使用して樹状細胞の移行の監視<sup&gt; 19</sup&gt; F /<sup&gt; 1</sup&gt; H磁気共鳴イメージング

サマリー

MRIを用いて細胞の追跡は、過去数年間に顕著な注目を集めている。このプロトコルは、フッ素と樹状細胞のラベルを記述する（ ¹⁹ F）に富む粒子、これらの細胞のin vivoでの応用、で排出リンパ節への移動の程度を監視する ¹⁹ F / ¹ H MRIと ¹⁹ F MRS。

要約

このような磁気共鳴などの非侵襲的イメージングモダリティの継続進歩はイメージング（MRI）は、大幅に生活生物の生理的または病理学的プロセスを研究するために我々の能力を改善している。 MRIはまた、in vivoで移植された細胞を捕捉するための貴重なツールであることが証明されて。 MR緩和時間に影響を与える造影剤のMRIなさ使用する初期細胞標識戦略（T1、T2、T2 *）と標識された細胞が存在するシグナルの増強（T1）又は枯渇（T2 *）につながる。このような超酸化鉄剤（USPIO）は細胞遊走およびいくつかを研究するために用いられてきたとしてT2 *増強剤は、臨床応用のためにFDAによって承認されている。 T2 *剤の欠点は、血液凝固、マイクロ出血や気泡等の他のアーティファクトから標識された細胞によって作成された信号消光を区別することが困難である。本稿では、 生体内でトラッキング細胞についての新興技術を記述するフッ素^（19 F）が豊富な粒子で細胞をラベルに基づいています。これらの粒子は、パーフルオロカーボン（PFC）の化合物を乳化することにより調製し、その後MRI ¹⁹ Fによって画像化することができる標識細胞に使用される。 生体内では、（i）は、その後¹⁹ F MR分光法による細胞シグナルを定量化するために、背景のない画像と完全セルselectivityand（ii）の可能性をもたらし、生体内での炭素に結合した¹⁹ F、非存在下で細胞を追跡するためのPFC類の重要な利点。

概要

生体内での細胞の追跡は生物医学のいくつかの分野において重要な側面である。このために、選択的に、ある期間にわたって細胞をローカライズすることができ非侵襲イメージング技術は非常に貴重である。 3次元磁気共鳴イメージング（MRI）の開発に先立ち、免疫細胞遊走の追跡は、顕微鏡の分析又は組織生検に限られていた。 MRIの助けを借りて追跡細胞は、 生体内の免疫細胞の挙動を研究するための免疫学者だけでなく、臨床および幹細胞の研究者だけでなく、過去数年間で莫大な注目を集めている。 90年代半ばの間に、酸化鉄の最初の研究では、MRIで追跡セルに対して開発のカスケードを開始した¹ナノ。酸化鉄粒子は、標識された細胞のMR緩和時間（T2 *）短縮し、従って、MR画像の信号枯渇を招く。酸化鉄粒子は、ラベルマクロファージ^2、オリゴデンドロサイトウェブに採用されているrogenitors ³および他の多くの細胞型。これらの粒子の一部は、臨床的にメラノーマ患者⁴のセルラワクチンを標識するためにFDAによって承認されている。 インビボで発信または酸化鉄粒子による細胞のex vivoでの標識は、T2 *信号の短縮に依存しており、後者はまた、マイクロ出血、鉄沈着物や気泡等のインビボ感受性に関連したT2 *効果によってもたらされることができるそれは、他のバックグラウンドT2 *信号絶滅⁵からin vivoで標識された細胞を同定することは困難かもしれません。

本稿では^、19 F / ¹ H磁気共鳴イメージング（MRI）を使用することによってインビボで樹状細胞（DC）を追跡する技術が記載されている。この細胞トラッキング技術は、MRIにおける¹⁹ Fのために最初に認識アプリケーションが^7と報告されていた数年後、2005年⁶で導入されました。一つの重要なアドバ酸化鉄粒子の細胞標識上の¹⁹ Fのntageは、組織内の¹⁹ Fの低い生物学的な発生であり、これは、基本的に背景のない画像と非常に選択的に細胞を追跡することが可能となる。また、従来1H MRIから得られた解剖画像で標識した細胞移植から¹⁹ F MR信号をオーバーレイすることができる^。19 F / ¹ H MRIしたがって、in vivoでの細胞遊走を調査研究にかなり関連している。この方法で検討した細胞を¹⁹ F-リッチな粒子で標識される。主に炭素およびフッ素原子からなる合成由来パーフルオロカーボン（PFC）は、一般に粒子を調製するために使用される。これらの化合物は水に不溶性であり、in vitroまたはin vivoでの適用の前に乳化する必要がある。 インビボ¹⁹のための他のグループによって使用されてきたPFC粒子F-MRI追跡実験の通常のサイズ100 nmおよび245 nmの^6,8-10の間の範囲にある。我々は、しかし、ことが示されている増加粒径（> 560 nm）のとペルフルオロ-15 -クラウン5 -エーテル（PFCE）粒子が増えると樹状細胞をラベルで効率¹¹

プロトコル

全ての動物の手順は、実行前に地元機関動物福祉委員会によって承認されなければならない。 MR測定中麻酔生理学的モニタリングの適切なレベル（体温、呼吸数）は必須の要件である。

1。マウス骨髄由来樹状細胞の生成

1. 以前に^12を説明したように、このプロトコルは1992年¹³にまで遡り、もともとラルフM. Steinman氏（1943年から2011年）、樹状細胞¹⁴の発見者のグループによって記述されていた 。C57BL / 6マウスから骨髄細胞を抽出します
2. 簡単に説明すると、マウスを犠牲にした後すぐに脛骨と腓骨を抽出します。層流フード（微生物汚染を防止するため）の下で働く、洗浄媒体（5％FBS、RPMI中1％ペニシリン/ストレプトマイシンおよび^{1％HEPES）12}の小さなペトリ皿に骨髄を洗い流す。
3. ストラセルを介して細胞懸濁液を転送する慣性力（100μmのメッシュサイズ、ナイロン）滅菌50 mlの遠心チューブに骨と残りの組織を除去するため。いくつかの洗浄工程および溶解ステップ¹²の後、トリパンブルーと血球計数器を用いて生細胞を数える。
4. マウス顆粒球の75 ngの溶液^-1を含む培養培地40万細胞ml ^-1の濃度（RPMI、10％FBS、1％ペニシリン/ストレプトマイシン、1％HEPES、1％L-グルタミンで補充）で再懸濁し、骨髄細胞プラスミドマウスGMCSFでトランスフェクトHEK 293FT細胞の上清から得られたマクロファージコロニー刺激因子（MGM-CSF）。ペトリ皿中の細胞懸濁液（4×10 ⁶細胞）（100ミリメートル×20ミリメートル）を10mlを転送し、CO ₂インキュベーター（37℃、5％CO _2）でインキュベートする。 3日目に、10ミリリットル新鮮培地（75 ngのミリリットル^-1でMGM-CSFの最終濃度を保つ）で古い培地を補充。 6日目に、古い培地10mlを削除して補充する10ミリリットル新鮮な培地と（MGM-CSFの最終濃度= 75 ngのミリリットル^-1）。 8日目に、古い培地10mlを削除し、10ミリリットル新鮮な培地（MGM-CSFの最終濃度= 150 ngのミリリットル^-1）で補充。
5. 10日目に、24時間のために1μgのml ^-1のリポ多糖（LPS）との差別化されたDCを成熟。

2。 ¹⁹ F-リッチ粒子と樹状細胞の標識

1. 24時間成熟段階（1.5）の間に、ラベル1 mMのフッ素豊富なペルフルオロ-15 - クラウン5 - エーテル（PFCE）粒子（500から560 nm）を持つDCも24時間。セル中断チタンソノトロードを使用し、60秒間連続パルスプログラム（振幅100％、電力= 250 W）を採用（総量2.5ミリリットル）プルロニックF-68にPFCEを乳化することによって大フッ素標識粒子を準備します。
2. 上記のインキュベーション工程、収穫組織培養細胞スクレーパー、50mlの遠心チューブに転送し、遠心分離機を用いて成熟したフッ素標識DCフォロー500室温で5分間×gで。
3. 残っ粒子と死んだ細胞を洗い落とすために、ポリ-L-リジン皿に付着するように採取した細胞を残す。このステップのために準備するには、1時間37℃でポリ-L-リジン（1mgを加え^-1）で被覆ペトリ皿、その後PBSで結合していないポリ-L-リジンを洗い流してください。
4. 無血清培地においてポリ-L-リジンでコーティングしたプレート上で採取された細胞の上方インキュベートし、細胞を付着させ（37℃で1時間°C、5％CO _2）。
5. 非接着細胞、残りの粒子と死んだ細胞を破棄して、で三回洗浄するための媒体を洗い流し予め温めておいた（37℃）PBS。
6. トリプシン-EDTA処理（0.25％トリプシン-EDTA、37℃で3分間のインキュベーション）によって収穫付着細胞を。
7. 別の洗浄遠心分離工程の後、血清を含まない滅菌PBSで成熟DCの必要量を再懸濁する。
8. 細胞が正常にラベル付けされているかどうかを判断するには、理化学的にチェックすることをお勧めしますフローサイトメトリー（FACS）を用いて細胞の特性mical。側方散乱（SSC）は、前述の¹¹として、これらの細胞において増加した粒度を明らかにする必要があります。また、線維芽細胞は、DC文化を汚染する可能性があり、また、並列に¹⁹ F粒子を取る可能性があることに留意すべきである。従って、DCの純度は、 インビボでのアプリケーションの前に（FACSを用いたCD11c ⁺のCD11b ⁺細胞の割合を測定することによって）評価されるべきである。

^（3）19 F標識樹状細胞の生体応用で

1. 50の容量で- DC（10 ⁷ 10 ^6） -管理ホルダーにマウスを合わせて慎重に26を挿入することにより、C57BL / 6マウスの後肢に皮を100μl½Gの針を皮膚の上層に適用前に（恒久的に接続された針で使用する0.5ミリリットルのツベルクリン注射デッドボリュームを最小限にするために）。確保するためにnの適切な皮アプリケーションは、それが針の挿入部分が皮膚の下に部分的に表示することが重要である。針はもはや表示されない場合は、針が皮膚層に過度に深く挿入されている。訓練されていない個人の場合は、皮内アプリケーションは麻酔下で行うことができた。
2. in vivoでのフッ素^（19 F）/プロトン^（1 H）MRI（次のセクションを参照）21時間以下の注射にして画像手足を。

4。 インビボでの ¹⁹ F / ¹ H磁気共鳴画像

MRスキャンを設定するための詳細な手順は、コントロールソフトウェアParavison（バージョン5.1）を使用して、ブルカーMRスキャナを参照してください。ベンダー固有の機能やアイテムを参照する名前はイタリック体で強調表示されています。他のMRスキャナのためにこれらの手順では、メーカーのガイドラインに応じて調整することが必要になることがあります。

1. 専用へのアクセスを手配小動物MRスキャナ。ラピッドbiomedの、ヴュルツブルク;十分な画質、9.4テスラ以上、合わせた無線周波数コイル（ 例えば^、1 H / ¹⁹ Fデュアル可変容積RFコイル35内径、長さ50mmの磁界強度を持つシステムのドイツ）をお勧めします。
2. MRIの前に、麻酔と生理学的モニタリングのためのMRIスキャナのセットアップを準備します。動物のベッド/ホルダーの呼吸マスクはイソフルランシステムに接続し、温度プローブと呼吸パッドは遠隔動物モニタリングシステム（ 例えばモデル1025、SAインスツルメンツ社、ニューヨーク、USA）に接続されていることをされていることを確認。後者は、例えば、体温や呼吸などの動物のバイタルパラメータを監視するのに役立つ。
3. イソフルランシステムに接続されているマウスのチャンバーを用いて吸入麻酔によりマウスを麻酔。 0.2 L分^-1および0.1 L min ^-1の、それぞれの空気及びO ₂流量を調整するそして麻酔の必要なレベルまで、約2分間イソフルラン3％は（気化器から調整）（無応答次つま先のピンチ）に到達する。最適な流量は使用されている設定によって異なります。高流量が脱水につながる可能性があることに注意してください。上述したように、動物の条件を注意深く監視が常時必要とされる。
4. 小動物MRスキャナ（ 図1）のマウスベッド/ホルダーになりやすいマウスを置きます。
5. 空気およびO ₂に対して一定の流量を維持しながら、0.8イソフルラン気化器を調整- 1.5％最適な呼吸パターンに到達するまで。 50の呼吸速度 - 毎分70回の呼吸をお勧めします。
6. 暖かい水（あるいは温風）循環システムを採用することにより、実験中に36〜37℃の体温を維持する。
7. 測定中に無菌の眼潤滑軟膏とマウス湿っの目を保つ。
8. 動物を確保した後、撮像ホルダーと監視システムへの接続には^、1 H / ¹⁹ F RFコイル（動物スキャナ磁石のアイソセンタに配置されている）の中央にホルダを移動する。
9. 自動化された方法（ 例えば、電動動物ホルダと組み合わせ位置決めレーザを使用して）、または手動ホルダを移動する必要がある距離を算出することのいずれか、膝磁石のアイソセンタ内にあるように、マウスの位置を設定する磁石にアイソセンタに到達する。
10. スキャナにおける動物の正しい位置を確認し、後で画像スライスのジオメトリ（空間すなわち大きさ、位置、回転）の計画については、迅速かつ低解像度の画像を使用して、3つの標準的な向き（矢状、冠状、軸方向）で画像をスカウト獲得測定メソッド（FLASHパルスシーケンスを使用して、例えばTriPilotプロトコル）。
11. ¹ H共鳴周波数にRFコイルをチューニングする（ 例えば。400.1 9.4 TのためのMHz）および¹⁹ F共鳴周波数（ 例えば 9.4 Tのための376.3 MHzの）とは、動物MRスキャナのチューニングモニタを使用して50オームにコイルの特性インピーダンスと一致します。チューニングとマッチングは、送信および信号受信のための最適な条件を達成するために必要である。
12. RFの振幅を調整するために、マウス（ 例えばADJ_SF）および基準ゲインのラーモア周波数にRFを調整するためにシステム周波数の調整、微調整に磁場（ 例えばADJ_SHIM）の均一性をシミングを含む必要なシステムの自動設定を行い（ 例えばADJ_REFG）。これらのすべての設定は、可能な限り均質に関心領域における静的および可変磁気フィールド（B _{0、B 1）を}行うことが重要である。
13. 視野（FOV）ように、下肢の両方arを調整した後、直交三の方向に沿ってスカウト画像の第2のセットを（同上）を取得する骨盤から足（長さx幅x高= 50x25x25ミリ）に見えるのe。これらの画像は、最終的な3D ¹ H / ¹⁹ Fスキャンの方向を計画するのに役立つ。
14. TR / TE = 1500/53ミリ秒、FOV = 50x25x25ミリ、マトリックス= 400x200x200、RAREファクター= 16（スキャン時間約60分^）：1 H-スキャンTurboRARE 3Dプロトコルを設定します。スカウト画像の助けを借りて、FOVを調整し、（ トラフィックライト ）スキャンを開始。
15. 少なくとも1000ミリ秒のTRと単一パルスFID-シーケンスをロードします。 スキャンを編集して^、19 Fに核を設定して開くツールボックスの編集方法の自動リファレンスゲインの選択を解除して手動のゲイン設定を使用します。
16. GSPを （セットアップに行く）を使用してリアルタイムにMR信号を表示するには、記録データなしで測定を開始します。取得窓内で¹⁹ Fスペクトル信号が低すぎる場合、 編集方式で複数の平均値を追加および/ ​​または済州まで、パルス減衰器（TX0またはSP0スライダ ）を調節するgnalがはっきり見えるようになります。アクイジション·ウィンドウに0 Hzでセンター¹⁹ Fスペクトルピークをするために基本周波数を調整します。 基本周波数とプレス停止を適用します 。麻酔として使用イソフルランは、バックグラウンド信号を生成することができることに留意されたい。 9.4テスラMRIでの¹⁹ F-含有粒子とイソフルランの間の化学シフトは1,800 Hzの程度である。励起帯域幅は¹⁹ F-標識された細胞または粒子を励起イソフルラン一緒を避けるために、3,600 Hzのよりも小さくなることを確認してください。基本周波数は^、19 F標識細胞によって生成された信号に正しく設定する必要があります。実験者が適当と考える代わりに、麻酔の別の方法を使用することができる。
17. クローン（複製）は、前の¹ HのスキャンからTurboRARE 3Dプロトコル。 方法と選択解除自動リファレンスゲイン（上記） を編集するために行く。 編集スキャンから¹⁹ F核を設定します。 128x64x64に行列を変更するそして少なくとも40（64まで）までRAREファクタ。 TR / TE 1,000 / 6秒と64の平均値は、スキャン時間は約70分です。 101（ ツールボックス ）に受信ゲインを設定し、（パイプラインを行く）GOPを使用して、任意のさらなる調整なしでスキャンを開始します。
18. スキャンはMRスキャナからマウスホルダーを撤回し終わったら。ホルダーから慎重にマウスを外します。マウスが直接MR測定した後（ 例えば、組織型または分光法、下記参照）ex vivoでの分析のために犠牲にされていない場合、それは完全に麻酔から回復したまで、厳密に監視する。体温調節が麻酔によって影響されるため、復旧処理中に、温かい温調パッド上に配置される別個のケージにマウスを入れた。マウスが完全に麻酔から回復した後は、その保持ケージにと動物の部屋にそれを返します。
19. ¹ H画像に¹⁹ F画像をオーバーレイするには、[表示]メニュー O を使用同一のソフトウェア（Paravison）にption。 アンダーレイ機能は、 相関の下で見つけることができます。 、下敷きを保存し、新しいイメージをロードして、 ルックアップテーブルから新しい色を定義することによって^、19 F層を強調表示します。 ¹⁹ Fと¹ Hスキャンを区別するために^、19 F信号は、選択した色と背景¹ H画像を持っているようなグレースケールのままになります（ カットテーブルをルックアップ ）選択した色のしきい値を変更する。その他の後処理プログラム（ 例えば ImageJのは^、1）H / ¹⁹ Fイメージオーバーレイを作成することが可能です。
20. ¹⁹ F信号のin vivo定量における前述の^15,16のような単純な定量的なプロトコルに従って、必要となるでしょう。要するに、定量化は、マウスへの次のFOV内のPFCEエマルジョンの既知濃度と基準チューブを配置することによって行うことができる。 MR画像を取得した後、量子関心領域（ROI）分析を用いて¹⁹ F信号の強度を識別し、Pro Toolsと共に使用し、 図2に示すように、 インビトロでの検量線に比較します。

5。リンパ節磁気共鳴分光法（MRS）

1. マウスを犠牲にした後、小型5ミリメートルNMRチューブに膝窩リンパ節と場所を削除して、2％PFAを100μlを加える。
2. リンパ節を含むNMRチューブを保持するために少なくとも5mmの開口部を有する¹⁹ F分光コイル（トロイダルコイルなど ）をインストールします。
3. コイル内部のNMR管を配置し、マグネットのアイソセンタにコイルを移動します。
4. ¹⁹ F共鳴周波数（ 例えば 9.4 Tのために376.3 MHz）でのRFコイルをチューニングし、動物MRスキャナのチューニングモニタを使用して50オームにコイルの特性インピーダンスと一致します。チューニングとマッチングは、送信信号との最適条件を達成するために必要であるレセプション。
5. 0〜 シミングツールボックス内のすべてのシムのパラメータを設定して適用を押します。通常は、試料の体積が比較的小さいので、シミングの方法を適用する必要はない。 ¹⁹ F十分な信号が利用可能な場合は、自動化された方法は、シム、システム周波数、上述したように、受信機利得を適用することができる。
6. 少なくとも1000ミリ秒のTRと単一パルスFIDシーケンスをロードします。 スキャンを編集して^、19 Fに核を設定して開くツールボックスの編集方法の自動リファレンスゲインの選択を解除して手動のゲイン設定を使用します。 1〜アベレージング回数を設定します。
7. GSPを使用してシーケンスを開始します。取得窓内で¹⁹ Fスペクトル信号が低すぎる場合、 編集方式で複数の平均値を追加および/ ​​または信号がはっきりと表示されるまでパルス減衰器（TX0またはSP0スライダ ）を調節する。基本周波数を調整しますので^、19 FのSPEctralピークは0 Hzで収集ウィンドウの中心にあると基本周波数を適用します。 90°励起に達するために、信号を最大化するために再びパルスアッテネータを調整します。信号が最大のプレス停止しているとき。
8. 64と256の間の編集方法 （以上、必要に応じて、信号に応じて）の平均値を設定し、GOPを使用して取得を開始します。検出された信号は、平均の数に比例して相関する。定量化中に検出信号が1の平均に正規化する必要があることに留意してください。さらに、既知の濃度または検量線の検量標準は、正規化された¹⁹ F信号（ 図2）からの細胞の数を計算する必要がある。
9. スキャンが終了したら、サンプルを削除する次の試料を配置し、ステップ5.3に進みます。

結果

皮内適用 ​​後十八に二〇から一時間^、19 F標識樹状細胞（DC）は、排水膝窩リンパ節に移行します。排出politealリンパ節へのリンパ管を介してDCの移動は^、19 F DC画像（ 図2A）と¹ H解剖画像を重ねることによって理解することができる。我々は以前に、in vivoでのこれらの細胞の遊走、ならびに吸収効率¹¹を含むDC免疫生物学上の¹⁹ F-粒径の影響を報告している。リンパ節へのDCの移動の程度を定量化するために、我々は、流入領域リンパ節を取り出し^、19 F MRSを（ 図2B）を行う。我々は推測することができ、同じPFCE粒子（検量線、 図2C）で標識されたDC異なる数から得られた¹⁹ F信号と各リンパ節から得られた¹⁹ F信号を比較する排出リンパ節に到達¹⁹ F-ラベルされたDCの数。 図2A...

ディスカッション

リンパ節へのDCの移動に追従する¹⁹ F / ¹ H MRIを用いるこの方法は、 生体内で免疫細胞の移動パターンを検討する機会を与える。樹状細胞は急速に緊密に特定の基材¹⁷に付着することなく3次元構造を通して操縦することができる免疫細胞の移行の優れた例である。記載された技術の低い空間分解能（μmの範囲は）多光子顕微鏡で達成することができる高分解能（nmの範囲）と同等ではありませんが、この技術では、 生体内で以上の細胞移動の性質を研究することも可能です長期間。さらに、顕微鏡は生体内イメージング大きな領域のため、それが現在は適さない、限られた深さの浸透とビューの限られたフィールドがあります。

技術の非侵襲性のために、共通に可能である調査の後、マウスを犠牲にすることなく数日間デンサ免疫細胞の遊走を。手法の別の利点は、それによって生体内での細胞の正確な位置決めを可能にする、解剖学的¹ Hスキャンと遊走細胞を捕獲¹⁹ F画像をオーバーレイする可能性...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
試薬
>C57BL/6マウス	Charles River, Berlin
RPMI	Gibco	21875-091
FBS Superior	Biochrom AG	S 0615
HEPES	Gibco-Invitrogen	15630-056
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140-122
L-グルタミン	Gibco	25030-024
Dulbecco's PBS	Sigma Aldrich	D8662
PFA	Santa Cruz	sc-281692
Perfluoro-15-crown-5-ether	ChemPur	391-1996
Pluronic F-68	Sigma Aldrich	P5556
ペトリ皿 (35 x 10 mm)	VWR, Germany	391-1996
27 ½Gシリンジ	VWR、ドイツ	612-0151
ナイロンセルストレーナー(100 μm mesh)	VWR, ドイツ	734-0004
NMR チューブ	VWR, ドイツ	634-0461
EQUIPMENT
解剖ツール	FST
CO2 インキュベーター	バインダー
小動物 MR システム	ブルカー バイオスピン		9.4T BioSpec 94/20 USR、ParaVision 取得および処理ソフトウェア
1H/19F デュアルチューナブルボリューム RF コイル	Rapid Biomed, Würzburg、ドイツ		内径35 mm、長さ50 mm
19F分光コイル	社内		チューニング/マッチループコイル、4ターン、内径5 mm、長さ10 mm、イソフルラン吸入システムのチューニングとマッチング用のコンデンサ2
	Föhr Medical Instruments GmbH
動物モニタリングシステム Model 1025	SA Instruments Inc., New York, USA