エキソソーム中の安定したマイクロRNA（miRNA）はの存在は、バイオマーカーとして、また治療的介入のためのルートとしての潜在的有用性のために、細胞間コミュニケーションの新たなモードとして莫大な利益を生成しました。ここでは、搬送中のmiRNAを識別するために、定量PCRに続いて、血液や文化メディアからエキソソーム浄化を示しています。
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この記事について
サマリー
要約
安定したmiRNAは、すべての体液中に存在し、いくつかの循環miRNAはエキソソームと呼ばれる小さな小胞に隔離による分解から保護されています。エキソソームは、標的細胞にRNAおよびタンパク質の転写をもたらす形質膜と融合することができる。彼らの生物学的機能は、免疫応答、抗原提示、および細胞内の通信が含まれています。血液を介した受容細胞における遺伝子発現を調節することができるmiRNAの配信では、ターゲットの介入のための新たな道を開いた。薬物またはRNA治療剤の送達のための戦略を提供するだけでなく、エキソソーム内容は、治療の選択肢と予後を決定する、診断に役立つことができるバイオマーカーとして役立つことができる。
ここでは、定量的に血液および細胞培養培地中に分泌されたエキソソームからのmiRNAとメッセンジャーRNA（mRNAの）を分析するための手順を説明する。精製エキソソームはEXOSためウェスタンブロット分析を用いて特徴づけされます関心のmRNAのためのOMALマーカーとPCR。透過電子顕微鏡（TEM）および免疫金標識は、エキソソーム形態と整合性を検証するために使用される。全RNAを、我々は同じサンプルからmRNAおよびmiRNAの両方を勉強できるようにするために、これらのエキソソームから精製されます。バイオアナライザによるRNAの完全性を検証した後、我々はタックマン低密度アレイ（本件契約）カードと関心の転写産物の遺伝子発現研究を使ってエキソソームのmiRNAを同定するために培地スループット定量的リアルタイムPCR（定量PCR）を行います。
これらのプロトコルは、薬理学的介入の前と後の患者、げっ歯類モデルおよび細胞培養培地中のエキソソームのmiRNAの変化を定量化するために使用することができる。エキソソーム内容が起源のソースと分泌するエキソソームその細胞の生理学的条件により変動する。これらの変化は、細胞とシステムがストレスや生理的な摂動に対処する方法についての洞察を提供することができます。当社の代表的なデータを示してVマウスの血液、ヒト血液およびヒト細胞培養培地から精製したエキソソームに存在するmiRNAでのariations。
ここでは、定量的に血液および細胞培養培地中に分泌されたエキソソームからのmiRNAとメッセンジャーRNA（mRNAの）を分析するための手順を説明する。精製エキソソームは、関心のあるmRNAのためのエキソソームマーカーおよびPCRのためのウェスタンブロット分析を用いて特徴付けられる。透過電子顕微鏡（TEM）および免疫金標識は、エキソソーム形態と整合性を検証するために使用される。全RNAを、我々は同じサンプルからmRNAおよびmiRNAの両方を勉強できるようにするために、これらのエキソソームから精製されます。バイオアナライザによるRNAの完全性を検証した後、我々はタックマン低密度アレイ（本件契約）カードと関心の転写産物の遺伝子発現研究を使ってエキソソームのmiRNAを同定するために培地スループット定量的リアルタイムPCR（定量PCR）を行います。
これらのプロトコルは、エキソソームのmiRNAの変化を定量化するために使用することができるiの薬理学的介入の前と後のn個の患者、げっ歯類モデル及び細胞培養培地。エキソソーム内容が起源のソースと分泌するエキソソームその細胞の生理学的条件により変動する。これらの変化は、細胞とシステムがストレスや生理的な摂動に対処する方法についての洞察を提供することができます。我々の代表的なデータは、マウスの血液、ヒト血液およびヒト細胞培養培地から精製エキソソーム中に存在するmiRNAの変化を示す
概要
短い非コードmiRNAは、標的mRNAに結合することによって遺伝子発現を調節する。 〜7塩基対の種子配列相補性は、標的タンパク質1の発現低下をもたらすことができ、どちらも翻訳の阻害またはmRNAの安定性の低下を生じる標的mRNAに結合したmiRNAを可能にする。過去10年間の研究では、明確に細胞機能を仲介におけるmiRNAのための基本的な役割を証明しています。また、様々な疾患2,3の根底に miRNAを媒介分子の変化を解剖に向けかなりの努力がなされている。さらに、体液4-6の安定したmiRNAの最近の識別は臨床診断に適した新規バイオマーカーとしての使用のために道を開いた。
体液におけるmiRNAトランスの一態様は、全身の血液circulat経由受容細胞にエキソソーム、mRNAを運ぶ小胞、タンパク質、脂質メディエーター、およびmiRNAを介して行われるイオン7月14日 。このレシピエント細胞における遺伝子発現の調節をもたらし、セルラー通信の新たなメカニズムを表す。例えば、細胞は、増殖因子-β5を（TGFβ5）変換、インターロイキン-1β（IL1β）、腫瘍壊死因子α（TNFα）などの炎症に関与する生体分子を含有する分泌および/または吸収するエキソソームによって免疫調節過程を調節することができると13これらの遺伝子を調節するmiRNA。異常なmiRNA....
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プロトコル
人間とげっ歯類からの血液サンプルを使用してすべての実験は、関連するすべてのガイドライン、規制、規制機関に準拠して実行された。ヒト被験者は医薬品治験審査委員会のドレクセル大学が承認したインフォームドコンセントを与えた後、在籍していたし、動物を使用して行う研究のためのすべての手続きは、ドレクセルのインスティテューショナルアニマルケアと使用委員会によって承認された。
1。血液からエキソソーム精製（〜5.5時間）
TIPS
- 我々はmirVanaのmiRNAの単離キットから300μlのRNA溶解緩衝液中の血液の1チューブ（〜10ミリリットルヒト血液と〜2 mlのマウス血液）からエキソソームを再懸濁します。
- 細胞培養培地からエキソソームを精製するために、メディアは、細胞を除去し、また、12,000×gで遠心分離した後、0.22μmフィルターを通してろ過する10分間500 xgで回転させた。細胞培養培地からエキソソーム浄化PBSで希釈、PBS洗浄又は第二超遠心ステップを必要としません。
- 精製エキソソームは、超遠心分離工程後のショ糖勾配遠心分離工程を追加して、プロテオミクス研究に使用する場合、タンパク質凝集体および汚染物質15の量が減....
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結果
血液や細胞培養培地からエキソソームを分離した後、エキソソームの純度は、電子顕微鏡（EM）とウェスタンブロット（ 図1Aおよび1B）によってテストすることができます。私たちは、EMと複数の抗体を用いてウェスタンブロットで、さまざまなソースからの私達のエキソソームの準備を確認した。 図1Aは、エキソソームは〜の直径30〜100ナノメートルで完全であり、免疫金標識によってCD81が含まれていることを確認するEM画像を示す。一般的に使用されるエキソソームマーカーはCD63、CD81とCD9 14のHsp70とtetraspannin家族の糖タンパク質である。精製エキソソームの整合性を確認した後、我々は、図1BにHsp70のためにウェスタンブロットを行い、メディア単独（陰性コントロール）されていませんがエキソソームはHsp70を含んでいることを示した。バイオアナライザのトレースは、RAW細胞培養培地から分離エキソソームは、RNAのさまざまなが含まれていますが、全体からのRNAで典型的なもので.......
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ディスカッション
このプロトコルでは、我々は、血液や文化メディアからの差動遠心分離により精製エキソソームからのmiRNAとmRNAの定量化を示しています。エキソソームは、その起源に依存して様々な構成要素を有し、免疫応答、抗原提示細胞内通信、RNAおよびタンパク質9,11,12,19,20の伝達を含む生物学的機能の数に関与している。大きさや形状はエキソソーム純度の行列ですが、EMのエキソソームのデータを示した論文数は、これらの小胞は、それらが固定に使用される方法と同様に分泌されるソースおよびイメージング9に基づいて大きさと形態に及ぶことができることを示している、15。 30-100ナノメートルのエキソソームのための受け入れサイズは、ソース21,22、複数の方法がエキソソーム純度を検証するために使用されている一つの理由に応じて大径のエキソソームの小さな人口を含む平均範囲です。分泌miRNAは多くの必要なフィーチャーしを持って様々な疾患2,3,24のための潜在的な治療標的であることに加えて23の良いバイオマーカーのES。この精製法.......
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開示事項
著者らは、開示することは何もありません。
謝辞
本研究では、リタ·アレン財団助成金からシーナアジットへの資金によってサポートされていました。著者は、楽器の使用、科学的、技術的支援のためのサウスカロライナ州電子顕微鏡センターの大学からエリカバログ博士Soumitra Ghoshroyを確認したいと思います。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| EDTAコーティングバキュテイナー(10mlチューブ) | BD診断 | 366643 | ヒト血液からのエキソソーム精製用 |
| EDTAコーティングバキュテイナー(2mlチューブ) | BD診断 | 367841 | エキソソーム精製用 |
| BD診断 | 762165 | 全血 | |
| miRVanaマイクロRNA単離キット | Ambion | AM1561 | |
| 酸-フェノール: CHCl3 | Ambion | 9721G | |
| DNase 1 | Qiagen | 79254 | |
| TaqMan Universal PCR Master Mix, No AmpErase UNG | Applied Biosystems | 4326614 | TLDA カード用 |
| Megaplex RT げっ歯類プールセット v3.0 | Applied Biosystems | 4444746 | |
| Megaplex プリアンプげっ歯類 プールセット v3.0 | Applied Biosystems | ||
| Taqman Array Rodent MicroRNA A+B set V3.0 | Applied Biosystems | 4444909 | |
| Megaplex RT Human Pool set V3.0 | Applied Biosystems | 4444745 | |
| Megaplex Preamp Human Pool set v3.0 | Applied Biosystems | 4444748 | |
| Taqman Array Human MicroRNA A+B Cards Set v3.0 | Applied Biosystems | 4444913 | |
| TaqmanMicroRNA RTキット | Applied Biosystems | 4366596 | |
| Taqman fast universal PCR master mix | Applied Biosystems | 4366072 | For mRNA qRT-PCR |
| 腫瘍壊死因子(プライマープローブ) | Applied Biosystems | Hs01113624_g1 | |
| 血管内皮増殖因子A(プライマープローブ) | Applied Biosystems | Hs00900055_m1 | |
| Maxima First Strand cDNART-qPCR用合成キット | Thermo Scientific | K1642 | mRNA |
| HSP70抗体 | Abcam | ab94368 | ウェスタンブロット用 |
| 抗ウサギIgG-ゴールド | Sigma | G7402 | 電子顕微鏡用 |
| ウサギ-抗CD81 | Sigma | SAB3500454 | |
| ニッケル 300メッシュ カーボンフォームバーグリッド | 電子顕微鏡科学 | FCF300-Ni | |
| 銅300メッシュカーボンフォームバーグリッド電子 | 顕微鏡科学 | FCF300-Cu | |
| 表1.特定の試薬の表。 |
参考文献
- Bartel, D. P. MicroRNAs: target recognition and regulatory functions. Cell. 136, 215-233 (2009).
- Mendell, J. T., Olson, E. N. MicroRNAs in stress signaling and human disease. Cell. 148, 1172-1187 (2012).
- Esteller, M.
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