルに感謝します。

....

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
試薬
>C57BL/6マウスCharles River, Berlin
RPMIGibco21875-091
FBS SuperiorBiochrom AGS 0615
HEPESGibco-Invitrogen15630-056
Penicillin-StreptomycinGibco15140-122
L-グルタミンGibco25030-024
Dulbecco's PBSSigma AldrichD8662
PFASanta Cruzsc-281692
Perfluoro-15-crown-5-ether ChemPur391-1996
Pluronic F-68 Sigma AldrichP5556
ペトリ皿 (35 x 10 mm)VWR, Germany391-1996
27 ½GシリンジVWR、ドイツ612-0151
ナイロンセルストレーナー(100 μm mesh) VWR, ドイツ734-0004
NMR チューブ VWR, ドイツ634-0461
EQUIPMENT
解剖ツールFST
CO2 インキュベーター バインダー
小動物 MR システムブルカー バイオスピン9.4T BioSpec 94/20 USR、ParaVision 取得および処理ソフトウェア
1H/19F デュアルチューナブルボリューム RF コイル Rapid Biomed, Würzburg、ドイツ内径35 mm、長さ50 mm
19F分光コイル社内チューニング/マッチループコイル、4ターン、内径5 mm、長さ10 mm、イソフルラン吸入システムのチューニングとマッチング用のコンデンサ2
Föhr Medical Instruments GmbH
動物モニタリングシステム Model 1025SA Instruments Inc., New York, USA
個

参考文献

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  1. Yeh, T. C., Zhang, W., Ildstad, S. T., Ho, C. In vivo dynamic MRI tracking of rat T-cells labeled with superparamagnetic iron-oxide particles. Magn. Reson. Med. 33 (2), 200-208 (1995).
  2. Weissleder, R., Cheng, H. C., Bogdanova, A., Bogdanov, A. Magnetic....

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