ラットにおけるグルコースとイントラリピッドの慢性的な注入のためのプロトコルが記載されている。このモデルは、臓器機能および生理学的パラメータに対する過剰な栄養素の影響を研究するために使用することができる。
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この記事について
サマリー
要約
栄養素の過剰なレベルへの慢性暴露は、いくつかの臓器や組織の機能に影響を与えると2型糖尿病など、肥満やメタボリックシンドロームに関連する多くの合併症の発展に寄与すると仮定される。グルコースおよび脂肪酸の過剰レベルは膵臓β細胞およびインスリンの分泌に影響を及ぼす機序を研究するために、我々は、ラットにおける慢性的な栄養輸液モデルを確立した。 7日間の回復期間を可能にする。、スイベルと、ケージ内で自由に移動することを可能にする動物カウンタウェイトシステムを使用してポンプにカテーテルを接続すると、注入する手順は全身麻酔下右頸静脈、左頸動脈をcatheterizingから成りグルコース及び/又は72時間、イントラリピッド（ヘパリンを注入したときに約80％unsaturated/20％飽和脂肪酸の混合物を生成する大豆油エマルジョン）。このモデルは、いくつかのアドバンタを提供しています薬理学的化合物を共注入するためのオプションが、前記食物モデルとは対照的に、比較的短い時間枠細かくグルコースおよび脂肪酸の循環目標レベルを調節する可能性を含むGES。なお、臓器の様々な栄養素誘発性機能不全のメカニズムを検討し、この文脈において、薬物の有効性をテストするために使用することができる。
概要
慢性的に血液循環におけるグルコースおよび脂質レベルの上昇は、膵臓β細胞（口コミを含むが、これらに限定されないグルコース恒常性の維持に関与するいくつかの器官の機能を変更することによって、2型糖尿病の病因に寄与することが提案されている1）。慢性高血糖は、このように悪循環を作成し、2型糖尿病患者における血糖コントロールの悪化に寄与する、そもそも高血糖を生じたβ-細胞の欠損を悪化させること糖毒性の仮説断定。同様に、glucolipotoxicity仮説は、しばしば2型糖尿病で観察されたグルコースと脂質レベルの同時上昇は、β細胞に有害であることを提案している。
膵β細胞機能に慢性的に高い栄養素の有害な影響の細胞および分子メカニズムを解読するunderstandiの鍵である2型糖尿病の病因の1 ngの。そのために、多くの研究は、ランゲルハンスの単離された膵島またはクローン、インスリン分泌細胞株におけるインビトロにおける慢性栄養素過剰ex vivoでのメカニズムを検討した。培養細胞又は膵島において使用脂肪酸の濃度はほとんどインビボ 2 における β細胞の近傍の循環レベルと一致していないので、これらのモデル系で得られた知見の生物体全体への変換は、具体的には、複雑である。一方、栄養素過剰に応答して、β細胞障害機構は、糖尿病のZuckerラット脂肪3,4、スナネズミPsammomys obesus 5および高脂肪食によって例示さ、糖尿病のげっ歯類モデルにおいて検討されている給餌マウス6。これらのモデルは、しかし、本質的な代謝異常を特徴とし、血中グルコースの操作が容易に従順ではないおよび/またはより制御と少ない慢性設定で脂質レベル。そうしないと正常動物の日数期間における栄養レベルの循環変更できるようにするために、我々は生理的パラメータおよび機能に、私たちが単独で、または組み合わせて、脂質とグルコースの効果を調べることができ、正常ラットの慢性注入モデルを開発しました7,8。
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プロトコル
概要：; 7日間の回復期間を許可する、スイベルやケージ内を自由に移動するために動物を可能にするカウンターウェイトシステムを使用してポンプにカテーテルを接続する手順は、全身麻酔下に右頸静脈と左頸動脈をcatheterizingで構成されています; 72時間グルコース及び/又はイントラリピッドを（ヘパリン9を注入したときに約80％unsaturated/20％飽和脂肪酸の混合物を生成する大豆油エマルジ ョン）注入する。
1。右頚静脈と左頸動脈のCanulation
- 外科用器具を滅菌する。 Canulationチューブも手続き前に液体滅菌剤（2.6％グルタルアルデヒド）を使用して冷滅菌でなければなりません。 16-24時間、オートクレーブ容器にチューブを浸します。すすぎ、使用前にグルタルアルデヒドのすべてのトレースを削除するには、滅菌蒸留水で十分に洗い流してください。
- 計算するためにラットを秤量薬の投与量：
カルプロフェン5 mg / kg体重：希釈、1/10 =本体重量（g）×0.001ミリリットルSC（鎮痛剤）
希釈の1/10 = BW（G）X 0.0012ミリリットルSC（抗コリン）：0.01 mg / kgでのグリコ - イソフルランと酸素を使用してラットを麻酔。
- その胃にラットを置きます。肩のベースに耳の後ろの領域を剃る。その背中にネズミを置き。前足に首下の領域を剃る。
- プレップクロルヘキシジン、アルコール、ヨウ素と手術部位。薬を管理します。
- 手術野にラットを転送します。
- 無菌技術を使用して、ヘパリン化生理食塩水の5 Uでいっぱい、1mlのシリンジに接続されているPE-50カニューレと右頚静脈と左頸動脈にカニューレを挿入する。回復期間中に凝固を避けるためにヘパリン加生理食塩水を50 Uとカニューレをフラッシュします。鈍化23G針を使用してください。 23Gピンでそれぞれカニューレを閉じます。
- 手術後、オフ約2.5ミリメートルトリムボトム門歯と食べられているからカニューレを防ぐために、点滴のジャケットにラットを配置。
- イソフルラン避難支援する酸素（1L / 10分間分）を提供します。
- それは完全に目を覚ましになるまで加熱したケージにラットを置きます。
- 注入条件ごとに1つを使用するために4匹のラット（ 表1）を操作してください。
2。術後のケア（カテーテルの後の外科的治療と接続）
- 1日目と2日目手術後にラットの重量を量る。
- 1日目手術後に、一度2日目手術後に二回グリコ（BW（G）×0.00048ミリリットル）SCを管理します。
- 必要に応じて追加の支援的な治療を投与することができる：流体、加熱パッド、ぬれたダイエット、酸素療法、鎮痛薬、抗コリン薬。
- 7日目手術後では、注入のための流量を計算するためにラットの重量を量る。
- ケージグリル上部（図1）に搭載されたテザーとスイベルを使用して注入システムに各ラットを接続します。
- 血栓を除去するためにヘパリン化生理食塩水の5 Uとカニューレをフラッシュします。凝固防ぐためにヘパリン加生理食塩水の50 Uでもう一度カニューレをフラッシュします。
- ラットは注入を開始する前に、少なくとも24時間、テザーとスイベルに順応することができます。
3。注入
- 各ラットと対策血糖の頸動脈からの血液0.15ミリリットルを描画します。頸静脈カニューレをフラッシュします。各ラットの両方のカニューレ内凝固を防ぐためにヘパリン化生理食塩水の50 Uを使用してください。
- 2％EDTAを含有するの0.5ml収集チューブに血液サンプルを移す。 2分間10,000 rpmで遠心し、-20℃で血漿を凍結
- 下記の注入条件ごとに2つの60ミリリットル注射器を充填する。ポンプの後ろの位置にポンプと場所シリンジ2の正面の位置に置きシリンジ1。
- Y-コネクタと滅菌されたCO-EX T22チューブと一緒にソリューションの各ペアに参加します。ハーバード33に注射器を置きデュアルシリンジポンプ。
- ケージ底を変更して、ケージのグリル上から全ての食品を除去します。
- ケージのグリル上部に標準餌と場所150gの重量を量る。
- ケージグリル上のスイベルに注射器を接続します。ラインから閉じ込められた空気を除去するために適切に注射器をフラッシュします。
- 輸液システムにラットを接続する前に撮影された体重を使用して、注入流量を計算する。料金はミリリットル/ hの中にグルコース注入率（GIR）を変換し、Microsoft Excelファイルで計算されています。
- メーカーの設定に応じて60ミリリットル注射器のための流量を管理するためのポンプを設定します。シリンジ1のレート（フロントシリンジ）と注射器2（バックシリンジ）のレートを入力します。
- ポンプを始動。
4。モニタリング
- ポンプを起動した後、そこにはスイベルから、あるいはカニューレから漏れていると、その輸液チューブがねじれていないことを確認していません。また内に気泡が存在しないことを確認チューブ。
- 注入の3時間後に、血糖をモニターするために血液サンプルを取る。 48、24、6の後に繰り返して、注入の72時間。予防策として、血糖はまた、注入の30、34、54、及び60時間後に監視される。血中グルコースは、携帯型グルコース·モニターを使用して、全血の一滴を用いて測定することができる。これは、注入時に採取した血液の量を制限し、したがって有意に変化させる血液量および/またはヘマトクリットを回避する。
- シリンジ1のレートは、220〜250ミリグラム/ dlとで血糖値を維持するために血糖値に基づいて修正される。遊離脂肪酸を1モル/ Lに維持されるため、シリンジ2のレートは、注入の72時間中に変化しない
- 注入条件は、対照動物のための受信されたボリュームは、試験動物（ 表1）受信された体積に相当するように対になっている。
- 注入の24時間後、ケージ底を変更して、ケージのグリルに残っている食べ物を重量を量る。食べ残しの部分tを返しますケージグリルÔ。 48時間後に繰り返します。
- 注入の72時間の間に、必要に応じて毎日の詰め替え注射器。
- 注入時には、常に炎症や不快感の兆候のためラットを観察します。必要に応じて適切な介護を管理します。
5。注入後の安楽死
- 注入の72時間後、ラットをケタミン/キシラジンカクテル（ケタミンおよびキシラジンの11.6 mg / kgを182 mg / kgでは0.9％NaClで1:2に希釈）を0.5mlと静脈麻酔する。
- つま先ピンチ反射を麻酔のレベルを確認するために使用される。必要に応じて追加の麻酔薬を投与する。
- ラットが麻酔の場合は、腹腔は、外科はさみで開かれます。ラット大動脈または大静脈から注射器に血液を10〜15ミリリットル描画することで放血される。
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結果
手術を受けた42匹のラットの系列のうち、5匹は術後期間中に失われ、1ラットは86％の全体的な成功率を表す、注入中に失われた。最終的に注入した37匹のラットの平均体重は608だった±5手術前にgおよび588±注入開始時の6グラム（平均±SEであり、n = 37、P <0.0001を対応のあるt検定によって）。以下の代表的な結果は、2注入群で得られた。生理食塩水（SAL）、及びグルコース+イントラリピッド（GLU + IL） 図2Aおよび図2Bの血糖および脂肪酸レベルは、それぞれ、72時間の注入期間中に。 図3に示すように設計することで、血糖値は、通常の測定値およびグルコース注入率（GIR）の調整に基づいて、点滴を通して220-250周りミリグラム/ dlとを維持している。齧歯類は、内因性インスリン自体を増加させることによりグルコース注入を補償するための強力な能力を持っているcretion。したがって、GIRは相対定常状態に維持することが血中グルコースレベルの注入の過程で増加させなければならない。それにもかかわらず、血中グルコースレベ...
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ディスカッション
先行研究の数が我々の知識に、げっ歯類ではグルコース（ 例えば 10-15）や脂質（ 例えば 16,17）の慢性的な注入を採用しているが、両方の燃料の組み合わせ注入はマウスだけ18で報告されている。ここで紹介する慢性注入モデルはラットの生物学的機能の様々な栄養過剰の影響を研究するためのいくつかの利点を提供しています。まず、遺伝的に肥満の齧歯類を含まない、及びヒトにおける一般的な肥満が多遺伝子19であるため、調査結果は、したがって、一般集団における栄養素供給過剰の影響に関連する可能性が高い。第二に、このモデルは、その性質および注入流量を変えることによって、異なる循環レベルでさまざまな栄養素（特に糖又は脂肪）の効果をテストする可能性を提供する。第三に、投与の経路IVはNUTRと共に化合物または薬剤の混注を実現ients 20。最後に、実験の比較的短い時間枠（高脂肪食誘導されるモデルのための72時間対週）前臨床研究のための費用と時間が有効である。
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開示事項
ヴィンセントPoitoutは共同創立者であり、Bêtagenex社、商用サービスとして、この記事で紹介輸液モデルを提供し、契約研究機関から研究契約を受け取った。
謝辞
この作品は、国立衛生研究所（R01DK58096ヴィンセントPoitoutまで）によってサポートされていました。ヴィンセントPoitoutは、糖尿病と膵β細胞機能におけるカナダリサーチチェアを保持しています。ベイダーZarroukiはメルクとイーライリリーからポスドクフェローシップを受けた。 GhislaineFontésは、カナダ糖尿病協会からのポスドクフェローシップによってサポートされていました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 生理食塩水 0.9% | BD | JB1324 | |
| デキストロース 70% | マッケソン | ||
| イントラリピド 20% | フレゼニウス カビ | JB6023 | |
| メメトリックイド (グルタルアルデヒド 2.6%) | メトレックス | 11-1401 | |
| ヘパリンナトリウム 10,000 USP u/ml | PPC | ||
| カルプロフェン | メタカム | ||
| グリコピロレート | サンドイ | ||
| ソフルラン | アボット | ||
| クロヘキシジン2% | |||
| アルコール70% | |||
| ヨウ素 | |||
| PE-50 | BD | 427411 | |
| CO-EX T22 | ステックソロモン | BCOEX-T22 | |
| コネクタ22G | Instech Solomon | SC22/15 | |
| スイベル 22G | Instech Solomon | 375/22PS | |
| Y-Connector 22G | Instech Solomon | ||
| カウンターバランスとアーム | Instech Solomon | CM375BP | |
| 23 G 鈍針 | Instech Solomon | LS23 | |
| 23 G カニューレーションピン | Instech Solomon | SP23/12 | |
| テザー(12インチ) | ロミール | RT12D | |
| 輸液ジャケットロ | ミール | RJ01、RJ02、RJ03、RJ04 | |
| (SM-XL) | |||
| テザーアタッチメントピース | ロミール | RS T1 | |
| 60 mlシリンジ | BD | 309653 | |
| 1mlシリンジ | BD | 309602 |
参考文献
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