エキソソーム中の安定したマイクロRNA（miRNA）はの存在は、バイオマーカーとして、また治療的介入のためのルートとしての潜在的有用性のために、細胞間コミュニケーションの新たなモードとして莫大な利益を生成しました。ここでは、搬送中のmiRNAを識別するために、定量PCRに続いて、血液や文化メディアからエキソソーム浄化を示しています。
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この記事について
サマリー
要約
安定したmiRNAは、すべての体液中に存在し、いくつかの循環miRNAはエキソソームと呼ばれる小さな小胞に隔離による分解から保護されています。エキソソームは、標的細胞にRNAおよびタンパク質の転写をもたらす形質膜と融合することができる。彼らの生物学的機能は、免疫応答、抗原提示、および細胞内の通信が含まれています。血液を介した受容細胞における遺伝子発現を調節することができるmiRNAの配信では、ターゲットの介入のための新たな道を開いた。薬物またはRNA治療剤の送達のための戦略を提供するだけでなく、エキソソーム内容は、治療の選択肢と予後を決定する、診断に役立つことができるバイオマーカーとして役立つことができる。
ここでは、定量的に血液および細胞培養培地中に分泌されたエキソソームからのmiRNAとメッセンジャーRNA（mRNAの）を分析するための手順を説明する。精製エキソソームはEXOSためウェスタンブロット分析を用いて特徴づけされます関心のmRNAのためのOMALマーカーとPCR。透過電子顕微鏡（TEM）および免疫金標識は、エキソソーム形態と整合性を検証するために使用される。全RNAを、我々は同じサンプルからmRNAおよびmiRNAの両方を勉強できるようにするために、これらのエキソソームから精製されます。バイオアナライザによるRNAの完全性を検証した後、我々はタックマン低密度アレイ（本件契約）カードと関心の転写産物の遺伝子発現研究を使ってエキソソームのmiRNAを同定するために培地スループット定量的リアルタイムPCR（定量PCR）を行います。
これらのプロトコルは、薬理学的介入の前と後の患者、げっ歯類モデルおよび細胞培養培地中のエキソソームのmiRNAの変化を定量化するために使用することができる。エキソソーム内容が起源のソースと分泌するエキソソームその細胞の生理学的条件により変動する。これらの変化は、細胞とシステムがストレスや生理的な摂動に対処する方法についての洞察を提供することができます。当社の代表的なデータを示してVマウスの血液、ヒト血液およびヒト細胞培養培地から精製したエキソソームに存在するmiRNAでのariations。
ここでは、定量的に血液および細胞培養培地中に分泌されたエキソソームからのmiRNAとメッセンジャーRNA（mRNAの）を分析するための手順を説明する。精製エキソソームは、関心のあるmRNAのためのエキソソームマーカーおよびPCRのためのウェスタンブロット分析を用いて特徴付けられる。透過電子顕微鏡（TEM）および免疫金標識は、エキソソーム形態と整合性を検証するために使用される。全RNAを、我々は同じサンプルからmRNAおよびmiRNAの両方を勉強できるようにするために、これらのエキソソームから精製されます。バイオアナライザによるRNAの完全性を検証した後、我々はタックマン低密度アレイ（本件契約）カードと関心の転写産物の遺伝子発現研究を使ってエキソソームのmiRNAを同定するために培地スループット定量的リアルタイムPCR（定量PCR）を行います。
これらのプロトコルは、エキソソームのmiRNAの変化を定量化するために使用することができるiの薬理学的介入の前と後のn個の患者、げっ歯類モデル及び細胞培養培地。エキソソーム内容が起源のソースと分泌するエキソソームその細胞の生理学的条件により変動する。これらの変化は、細胞とシステムがストレスや生理的な摂動に対処する方法についての洞察を提供することができます。我々の代表的なデータは、マウスの血液、ヒト血液およびヒト細胞培養培地から精製エキソソーム中に存在するmiRNAの変化を示す
概要
短い非コードmiRNAは、標的mRNAに結合することによって遺伝子発現を調節する。 〜7塩基対の種子配列相補性は、標的タンパク質1の発現低下をもたらすことができ、どちらも翻訳の阻害またはmRNAの安定性の低下を生じる標的mRNAに結合したmiRNAを可能にする。過去10年間の研究では、明確に細胞機能を仲介におけるmiRNAのための基本的な役割を証明しています。また、様々な疾患2,3の根底に miRNAを媒介分子の変化を解剖に向けかなりの努力がなされている。さらに、体液4-6の安定したmiRNAの最近の識別は臨床診断に適した新規バイオマーカーとしての使用のために道を開いた。
体液におけるmiRNAトランスの一態様は、全身の血液circulat経由受容細胞にエキソソーム、mRNAを運ぶ小胞、タンパク質、脂質メディエーター、およびmiRNAを介して行われるイオン7月14日 。このレシピエント細胞における遺伝子発現の調節をもたらし、セルラー通信の新たなメカニズムを表す。例えば、細胞は、増殖因子-β5を（TGFβ5）変換、インターロイキン-1β（IL1β）、腫瘍壊死因子α（TNFα）などの炎症に関与する生体分子を含有する分泌および/または吸収するエキソソームによって免疫調節過程を調節することができると13これらの遺伝子を調節するmiRNA。異常なmiRNA発現は、ヒトの疾患の様々な共通の特徴であるように、これらの分子は、新規治療標的2の発見と検証のためのエキサイティングな新しい機会を提供しています。
循環miRNAは、すべての体液中に存在し、それはエキソソームの組成物は、それらが解放された元のソースセルに基づいて異なることが知られている。こうして彼らは、細胞の生理学的状態を研究するための道を提供し、どのように細胞があってもシグナリングALTER疾患を含むストレスに対する応答のTS。エキソソーム組成物中の変化を研究することは、シグナル伝達への洞察を提供し、バイオマーカーや治療的介入路線としての潜在的有用性を調べることができます。
ここでは、公開プロトコルに基づいて、複数のソースからのエキソソームの精製のデモンストレーションを行います。これらのエキソソームは、RNA単離のために使用されるエキソソーム中に存在するmiRNAのレベルを識別し、測定するために定量PCRを行った。
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プロトコル
人間とげっ歯類からの血液サンプルを使用してすべての実験は、関連するすべてのガイドライン、規制、規制機関に準拠して実行された。ヒト被験者は医薬品治験審査委員会のドレクセル大学が承認したインフォームドコンセントを与えた後、在籍していたし、動物を使用して行う研究のためのすべての手続きは、ドレクセルのインスティテューショナルアニマルケアと使用委員会によって承認された。
1。血液からエキソソーム精製（〜5.5時間）
TIPS
- 我々はmirVanaのmiRNAの単離キットから300μlのRNA溶解緩衝液中の血液の1チューブ（〜10ミリリットルヒト血液と〜2 mlのマウス血液）からエキソソームを再懸濁します。
- 細胞培養培地からエキソソームを精製するために、メディアは、細胞を除去し、また、12,000×gで遠心分離した後、0.22μmフィルターを通してろ過する10分間500 xgで回転させた。細胞培養培地からエキソソーム浄化PBSで希釈、PBS洗浄又は第二超遠心ステップを必要としません。
- 精製エキソソームは、超遠心分離工程後のショ糖勾配遠心分離工程を追加して、プロテオミクス研究に使用する場合、タンパク質凝集体および汚染物質15の量が減少する。
- エキソソームの観察された形態は、ソースとTEMのための処理手順の両方に応じて異なる場合があります。私たちは以前にサンプル処理9,15の違いに起因しているエキソソーム用カップ形状の形態を観察しなかった。免疫金標識を含む当社のTEM像は、血液、エキソソーム9,16,17派生胆と皮質の文化など、さまざまなソースからの以前の報告と類似しています。
- 10-60分間室温で直立5xおよび場所の血を含むEDTAコーティングされたチューブを反転。
- 4℃で15分間、2,000×gで遠心
- を15mlチューブに最上層、プラズマを収集し、氷の上に保つ。
- PBS等量の液体を希釈する。 4で2,000×gで30分間遠心℃に
- 4℃で、チューブを遠心24ミリリットルの合計ボリュームに対して1X PBSを追加し、12,000×gで45分間遠心分離する転送
- 4℃でチューブを超遠心機にかけると11万xgで2時間を遠心への転送
- 再懸PBSでペレットとは、4℃で10万xgで1時間遠心分離
- 適当な緩衝液に再懸濁したペレット（RNA溶解バッファー）。
- それぞれ電子顕微鏡およびウェスタンブロット分析のために、PBSまたはRIPA緩衝液中に再懸濁する。
2。修正mirVanaのmiRNAのアイソレーションキット（〜1時間）を使用してRNA精製
TIPS
- 、（PPE）個人用保護具を着用してのRNaseザップと表面やピペットを拭くし、滅菌フィルターのヒントやチューブを使用してRNAを単離するための領域を準備します。 、我々は常に我々は、同じサンプルから両方を勉強できるように、mRNAおよびmiRNAを含むトータルRNAを分離。
- カラム上でDNase処理工程を追加すること存在してもよいDNAの痕跡を除去する。エキソソームのソースに応じて、DNAは、マウスおよびヒト肥満細胞線8を含むいくつかの供給源から精製エキソソームに存在しないことが報告されているが、染色体DNA配列は、培養心筋細胞18の培地から精製されたエキソソームで検出されている。
- ベンダーが必要なだけ1 700μlの添加のために溶液1を洗って提供するので、私たちは、洗浄液1から350μL（下記ステップ2.4）の容積を減少させた。体積が減少されていない場合キット全体の内容を使用して放置十分な解決策は存在しない。残りの手順は、製造業者の推奨に従って行った。
- 1/10のVOを追加miRNAのホモジネート添加のLUME（30μL）と10分間、氷上でインキュベートする。
- 初期ライセート量に等しいクロロホルム：酸 - フェノールの量で抽出。新しいチューブに上相を遠心分離して回収する。
- 1.25ボリューム100％エタノール（375μL）を追加します。渦。カートリッジをフィルタリングし、10,000×gで15秒遠心分離にも適用されます。
- 推奨されるボリュームのmiRNA洗浄液1（350μL）の半分を追加し、10,000×gで15秒遠心します。
- 各サンプルの10μlのDNアーゼ1〜70μlのBuffer RDD（キアゲン）を追加します。カラムに80μLを加え、室温で15分間インキュベートする。
- ソリューション1（350μl）を洗浄し、10,000×gで15秒遠心追加。
- 解決法2/3（500μL）を洗浄し、10,000×gで15秒遠心追加。 REPEAT。
- 40μlの95で溶出°CヌクレアーゼフリーH 2 O
- RNAの濃度を決定し、100 ngの/μlにRNAを希釈。
3。 BlooのエキソソームからのmiRNAプロファイリングDタックマン低密度アレイ（本件契約）カード（〜6.5時間）を使用
TIPS
- 、PPEを身に着けていることによって、RNAを単離し、RNaseのザップと表面やピペットを拭くし、滅菌フィルターのヒントやチューブを使用するための領域を準備します。
- プリアンプ（プリアンプ）ステップは1から350 ngのRNA（350-1,000 ngのサンプルはcDNA合成後にプリアンプのステップを必要としない）をお勧めします。それはあなたが等しい条件の下ですべてのサンプルを扱う必要があるため、プリアンプがあなたのサンプルのために必要であるかどうかを判断することが重要です。プリアンプのステップは、コストを追加し、Ct値が低く許容カットオフ（32の代わりに40）を持っています。
- それは一日で実行できるカードの枚数に応じて、プレートの代わりにストリップチューブ中のcDNA反応を用意すると便利です。これは、同じ日に処理されませんcDNAサンプルの凍結融解を最小限に抑えることができます。
- さまざまなソースから収集エキソソームはdiffeの持っているRNAの量を借りる。このプロトコルは、cDNA合成反応に3μlのRNAテンプレートの最大を可能にします。限られた多分単離することができるエキソソームRNAの量、ソースに応じて。典型的な組織cDNAは3μlの容積で100ngのRNAを、ヒト血液またはヒト細胞培養培地からエキソソームから作られることを十分にRNA得ることができますが、多くの場合、より少ないRNAが含まれており、cDNAが少ない出発材料から作られている必要があります。マウスの血液エキソソームは、RNAの高いレベルを含み、3μlの内の少なくとも100ngを得ることができる。
- Megaplexはプールを使用して、RNAを精製からcDNAを準備するには転写プライマー（プールとプールBマイクロ流体カードでのmiRNAのためのプライマーを含む配列AとB）逆、氷の上で反応成分を解凍。
- ラベル2 RNaseフリープールのRT反応は1.5 mlチューブプライマーまたはプールBプライマーとチャートの順序でコンポーネントを追加します。 2つ以上の反応に成分の少なくとも1つの余分なボリュームを追加するかのようにTが推奨するマスターミックスを作る彼ベンダー。
| RT反応成分 | 成分濃度 | 1サンプルの容積（合計V /サンプル= 4.5μL） |
| ヌクレアーゼフリー水 | μlの0.20 | |
| MegaplexはRTバッファー（10倍） | 1X | μlの0.80 |
| のdNTP（100 mM）を | 4.4 mMの | μlの0.20 |
| のMgCl 2（25mMの） | 5 mMの | μlの0.90 |
| アーゼ阻害剤（20U/μl） | 2 U | μlの0.10 |
| MegaplexはRTプライマーAまたはB（10倍） | 1X | μlの0.80 |
| 逆転写酵素をMultiScribe | 75 U | μlの1.50 |
- チューブ反転6回セント簡潔rifuge。その後、ピペット4.5マイクロアンペア8チューブストリップ又は96ウェルマイクロアンペア光反応プレートに添加RT反応ミックス。
- RNA 100ngのを追加し、DEPC処理水で3μlに音量を調整したり、3μlの全RNAを加え、ピペットチップでかき混ぜると、チューブまたはプレートを密封。簡単にスピンし、氷上で5分間インキュベートする。
- PCRマシンに反応をロードし、（アプライドバイオシステムズ社Megaplexはプールプロトコルによって推奨されているように）、以下の条件の下でそれを実行します。
| ステージ | 温度 | 時間 |
| サイクル（40倍） | 16°C | 2分 |
| 42°C | 1分 | |
| 50°C | 1秒 | |
| ホールド | 85°C | 5分 |
| ホールド | 4°C | ∞ |
- -20℃でのcDNAストア（少なくとも1週間のためによい）、または一週間のために保存することができ、プリアンプのステップに進みます。
- 氷の上でプールとプールBのプリアンププライマーを解凍し、混ぜて反転。渦巻タックマンプリアンプマスターは混ぜても氷の上に保つ。
- 2つ以上の反応に成分の少なくとも1つの余分なボリュームを追加チャートに従うかのようにベンダが推奨マスターミックスを作る。
| プリアンプ反応成分 | 1サンプルのボリューム |
| ヌクレアーゼフリー水 | 7.5μL |
| タックマンプリアンプマスターミックス（2X） | 12.5μlの |
| MegaplexはプリアンププライマーまたはB（10倍） | 2.5μL |
- ピペット2.5μlのRTのproduCTマイクロアンペアに8チューブストリップまたは96ウェルマイクロアンペア光学反応プレート各ウェルに22.5μlのプリアンプ反応ミックスを分注する。
- 氷上で5分間のインキュベートプレートを密封した後、PCR装置にサンプルをロードします。以下の条件の下で実行されます。
| ステージ | 温度 | 時間 |
| ホールド | 95°C | 10分 |
| ホールド | 55°C | 2分 |
| ホールド | 72°C | 2分 |
| サイクル（12X） | 95°C | 15秒 |
| 60°C | 4分 | |
| ホールド | 99.9°C | 10分 |
| ホールド | 4°C | ∞ |
- プリアンプ反応が完了した後、短時間チューブまたはプレートを遠心分離し、各ウェルまたはチューブに75μlの0.1×TE液pH8.0を追加します。
- 密封し、混ぜると簡単にスピン。 -20℃で1週間希釈製品を保管またはプレートをロードするために続けています。
- 氷上でRNaseフリー1.5mlチューブに次のように結合します。
| コンポーネント | 1カードのボリューム |
| タックマンユニバーサルPCRマスターミックス、ノーのAmpErase UNG（2X） | 450μlの |
| 希薄化後PREAMP製品 | 9μlの |
| ヌクレアーゼフリー水 | 441μlの |
- 混ぜると簡単に遠心するチューブを反転。タックマンのマイクロRNAアレイカードの各ポートに100μlのPCR反応ミックスを分注する。
- 1分間カード2×1,000×gでの遠心。カードを密封し、アプライドバイオシステムズマニュアルと384ウェルタックマン低密度アレイ設定でプライマーを用いて提供されるテンプレートを使用してそれを実行する。私たちは、アプライドバイオシステムズ7900HT FastリアルタイムPCRシステムを使用しています。
4。タックマンよるmRNA分析（〜1.5時間）
- 定量PCR反応を準備するには、グラフ内の順序で反応成分を混ぜる。全てのサンプルを正規化遺伝子として、目的の遺伝子、並びに18S rRNAのためのプライマーのプローブを用いて分析する。
| タックマンの反応成分 | 1サンプルのボリューム |
| ヌクレアーゼフリー水 | 7液（個々のサンプルに基づいて調整します） |
| タックマンFASTマスターミックス（2X） | 10μlの |
| タックマンのプライマープローブ（20倍） | 1μlの |
| 100ngのRNAからのcDNA | 2＆ムー、L（個々のサンプルに基づいて調整します） |
- メーカー（バイオシステムズ7900HT FastリアルタイムPCRシステムを適用）により推奨されているように速い96ウェルブロックを使用して96ウェルプレートを実行します。
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結果
血液や細胞培養培地からエキソソームを分離した後、エキソソームの純度は、電子顕微鏡（EM）とウェスタンブロット（ 図1Aおよび1B）によってテストすることができます。私たちは、EMと複数の抗体を用いてウェスタンブロットで、さまざまなソースからの私達のエキソソームの準備を確認した。 図1Aは、エキソソームは〜の直径30〜100ナノメートルで完全であり、免疫金標識によってCD81が含まれていることを確認するEM画像を示す。一般的に使用されるエキソソームマーカーはCD63、CD81とCD9 14のHsp70とtetraspannin家族の糖タンパク質である。精製エキソソームの整合性を確認した後、我々は、図1BにHsp70のためにウェスタンブロットを行い、メディア単独（陰性コントロール）されていませんがエキソソームはHsp70を含んでいることを示した。バイオアナライザのトレースは、RAW細胞培養培地から分離エキソソームは、RNAのさまざまなが含まれていますが、全体からのRNAで典型的なもので...
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ディスカッション
このプロトコルでは、我々は、血液や文化メディアからの差動遠心分離により精製エキソソームからのmiRNAとmRNAの定量化を示しています。エキソソームは、その起源に依存して様々な構成要素を有し、免疫応答、抗原提示細胞内通信、RNAおよびタンパク質9,11,12,19,20の伝達を含む生物学的機能の数に関与している。大きさや形状はエキソソーム純度の行列ですが、EMのエキソソームのデータを示した論文数は、これらの小胞は、それらが固定に使用される方法と同様に分泌されるソースおよびイメージング9に基づいて大きさと形態に及ぶことができることを示している、15。 30-100ナノメートルのエキソソームのための受け入れサイズは、ソース21,22、複数の方法がエキソソーム純度を検証するために使用されている一つの理由に応じて大径のエキソソームの小さな人口を含む平均範囲です。分泌miRNAは多くの必要なフィーチャーしを持って様々な疾患2,3,24のための潜在的な治療標的であることに加えて23の良いバイオマーカーのES。この精製法...
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開示事項
著者らは、開示することは何もありません。
謝辞
本研究では、リタ·アレン財団助成金からシーナアジットへの資金によってサポートされていました。著者は、楽器の使用、科学的、技術的支援のためのサウスカロライナ州電子顕微鏡センターの大学からエリカバログ博士Soumitra Ghoshroyを確認したいと思います。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| EDTAコーティングバキュテイナー(10mlチューブ) | BD診断 | 366643 | ヒト血液からのエキソソーム精製用 |
| EDTAコーティングバキュテイナー(2mlチューブ) | BD診断 | 367841 | エキソソーム精製用 |
| BD診断 | 762165 | 全血 | |
| miRVanaマイクロRNA単離キット | Ambion | AM1561 | |
| 酸-フェノール: CHCl3 | Ambion | 9721G | |
| DNase 1 | Qiagen | 79254 | |
| TaqMan Universal PCR Master Mix, No AmpErase UNG | Applied Biosystems | 4326614 | TLDA カード用 |
| Megaplex RT げっ歯類プールセット v3.0 | Applied Biosystems | 4444746 | |
| Megaplex プリアンプげっ歯類 プールセット v3.0 | Applied Biosystems | ||
| Taqman Array Rodent MicroRNA A+B set V3.0 | Applied Biosystems | 4444909 | |
| Megaplex RT Human Pool set V3.0 | Applied Biosystems | 4444745 | |
| Megaplex Preamp Human Pool set v3.0 | Applied Biosystems | 4444748 | |
| Taqman Array Human MicroRNA A+B Cards Set v3.0 | Applied Biosystems | 4444913 | |
| TaqmanMicroRNA RTキット | Applied Biosystems | 4366596 | |
| Taqman fast universal PCR master mix | Applied Biosystems | 4366072 | For mRNA qRT-PCR |
| 腫瘍壊死因子(プライマープローブ) | Applied Biosystems | Hs01113624_g1 | |
| 血管内皮増殖因子A(プライマープローブ) | Applied Biosystems | Hs00900055_m1 | |
| Maxima First Strand cDNART-qPCR用合成キット | Thermo Scientific | K1642 | mRNA |
| HSP70抗体 | Abcam | ab94368 | ウェスタンブロット用 |
| 抗ウサギIgG-ゴールド | Sigma | G7402 | 電子顕微鏡用 |
| ウサギ-抗CD81 | Sigma | SAB3500454 | |
| ニッケル 300メッシュ カーボンフォームバーグリッド | 電子顕微鏡科学 | FCF300-Ni | |
| 銅300メッシュカーボンフォームバーグリッド電子 | 顕微鏡科学 | FCF300-Cu | |
| 表1.特定の試薬の表。 |
参考文献
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再版と許可
