個々の錐体細胞のハイフィデリティOptogenetic制御法インビボ

サマリー

遺伝学と光学系を組み合わせた神経科学のツールの最近の開発は、空間的および時間解像度の前例のないレベルの神経回路の活動を制御することができ、「光遺伝学」と呼ばれる。ここでは、前頭前皮質及びsubicular錐体ニューロンの遺伝的に定義されたサブセットのoptogenetic操作で、生体内の記録に統合するためのプロトコルを提供する。

要約

Optogenetic方法が種の幅広い行動の多様なセットの基礎となる神経回路の活動を解明するための強力なツールとして浮上している。微生物起源のOptogeneticツールは、行動関連のタイムスケール上で（ 例えば 、チャネルロドプシン2、ChR2を）または沈黙（ 例えば 、ハロロドプシン、NpHR）神経活動ingenetically定義セル型を活性化することができる感光性膜タンパク質で構成されています。まず、背側海馬台とラットの前頭前野の縁前方の領域へのChR2およびNpHR導入遺伝子のアデノ随伴ウイルス媒介送達のための簡単な方法を示しています。 ChR2をとNpHRが遺伝的に標的化可能であるため、我々は神経細胞の特定の集団高い時間精度で異質な組織に埋め込 ​​まれて（ つまり 、錐体ニューロン）の電気的活動を制御するには、この技術の使用を記載している。我々は、ここにカスタムソフトウェアをハードウェアについて説明しますユーザー·インターフェース、およびin vivoでの準備、麻酔中の形質導入錐体細胞からの同時光配送および電気的記録を可能に手続き。これらの光応答ツールは、情報処理や行動への異なる細胞型の寄与原因を特定するための機会を提供する。

概要

一時的に正確な方法で神経回路内の特定の細胞型を有効にするか沈黙させる能力は、神経回路が感情と認知の基礎となる様々なタイプの情報を処理する方法を理解するために重要です。そのまま神経活動上の実験制御が用意されていませんloss-/gain-of-functionツール（ 例えば 、電気刺激、薬理学的調節、病変）を採用したか、時間的または空間的な規模で、神経細胞の特定の集団を制御するために、選択的に必要。直接これらの技術的な課題に対応する、遺伝的にコード化可能感光性ツールの開発とアプリケーションは、明確に定義された行動のイベント中に選択した細胞型の電気的活動を制御する神経科学者を可能にしました。これらの感光性タンパク質の多くはhalorhodop、光依存性カチオンチャネル、チャネルロドプシン2（ChR2を^）1、および光駆動塩化ポンプで、微生物由来のものである広く使用されている罪^{（NpHR）2,3、。}

光遺伝学の主要な利点は、不均一な脳領域および技術における遺伝的に標的特異的細胞集団への能力は、正常モデル生物（ヒト以外の霊長類の無脊椎動物^）4-6の数に適用されている。多くのoptogeneticトランスジェニック動物は、しかしトランスジェニック系統を確立することは、労働集約的でコスト法外ことができ、生成され^、7,8、市販されているされています。ここでは、組換えアデノ随伴ウイルス（AAV）ベクターを用いてラットの縁前方の皮質と背側海馬台におけるCaMKIIαプロモーター下にChR2およびNpHR遺伝子の、ウイルス媒介性送達するためのプロトコルを記述します。前脳内では、CaMKIIα式はグルタミン酸作動錐体ニューロン⁹に排他的である。 AAVは、一般的に、その相対的な生産および病原性の欠如のしやすさだけでなく、基礎研究のために使用される強力かつpersiこれらのベクター¹⁰で達成されたステントの導入遺伝子の発現。さらに私たちは、麻酔をかけた頭を固定したラットの同時光伝達と記録するための手順やハードウェアの概要を説明します。

プロトコル

1。ウイルス保管と準備

1. げっ歯類の脳にオプシン遺伝子を送達するための複製不能AAVベクターの使用は、生物学的安全性レベル1（BSL-1）のために承認され、米国政府の出版物に記載された正しい保護と取り扱い手順を必要とし、微生物学および生物医学研究所でバイオセーフティさ、で入手（AT疾病管理のウェブサイトのためのセンターhttp://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/index.htm ）。
2. -80°Cの冷凍庫内でクラスIIバイオセーフティーキャビネットおよびストア内の小さな作業アリコートに、製造業者のバイアルから凍結融解の繰り返し、ピペットウイルスを回避するためである。
3. 定位注射の前に、分量を氷上で解凍した後、簡単にベンチトップ遠心機でスピンダウンできる。
4. ゆっくりシリコーン又は鉱油少量のハミルトンガラスシリンジと針を埋め戻す。目に見える気泡がシリンジバレルに存在しないことを確認してください。マイクロインジェクターポンプ内に注射器を挿入し、垂直定位アーム（ すなわち定位マニピュレータ）に直接ポンプを取り付けます。
5. 針の先端がウイルスアリコートチューブの底に触れるまで定位腕を下げます。ウイルスの所望の容量（1μL注入用の1.5μl）を撤回する微量注入ポンプ用のコントローラを使用してください。
6. ウイルスと接触するすべての材料および表面は、塩素系漂白剤（10％）などの消毒剤で除染する必要があります。

2。手術やウイルス注入

1. カクテル、キシラジン（10 mg / kgを、IPラット） - ;ケタミン（125 mg / kgを、IPラット）で動物を麻酔。麻酔の有効性を評価するために、つま先のピンチに反射反応をチェックし、必要に応じてケタミンの追加投与を与える。標準無菌手術法を使用して、定位固定装置（デビッドKopfのINに動物を配置トゥルメント）。
2. 小さな外​​科的ハサミやメスで動物の頭蓋骨の上に皮膚を通って正中切開を行います。優しく結合組織を分離し、小さな骨のスクレーパーで頭蓋骨の上部を清掃してください。
3. 動物の頭がレベルブレグマとラムダのためのz座標が等しいようなものであることを確認します。このような定位座標定位座標 （キース·B·J·フランクリンやジョージPaxinos、アカデミックプレス中 （ジョージPaxinosとチャールズ·ワトソン、アカデミック·プレス、2007）またはマウス脳におけるラット脳脳アトラスから、対象の脳領域の定位座標を決定、2007）。外科ペンで注射の意図された部位をマーク。
4. 慎重に薄い手持ちドリルを用いて標的領域の上の頭蓋骨およびドリルビットは、頭蓋骨の底部に到達すると停止する。極細ピンセットを使用して、硬膜を露出させるために薄くなった骨を除去。
5. ターゲット上に注射針を配置しているそれは硬膜に触れ、z座標の計算にこのポイントを使用するまで、針を下ろします。適切なz位置に到達するまで非常にゆっくりと脳に注射針を下げる。このプロトコルでは、内側前頭前皮質の縁前方の領域または背側海馬台ブレグマ（-6.0ミリメートル前方（ブレグマ2.7ミリメートルの前方には、正中線、および硬膜から-2.2ミリメートル、横0.5ミリメートル、±）、横3.0ミリメートルは±正中線、および硬膜から-2.0ミリメートル）に、成人のSprague Dawley雄ラット（約275グラム）で対象としています。
6. 0.1μL/分の速度でウイルスを注入する。注入が完了した後、脳の表面へのウイルスの逆流を避けるために針を引き抜く前に10分待つ。
7. 肌を密封し、傷口に抗生物質を適用するために取り付けられた針で縫い縫合糸を使用してください。
8. AAVベクターからのChR2およびNpHR機能発現の時間経過は、実験計画やウイルス力価に応じて異なります。この実験のために、 インビボ 記録は18〜21日後に注入を実施した。

3。光配送およびChR2をまたはNpHR発現ニューロンのin vivoでの記録では

1. スーパー接着剤を用いてガラスキャピラリーチューブ（フィッシャー·サイエンティフィック）にタングステン電極（〜1〜1.5MΩ、マイクロプローブ）を取り付けます。
2. エタノールでマルチモード光ファイバの裸の終わり（直径200μmコア、ソーラボ）とクリーンファイバーの先端を露出させ、ファイバストリッパ（ソーラボ）を使用します。非常に軽く、くさび形のダイヤモンドナイフ（ソーラボ）でファイバ先端を獲得し、慎重に過剰繊維（細いピンセットで）を削除する。繊維はスコアを簡単に切断する必要があります。
3. 200 mWの単一のダイオードレーザー（の出力ポート上のPCのコネクタに、ファイバのFc端を接続www.Lumiphy.com所望の波長を持つ）。レーザーで作業するときに、適切な保護メガネを常に着用していることを確認します。
4. Lを測定光パワーメータ（用いた光ファイバの先端のASER強度をwww.Lumiphy.com ）。 in vivoでの記録のために、20〜100ミリワット/ ^平方ミリメートルほど小さな光強度が確実に神経活動のそれぞれにChR2またはNpHR媒介活性化やサイレンを呼び起こすことができます。
5. キャピラリーチューブに光ファイバを挿入します。約500ミクロンのタングステン電極の先端の上にファイバ先端を置き、電極と繊維がまっすぐになるように先端付近のいくつかのポイントで2回細い縫合糸を結ぶ。電極の先端と最も近い結び目の間の距離は、対象領域への挿入のために十分な長さであることを確認してください。
6. ステップ2.1および上記の2.2のような動物を準備します。オプトロード（位置決めするための頭蓋骨に新しいクリーン小さな窓を作るためのガイドとして、最初の開頭術を使用www.Lumiphy.comを ）。 D上の小さな切開を作る細い針を使用してURA。
7. 慎重にマイクロマニピュレーター（ナリシゲ）を使用して形質導入した領域に頭蓋骨の窓から、脳にオプトロードを下げる。その後、光応答性細胞の出現まで、10から50ミクロンのステップでゆっくりとオプトロードを進める。
8. カスタム·ソフトウェア·ユーザー·インターフェース（NeuroLuxプロwww.Lumiphy.comのLabVIEW（ナショナルインスツルメンツ）で書かれた）は、単一のダイオードレーザを制御し、継続的な神経活動を可視化し、記録するために使用される。記録された信号をろ過ExAmp-20K（Kation科学）アンプ、バンドパス（0.3から8 kHzの）、およびデジタルボード（のNI USB-6009）ナショナルインスツルメンツのアナログで撮影している。 NeuroLux Proユーザー·インタフェースは、アナログ入力（神経細胞およびTTL信号用の2つのチャネルを選択します）とデジタル出力を選択することができます。ユーザは、サンプリングレート（20kHz）の、ベースライン期間（プリ発光）、およびポスト光期間を定義することができる。ユーザーは、TTLレーザーを定義することができstimulatiパルス幅、周波数、および刺激期間（周波数は20 Hzおよび刺激期間は500ミリ秒である場合には、定義されたパルス幅のレーザパルス10が供給される）上に。また、ユーザは、連続光の配信（ 例えば 、 図1）を選択することができます。繰り返し記録のために、ユーザは、パルス列の数と列の間の間隔を定義することができる。データは、またはディスクに記録せずに取得することができます。
9. 記録後、動物をケタミン/キシラジンのカクテルで麻酔し、経オプトロードの配置およびオプシンの発現を確認するために、生理食塩水とパラホルムアルデヒド（4％）で灌流した。

結果

図1は、神経活動の同時記録に用いられる光パルスパラメータ（ すなわち、パルス周波数、パルス幅、刺激期間）を制御するカスタマイズされたソフトウェアLabVIEW環境で開発され（プロNeuroLux）（ナショナルインスツルメンツ）のスクリーンショットを示す。ソフトウェアプログラムは、単一のダイオードレーザを制御するためのTTLパルスを生成するデジタル取得装置に指令信号を送信する。さらに、ソフトウェアプログラムが表示され、保存する記録し、神経活動や配信TTL信号。これらの信号は、定義されたサンプリング·レート（ 例えば 、20 kHzの）で取得装置によってデジタル化される。記録された信号は、バイナリファイル内の2次元倍精度配列として保存されます。

図2は、光ファイバに接続されたタングステン電極で構成されるカスタムオプトロードを示しています。光ファイバは3で細い縫合糸を使用し、電極に固定されているポイント。必要に応じて、スーパー接着剤は、それらを接着するために使用することができる。しかし、電極は光ファイバを通る光透過率は、繰り返しの使用で劣化しますし、脳内にあらゆる挿入で切断し、洗浄または交換する必要があり、何回か再利用することができるがあるため、電極に光ファイバを固定永久に避ける。

実際にChR2およびNpHR式を示す強化黄色蛍光タンパク質の図3を示して蛍光画像の左パネル、。これらの写真は、ラット背側海馬台（ 図3A）と縁前方の皮質においてChR2を発現（ 図3B）の代表NpHR発現を示す。ウイルス発現（ 例えば 、いくつかの蛍光が歯状回（左図3A）で観察された）背側海馬台と縁前方の皮質に主に限定されていた。電極（細いトラック、矢じり）と光ファイバ（太いトラック、矢印）のトラックもまた観察された。

図4のS = "jove_content">左側のパネルには、ChR2をラット縁前方の皮質で、時間的に正確なスパイクを誘導したことを示している。 図4（a）は 、ラットの縁前方のに対して10ミリ青色光パルスの20 Hzの配信を受けてChR2をトリガ型活動電位のトレース例である皮質。ラスタープロット（ 図4B）は、6つの代表的神経細胞におけるChR2を誘導活性化を示している。記録されたすべてのニューロンは完璧な忠実度で光誘発スパイクを示した。 ChR2を、NpHRとは対照的に、迅速かつ可逆的にラットの縁前方の皮質（ 図4の右パネル）の生体内で自発的な活動を沈黙。 図4Cは、下にNpHRを表現縁前方の皮質の連続532 nmの照明（10秒）ことを示す一例トレースですCaMKllαプロモーターは、生体内で自発的な単一ユニット活動を排除します。縁前方の錐体細胞活性の完全なサイレンがタイムロック10秒連続光の配信であることに注意してください。低いERラスタプロット（ 図4D）6代表ニューロンにおけるNpHR誘導サイレンシングを示しています。両方のin vivoでの記録は、微生物のオプシン遺伝子のAAV媒介性送達は18〜21日前までに発生した大人のSDラットから得られたものの典型的なものである。

図5は、ラット縁前方の錐体ニューロンの反復ChR2を刺激した結果を示している。青色の光パルス（10ミリ秒）を5秒（100パルスの合計）が20 Hzで配信されました。光誘発スパイクの電圧トレースを繰り返し（61回繰り返し合計）2時間の記録セッション中に2分毎に取得した。この反復刺激プロトコルを使用した場合であっても、ChR2を光送達に応答して安定的かつ強固なスパイクを誘発した。

図6と図7は、NpHR誘発の光阻害とラットsubicularニューロン活動のChR2を主導型の光活性化の結果を示す。縁前方の皮質の場合のように、NpHRおよびChR2ををすることができました光誘起時間ロック阻害および再現性オプシン形質導入subicularニューロンの活性化を媒介する。

図1。同時光配送および電気生理学的記録のためのNeuroLux Proソフトウェア·インターフェースのスクリーンショット 。写真のトレースは連続532 nmの光配信の10秒に対応してラット縁前方の錐体細胞の自発活動のNpHR誘導サイレンシングを示しています。 大きな画像を見るにはここをクリックしてください 。

図2。カスタムオプトロードのハイパワーイメージ 。光ファイバは、ガラス毛細管タングステン電極に取り付けられ、縫合糸を用いて電極に固定に挿入される。 betw中心間距離EEN電極先端とファイバーの先端は約500μmである。

図3。ウイルス発現およびオプトロードの配置 。 （左）写真は、代表背側海馬台におけるNpHR式（A）と縁前方の皮質（B）中のChR2の発現を示す。各写真が撮影された場所を表す（右）図。各写真に写っている矢印と矢印は、タングステン電極の位置と光ファイバを示し、それぞれ。サブ：海馬台、DG：歯状回、PL：縁前方の皮質大きな画像を見るにはここをクリックしてください 。

図4。にChR2またはNpHR形質導入されたラットprelimbからのin vivo電気生理学的記録IC皮質。 （A）青（473 nm）の光パルス（10ミリ秒、青いバー）の20 Hzの配信を受けてChR2をトリガ型活動電位の例跡。 （B）6代表ニューロンにおいてChR2を誘発されるスパイクを示すラスタープロット。各単位は、活性点としてプロットされる。 （C）連続緑色（532 nm）の光照射（10秒、緑色のバー）の間の自発的な活動のNpHR誘発の抑制の例跡。 （D）6代表ニューロンにおけるNpHR誘導サイレンシングを示すラスタープロット。各ユニットの活動は、ドットとしてプロットされている。 大きな画像を見るにはここをクリックしてください 。

図5。 in vivoでのラットの縁前方の錐体ニューロンの繰り返し20 HzのChR2を主導型のスパイク 。光誘発スパイクの（A）の電圧トレース録音の開始後の時点0、30、60、90、120分で取得した。 （B）全61回の繰り返し（2分試行間の間隔、120分計）光誘起活性化を示すラスタープロット。各ユニットの活動は、ドットとしてプロットされている。 大きな画像を見るにはここをクリックしてください 。

図6。NpHRを形質導入したラット背側海馬台からのin vivo電気生理学的記録 。 （A）NpHRを表現する背側海馬台の10秒連続532 nmの照明（緑のバー）が自発的活動を排除することを示す例トレース。 （B）上記のトレースから記録された2つのユニットの平均波形。振幅閾値は、2つの別個のニューロンを同定するために使用した。 （C）5の繰り返しを示すラスタープロットこれらのユニットのNpHR誘導サイレンシングのS。各単位は、活性点としてプロットされる。

図7。 in vivoでのラット後subicularニューロンの繰り返し20 HzのCR2駆動型スパイク 。光誘発スパイクの（A）の電圧トレースは、時点0、30、60、90、録画の開始後120分で取得しました。挿入図：このセルの典型的なバースト活動。 （B）全61回の繰り返し（2分試行間の間隔、120分計）光誘起活性化を示すラスタープロット。各ユニットの活動は、ドットとしてプロットされている。 大きな画像を見るにはここをクリックしてください 。

ディスカッション

技術の広い配列は、げっ歯類での個別の脳領域に微生物オプシンの遺伝子を遺伝的に標的とするための利用可能です。ウイルス遺伝子送達は、細胞型特異性でのChR2およびNpHR表現を仲介するため、比較的安価で迅速なアプローチを提供します。 AAVベクター系は、貯蔵中に安定なままで高い生産力価、病原性の欠如、および長期的な遺伝子発現^10を産生するその能力にoptogenetic実験に使用するための共通の選択である。細胞型特異的プロモーターとオプシン構築物の多くは、ペンシルバニア大学（などのベクター中核施設からのAAV血清型の様々な商業的に入手可能であるhttp://www.med.upenn.edu/gtp/vectorcore ）または大学チャペルヒル校、ノースカロライナ（ http://genetherapy.unc.edu ）。 AAV技術の欠点の1つである細胞特異的ターゲッティングのために使用することができる導入遺伝子カセットのサイズに制限を置く限られたパッケージング能力（〜4.7キロバイト）。代替として、より大きなパッケージング能力を有するレンチウイルスベクターは、より大きなプロモーター配列の制御下に標的化オプシンを収容することができる。

オプトロードの使用は、時間的に正確な光の送達と組み合わせて、電気生理学的信号の確実な検出を可能にする。しかしながら、上述したように、十分な注意は、その構築に必要とされる。切断された光ファイバは壊れやすいので、きつく縫合糸を接続すると、繊維が破損する恐れがあります。送られる光の電極と品質のインピーダンスが低下しますので、オプトロードは、複数の記録に使用することができるにもかかわらず、電極および光ファイバを挿入する前に洗浄（または手動で光ファイバ裸の終了などの場合切断される）する必要があります繰り返し使用した。

エレメントの間にctrophysiologicalレコーディングにはオプトロードをゆっくり前進することが重要です。 （：125ミクロン、光ファイバのコア：タングステン電極を200μm）、ここで使用されるオプトロードは、約350ミクロンの厚さを有しており、すぐにそれを低下させることが脳組織の動きにつながる可能性があります。光誘起アーティファクトは、特定の記録と光配信のセットアップ^11月12日であると考えている可能性があります。我々は我々の実験条件では光によって誘発されるアーティファクトを発見したが、形質導入脳領域外の録音は、潜在的に光のアーティファクトのコントロールとして使用することができます。記録プロセス中の別の考慮事項は、特に長い持続時間記録のために、またはChR2をNpHR発現ニューロンの変化を観察するために必要な光強度である。強力なレーザー強度と長いレーザー照射は組織損傷および/ ​​または^12月13日以降のお届け光に減少した応答をもたらす可能性があります。行動実験のためのコントロールウイルスベクターを使用することがeliminatinに必要ですグラムの繊維から配信熱による影響。市販のoptogenetic構築物の多くはオプシン遺伝子配列が除去された相補的な制御構造が存在する。

それは、ChR2を、特定の実験の質問^14〜15により適しているであろう他のサイレンオプシンと一緒に開発されており、改善された特性と動態変異体設計に留意すべきである。例えば、「ケタ」と呼ば標的突然変異誘発を介して確立新しいChR2を変異体は、元のChR2 ¹⁴のそれより上（少なくとも200ヘルツまで）の周波数で高音質の神経スパイクを駆動することができます。

in vivoでの光伝達および神経細胞応答の同時録画の組み合わせは、遺伝的に標的とする細胞集団とそれに対応する時間がロックされた行動のイベントでパターン化された活動との因果関係を確立する上で重要なステップです。手続きおよびHAここで概説rdwareはげっ歯類では、生体内のヘッド固定記録のために光遺伝学を実装するための簡単な方法を提供する。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
シリンジ	ハミルトン	7653-01	10 μl
取り外し可能な針	ハミルトン	7803-03	31 ゲージ、斜め先端
マイクロインジェクター ポンプ	ワールド プレシジョン インスツルメンツ	UMP3
ポンプ コントローラー	ワールド プレシジョン インスツルメンツ	SYS-MICRO4
シリコーン オイル	アルファ アエサル	A12728
レーザー保護メガネ	ケンテック	KMT-4501
マルチモード	光ファイバーThorlabs	BFL37-200	200 μm径コア、0.37 NA
ファイバーストリッピングツール	Thorlabs	T12S21	、200 μm径コアマルチモード
光ファイバーパワー	メーターLumiphy LLC	www.lumiphy.com
光検出器	ニューポート	818-SL/DB
青色レーザー(445-473 nm、100-200 mW)	Lumiphy LLC	www.lumiphy.com	200 μ に結合されています。FC / PCアダプター付きmマルチモードファイバー
グリーンレーザー(532 nm、100-200 mW)	Lumiphy LLC	www.lumiphy.com	a 200 μm マルチモードファイバー FC/PCアダプター付
タングステン/ファイバー Optrode	Lumiphy LLC	www.lumiphy.com	Lumitrode
ガラス 毛細管	フィッシャー・サイエンティフィック	22-362-566
油圧マイクロマニピュレーター	成茂	MO-22
アンプ	ケーチオン・サイエンティフィック	ExAmp-20K
データ取得デバイス	ナショナルインスツルメンツ	NI USB-6009
げっ歯類頭部拘束	Lumiphy LLC	www.lumiphy.com
小動物固定装置	David Kopf Instruments	Model 963