海馬スライス培養におけるシナプス蛋白のポストエンベディング免疫金ラベリング

サマリー

タンパク質の局在や分布は、細胞機能を理解するための重要な情報を提供します。電子顕微鏡の優れた空間分解能（EM）は、所定の抗原に続く免疫組織の細胞内局在を決定するために使用できます。抗原性はEM研究で特に困難であった維持しながら、構造的完全性を維持し、中枢神経系（CNS）の組織について。ここでは、ラット海馬CA1錐体細胞におけるシナプスタンパク質を研究し、特徴づけるために、CNS内の構造と抗原性を維持するために使用されている手順を採用しています。

要約

免疫電子顕微鏡法は、細胞内レベルでの生体分子を研究するための強力なツールです。コロイド金として電子密度の高いマーカーに結合する抗体は、様々な組織¹に特異的な抗原の局在や分布を明らかにすることができます。 2つの最も広く使用される技術は、事前埋め込みとポストエンベディング手法です。それが埋め込まれる前に事前に埋め込ん免疫金電子顕微鏡（EM）技術において、組織は、抗体の浸透を可能にするために透過処理されなければならない。これらの技術は、構造体を保持するための理想的であるが、抗体の貧しい浸透（多くの場合のみ、最初の数マイクロメートル）はかなりの欠点は²である。標識は抗原がより簡単にアクセス可能です固定さ​​れた組織の切片上で行われるため、ポスト埋め込み標識方法は、この問題を回避することができます。長年にわたり、多くの修正は、免疫反応を増強し、超微細構造を維持するために、ポスト埋め込み方法を改善している組織固定は、EM研究の重要な部分です。固定剤は、化学的な場所に組織構造をロックするために高分子を架橋する。固定剤の選択は、構造上の保全だけでなく、抗原性とコントラストだけでなく、影響を与えます。四酸化オスミウム（OSO _4）、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒドは、中枢神経系（CNS）の化学的および物理的処理中に構造的な損傷に特に傾向がある組織も含めて、何十年も標準固定剤であった。残念なことに、OSO _4は反応性が高く、貧しいと不十分なラベルで、その結果、抗原^6をマスクすることが示されている。化学固定を避けるための代替的なアプローチは、組織を凍結することが含まれる。しかし、これらの技術は、高価な機器を実行して、必要とすることは困難である。これらの問題のいくつかに対処し、CNS組織のラベリング、Phend らを改善することができます 。酢酸ウラニル（UA）とタンニンACIとOSO _4を置き換えD（TA）は、正常脳と脊髄組織⁷における抗原検出と構造保全の感度を改善するために追加の変更を導入しました。我々は、ラット脳組織にこのオスミウムフリーポスト埋め込み方法を採用してシナプス蛋白を検出し、研究するための免疫金標識技術を最適化しました。

我々はここでラット海馬CA1錐体細胞におけるシナプスタンパク質の電顕的局在を決定する方法を提案する。私たちは、器官培養海馬スライスを使用。これらのスライスは、海馬のtrisynaptic回路を維持、したがってシナプス可塑性を研究するために特に有用であり、機構が広く、学習と記憶の根底にあると思った。生後5日目と6マウス/ラット仔から器官海馬スライスは、以前⁸記載のように調製し、そして急性ノックダウンまたは過剰発現する外来タンパク質に特に有用であることができます。我々は以前にchにこのプロトコルを使用しているニューロ（NG）、シナプス機能^8,9を調節^するのに重要な役割を持つ神経細胞に特異的なタンパク質をaracterize。我々はまた、カルモジュリン（CaM）とCa ^{2 +} /カルモジュリン依存性プロテインキナーゼ^{II（CaMKII）10}の電顕的局在を特徴づけるためにそれを使用している。結果に示されるように、このプロトコルは、樹状突起棘と背骨⁸内での分布を特徴づけるのに役立つNGの効率的な標識の良い超微細構造保存することができます。また、ここで説明する手順では、ニューロンの機能に関与する他の多くのタンパク質の研究に広く適用することができます。

プロトコル

1。固定

固定剤は発がん性がある、手袋を着用し、ドラフト内で固定剤を処理します。特に断りのない限り、すべてのインキュベーションは、氷の上で行われ、すべてのソリューションは、使用する前にフィルタリングする必要があります。電子顕微鏡グレードの試薬を使用しています。

1日目

1. 実験条件（ 例えば 、ウイルス注射、薬物治療）の後、氷冷した0.1Mリン酸緩衝液（ソレンセンのリン酸緩衝液）、pHが7.3を含む60×15 mmのポリスチレンシャーレに器官海馬スライスで膜を配置します。追加1 - 直接スライスの上に0.1Mリン酸緩衝液2mlはそれらを冷たくしておくように。

重要なステップ： 常に作りたてのバッファと固定剤を使用しています。緩衝液のpHが所望の範囲内にあることを確認してください。そうしないと、障害が細胞構造を損傷する恐れがあります。

2. スライスのCA1サブフィールドを分離するには、使用CA1の細胞層（ 図1）と平行に、優しくDGに次のスライスを横断する使い捨てメス。その後垂直にCA3サブフィールドと海馬を除去するために、残りのスライスを切った。組織の上面を識別しやすいように、スライスのコーナーをカットします。

注：目的のタンパク質のないウイルスの引渡しを要しない場合には、メディアが氷冷緩衝液のすすぎ穏やかに除去された後に、全体の組織切片を固定することができる。そして、これはCA1を切り出すが続いている。

重要なステップ： 後でグリッドを適切に区画するために、組織の上値を追跡する。

3. 慎重にメスの裏面を使用して膜から組織を除去する。そっと0.1 Mリン酸緩衝液を含む12ウェルプレートに組織を転送するためにパスツールピペットを使用しています。
4. プレートから井戸にバッファを削除し、500＆mを追加U;リットル - 次から成る氷冷固定液（pH7.3）を1mlの0.1％ピクリン酸、1％パラホルムアルデヒド、0.1 Mリン酸緩衝液中の2.5％グルタルアルデヒド。 4℃で2時間インキュベート℃、

注：乾燥したピクリン酸は爆発的かもしれません。それをしっかり閉めて容器内の水で湿らせておいてください。乾燥した換気の良い場所に保管してください。

5. 井戸から固定を外して、0.1 Mリン酸緩衝液に試料3回（各20分）を洗う。
6. の0.1Mマレイン酸緩衝液（pH6.0）中1％タンニン酸（w / v）の中で40分間インキュベートする。
7. （20分ごと）マレイン酸バッファーで二回すすぎ。
8. 暗闇の中でマレイン酸緩衝液中の1％酢酸ウラニル（w / v）の中で40分間インキュベートする。酢酸ウラニルは、光に敏感であり、放射性である。溶解時にパラフィルムでビーカーをカバーし、4℃で暗所で使用されていないバッファを格納
9. （20分ごと）マレイン酸バッファーで二回すすぎ。
10. 0.5％の白金塩素で20分間インキュベートマレイン酸塩緩衝液中のIDE（w / v）である。
11. （20分ごと）マレイン酸バッファーで二回すすぎ。彼らはさらなる処理のための準備が整うまで4℃でサンプルを格納する。

2。脱水と埋め込み

プロピレンオキシドは、発ガン性がある。ドラフト内でそれを操作することで、蒸気を避けてください。水の痕跡が含まれていない絶対的な、100％純粋なエタノールを使用しています。脱水のために、異なる濃度を生成するために、この無水エタノールで希釈します。

2日目

1. 50％エタノールで5分間インキュベートした後、70％エタノールで5分間。
2. 70％エタノールで新たに調製した1％p-フェニレンジアミン（PPD）で15分間インキュベートする。
3. 70％エタノールで3回すすいでください。
4. 80％エタノールで5分間、その後95％エタノールで5分間インキュベートします。
5. 100％エタノール中で回各5分間インキュベートします。
6. スクリューキャップでガラスバイアルを準備し、それらを清潔にし、完全に乾燥していることを確認してください。ガラスバイアルにスライスを移し、単に、はっきりと各バイアルにラベルを付けます。
7. プロピレンオキサイド：1:1エタノールで5分間インキュベートする。
8. 100％プロピレンオキシドで二回各5分間インキュベートします。
9. プロピレンオキシドとの1:1混合物を作るために各バイアルに樹脂（EPON）を追加します。ゆっくり2時間混ぜる。埋に干渉する可能性がある泡を防ぐために、あまりにも厳格にバイアルを振らないでください。
10. プロピレンオキシド、および2時間ミックスと3:1混合物を作るために樹脂を追加します。
11. 100％の樹脂とインキュベートO / Nへの転送

3日目

12. 60℃で24時間ACLARプラスチックと治癒℃のストリップ間のサンドイッチサンプル

3。セクショニングとグリッドへの取り付け

4日目

1. 半薄い（0.5μm）でセクションをカットし、1％トルイジンブルー+のサンプルの正しい方向を決定するために、1％のホウ砂で染色。
2. 超薄切片（60 nm）をカットし、ニッケルグリッド、グリッドにつき1部にマウントします。

4。免疫組織化学

すべてのバッファと水は使用前にフィルタリングする必要があります。

5日目

1. 平らな面の上にきれいにパラフィルム片の上の1％Tween-20/phosphateバッファ（T / PB）、pH7.5での電圧降下（約50μl）を置きます。そっとエッジでクリーン鉗子でグリッドを拾うと、バッファ上に浮く、セクションダウン、そして室温で10分間インキュベートする。
2. 紙をフィルタリングするためにセクション側を上に配置することにより、グリッドから余分な液体を排出し、その後室温で15分間のT / PB中の50mMグリシンに浮く。

重要なステップ：避けるために過度の"キャリーオーバー" 1つのソリューション液滴からのインキュベーション中に次の解の、優しく、各ソリューションの変化との間の第1濾紙上にグ ​​リッドのエッジに触れることにより、余分な液体を排出します。また、EMの腕の間に閉じ込められた任意の溶液を除去優しく鉗子アーム間のろ紙のスライバーと吸い上げてグリッドを把持鉗子しばらくensuのセクションでは、完全に乾燥しない呼び出し音が鳴ります。

3. ろ紙でグリッドを乾燥し、次いで室温で30分間のT / PBの二次抗体の動物から2.5％BSAおよび2.5％の血清を含有する溶液をブロッキングに浮く。
4. 4℃でRTまたはO / Nで一次抗体（T / PB中）でインキュベート最適な時間と温度のインキュベーション、ならびに抗体濃度は、実験的に決定する必要があります。
5. グリッドをT / PBで3回（各2分）を洗浄します。
6. 室温で1時間二次抗体（10nmの金に結合された1時20分抗ウサギまたは抗マウス）でインキュベートする。
7. T / PBで3回（各2分）を洗浄します。
8. 5分間のT / PBの2％グルタルアルデヒドとPostfixの。
9. その後、T / PBとろ過された水で三回（2分毎に）で3回（2分ごと）洗う。
10. 10分間水中2％酢酸ウラニルでインキュベートする。

グリッドが染色されている間、placinによりCO ₂フリー室の準備ガラスシャーレの中心にパラフィルムのG​​Aピース。その後、空気中のCO _2を吸収するためにパラフィルムの周り皿中のNaOHの4-6ペレットを配置します。数分間、上部は閉じておいてください。パスツールピペットを使用し、素早くガラスシャーレにパラフィルムにレイノルズクエン酸鉛の少量の溶液を移す。チャンバー内に、CO ₂の再導入を最小限にするためにパスツールピペットを挿入するだけで十分な上部を開きます。

注：レイノルズクエン酸鉛溶液を作製するには、電子レンジで100mlの脱イオン水を沸騰させ、密閉容器に冷ます。ストッパーで50mlメスフラスコでは、ミックス1.33グラムの鉛硝酸、1分間激しく振盪することによって1.76グラムのクエン酸ナトリウム、ゆで水30ml。その後30分間断続的に振る。この濁った溶液に、1M水酸化ナトリウム8mlを追加し、徐々にフラスコを数回反転させる。溶液は透明になります。ゆでたワシントンで50mlの解決策をもたらすTER。密閉ソリューションを格納します。沈殿物が表示された場合は、破棄して新しいものを作る。

11. における3つの小さなビーカーは暖かく、新たに煮沸脱イオン水を準備します。第1のビーカーにグリッドを浸漬し、30秒間、周囲に優しくスワール、それをすることによって酢酸ウラニルを洗い落としてください。他の2つのビーカーに、この手順を繰り返します。
12. レイノルズクエン酸鉛の溶液の液滴にグリッドを配置するだけで十分なガラスのペトリ皿の上部を開きます。可能であれば、クエン酸鉛で呼吸を回避するために、沈殿物の形成を防止するためにこれをしている間、マスクを着用してください。 10分間インキュベートする。
13. グリッドを削除するだけで十分な上部を開きます。クエン酸鉛で吸入を避けること。暖かい、新たに煮沸した蒸留水で3ビーカーに順次浸漬してグリッドを3回洗浄します。ろ紙、セクションまで一枚のグリッドに乾かします。サンプルは現在、電子顕微鏡の準備ができています。

結果

図2Bは、CA1海馬錐体細胞の樹状突起棘における内因ン分子の分布の例を示しています。海馬のCA1領域（ 図2（a）に見られるように）を含む極薄（60nm）の組織とニッケルグリッドを1％で覆われていた後、抗とのインキュベーションの前に2.5％BSAおよび血清2.5％のブロックのT / PB、50mMグリシン、 -NG抗体。 T / PBで洗浄した後、グリッドを10 nmの金に結合した抗ウサギ二次抗体で覆われていた。最後に、グリッドはT / PBで洗浄し、2％酢酸ウラニルとコントラストを向上させる染色レイノルズクエン酸鉛に続く2％グルタルアルデヒドと前置きした。非対称シナプスを示す左側 、代表的な電子顕微鏡写真は、。シナプス後部コンパートメントの識別は電子密度の高い、PSD（矢頭）と明確に定義された原形質膜によって促進されること。 右 、各呉（矢印）と原形質膜との間の最短距離は全くなかった背骨の半径にrmalized。脊椎内ngの分子が（ただし、PSDでの）原形質膜に選択的局在を示す。このヒストグラムは、もともと、EMBOジャーナル

ディスカッション

このプロトコルでは、我々は、ラット海馬スライス培養における樹状突起棘を研究するために、脳や脊髄組織のためPhendおよびWeinberg法を採用しております。海馬CA3-CA1領域における樹状突起棘が神経機能の調節に重要な役割を果たすタンパク質の広大な様々なを含む繊細な構造になっています。提示された方法は合理的な標識効率及び脊椎内の特定の抗原の分布を特徴づけるための有用な良好な再現を可能にして、良好な超微細構造保全（図2A）を維持しながら、強化された抗原性を達成するためのバランスの取れたアプローチを提供します。ここでは、10nmの金コロイド標識した呉。次に、シナプス機能におけるその役割を理解する助けngの標識パターン（ 図^{2B）8 を}生成するために金を定量化した。

免疫金の定量分析方法^11月13日 、さまざまなで行うことができます。しかし、このような定量化の解釈は必ずしも簡単ではありません。ラベリン...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
60 x 15 mm ポリスチレン ペトリ皿	ファルコン	351007
使い捨てメス	EXELINT	29552
細胞培養インサート	ミリポア	PICM03050
10 nm ヤギ-抗ウサギ金	電子顕微鏡 科学	25108
抗ニューログラニン抗体	ミリポア	AB5620
100%ピクリン酸	電子顕微鏡科学	19550
96% パラホルムアルデヒド	Acros Organics	AC41678-0030
25% グルタルアルデヒド (EM グレード)	Sigma	G5882
酢酸ウラニル	電子顕微鏡科学	22400
p-フェニレンジアミン	Σ	P6001
塩化プラチナ (IV)	Sigma	379840
Tannic acid	Electron Microscopy Sciences	21710