齧歯尿生殖洞間充織とヒト幹細胞の組織の組換えを用いたヒト前立腺上皮の形成

サマリー

前立腺癌の開始を根底早い分子機構を解明するために、斬新かつ革新的な人間のモデル系とアプローチが必死に必要とされている。ヒト前立腺上皮を形成するために、多能性幹細胞集団を誘導するプリ前立腺尿生殖洞間葉（UGSM）の電位は、前立腺研究における強力な実験的なツールである。

要約

前立腺癌の研究の進展が著しく、前立腺疾患の開始を根底に遺伝的および分子事象を理解するために我々の能力を制限するヒト由来とホルモンナイーブモデルシステムの可用性によって制限されます。発癌ヒト前立腺を研究するための優れたモデルシステムの開発に向けて、私たちと他の人が胎児の齧歯類前立腺間質のユニークなプロ前立腺誘導可能性を利用している、尿生殖洞間葉（UGSM）が呼ばれる。このような胚性幹細胞などの特定の多能性細胞集団と再結合するとき、UGSMは、テストステロン依存的に正常なヒト前立腺上皮の形成を誘導する。例えば、ヒトモデル系を調査し、実験的に、典型的なげっ歯類のトランスジェニックの研究と比較して加速した候補前立腺がん感受性遺伝子の能力を試験するために使用することができる。ヒト胚性幹細胞（ES細胞）遺伝的に培養ボイジャーで変更することができるのでグラム誘導性遺伝子発現やsiRNAは前に組織の組み換えにベクトルをノックダウン、そのようなモデルでは、機能遺伝子の結果、または促進するか、または発癌を防止すると考えられている遺伝子の組み合わせを、テストが容易になります。

UGSM細胞の純粋な集団を単離する技術は、しかし、挑戦されており、頻繁に学習すると、以前の専門知識を持つ誰かが個人的に教えることが必要です。また、免疫不全宿主の腎被膜下細胞混合の接種は、技術的に挑戦することができます。ここでは、アウトラインと齧歯類の​​胚及びヒト前立腺上皮を形成するために、組織の混合物の腎カプセル注入からUGSMの適切な分離を示しています。そのようなアプローチは、その現在の段階では、胚性幹細胞の異種移植生体内で必要とし、将来のアプリケーションは、潜在的にインビトロ腺形成または人工多能性幹細胞集団（iPS細胞）を使用して含むことができる。

概要

前立腺癌のより良い人間モデル系のための多大な必要性が存在する。具体的には、遺伝的に直接前立腺癌の開始において特定の遺伝子の役割を識別するために操作可能な通常の、非悪性前立腺組織の関連するヒトモデル系は非常に有益であろう。ゲノム時代の到来は、癌の形成において役割を有することができる多数の遺伝子を同定している。実験的な人間のモデルシステムの欠如は、しかし、深刻な機能的にテストし、候補前立腺がん感受性遺伝子を特徴づけるために我々の能力を損なう。理想的なモデルシステムは、適切なトランスジェニックげっ歯類モデル系と組み合わせて、癌感受性遺伝子の迅速かつより迅速な機能解析を容易にするであろう。さらに、このような人間のモデル系はへ新しい治療法の発見と検証に向けて発癌前立腺のシグナル伝達機構の分子特性解析を可能にする前立腺癌の形成を防止する。

ヒト胚性幹細胞（ES細胞）異種移植片のようなヒト前立腺組織を形成することができる。 2006年にテイラーらは 、ヒトES細胞は、8〜12週の期間内に齧歯類泌尿生殖洞間葉（UGSM）で再結合されたとき、生体内で前立腺上皮を形成するように誘導することができることを報告した^。1これらの研究はで以前の研究に基づいていたその齧歯胚UGSMを示すクーニャラボは、幹細胞とin vivoでの胚上皮細胞集団の前立腺分化を促進することができます^。2,3前立腺は、尿生殖洞（UGS）と呼ばれ、前胚17日（にマウスE17胚原基から開発;ラットにおける日E18）UGSを除去することができ、物理的に上皮（UGSE）と間葉（UGSM）に分割⁴この組織換えアプローチはかなり特定の前立腺の開発と発がんの我々の理解を、強化しています。LYの成長因子、ホルモンシグナル伝達経路と前立腺間質と上皮の間の分子の関係^。5-8この方法は、幹同一または異なる種からの上皮細胞とUGSMのex vivoでの組み合わせを含み、これらの細胞/組織組換え体を移植し、栽培されているとマウスのホスト内の異種移植^。4,9 生体成長の期間の後、インプラントは、間質組織に埋め込 ​​まれている前立腺上皮腺構造が含まれています。さらに、染色は、そのような構造が本当に前立腺とヒト由来のかどうかを判断するために実施することができます^。10,11

プロトコル

この研究は米国国立衛生研究所の実験動物のケアと使用に関する指針の勧告に厳密に従って行った。プロトコルはシカゴインスティテュー動物実験委員会の大学（IACUC、プロトコル番号72066および72231）によって承認された。すべての手術麻酔下で行い、すべての努力を最小限に抑えるために苦しんで行われた。ヒト胚性幹細胞株WA01（H1、NIH登録＃0043）がmTeSR1メディアを使用してフィーダーに依存しないプロトコルを使用してWiCell（マディソン、WI）、培養から取得しました（電池技術を幹、バンクーバー、BC）。 ES細胞を解凍通路10内で使用された。

1。マウスまたはラット胚から尿生殖洞の分離

1. 5分間のCO ₂吸入によりタイムアウト妊娠マウス（日17.5）またはラット（日18.5）を安楽死させる。死亡は、ラットにおけるバイタルサインの停止によって確認される。その後、人道的にその首を破る。 Rにおいては、この時点で安楽死させている。腹部皮膚及び脇腹を殺菌するために70％エタノールを散布。腹部の皮膚や筋肉の層をカットした後、子宮を切った羊膜嚢からラット胚を分離し、へその緒を切った。氷冷ハンクス平衡塩類溶液（HBSS）を含む50ミリリットルファルコンチューブに胚を移し、氷上に保つ。胎児は、外科はさみで断頭により安楽死させる。
2. 100ミリメートルペトリ皿に胚を置きます。臍（ 図1A）のレベルでハサミで胚を二等分する。胃や小腸を取り外します。雄の胚（ 図1B及び図1C）の女性胚と精巣で卵巣を明らかにする。 （卵巣は腎臓の尾極に配置されています。精巣、膀胱のレベルで約です）。この発達段階では、両方の男性と女性の胚から単離さUGSMは、ホストの存在下で前立腺上皮系統を誘導することができるテストステロン^。4この発達時点の後、しかし、前立腺芽がUGSMに形成し始め、純粋UGSMの分離は非常に困難である^。4
3. 解剖顕微鏡下で、膀胱と腹部の後壁を公開するVannasはさみで真ん中のラインで腹壁をカット。添付ファイルから無料アッパー生殖（オス胚における、尿管、ウォルフ管とミュラー管をカット、女性胚において、尿管とミュラー管をカット）。臍帯から膀胱を解放。恥骨とデュモン細かい先端の鉗子との泌尿生殖洞の前壁からぶっきらぼうに別をカットします。最後に、直腸から泌尿生殖洞の後壁を分離。下端（尿道から）で、膀胱と尿生殖洞をカットし、氷冷HBSSで泌尿生殖洞を一括します（膀胱）を格納する。

2。尿生殖洞間充織の分離

1. 解剖顕微鏡（ 図1D）の下尿生殖洞から膀胱を削除します。
2. 1％のカルシウムでトリプシン（のCa ^{2 +）}とマグネシウム（Mg ^{2 +）}自由HBSSを含むファルコンチューブに尿生殖洞を転送します。 75分間、4℃の冷蔵庫にチューブを置きます。
3. トリプシンを取り外し、DMEM/F12培地中で、10％胎児Bovin血清（FBS）をトリプシンを中和。
4. 慎重に針またはデュモン細かい先端鉗子（上皮管をそのまま維持すると上皮チューブから粘着性の間葉スリーブをいじめることは間葉の上皮細胞の混入の可能性を減少させ、これはあなたの幹細胞由来のヒトと一緒に形成する齧歯類腺になることが腺上皮）（ 図^1D）。12
5. + 1％非必須アミノ酸（NEAA）プラス1nM​​のR1881; DMEM/F12培地+が10％FBS + 1％ペニシリン/ストレプトマイシン（0.5 mg / mlのペニシリン/ストレプトマイシン）を含む新たなファルコンチューブにUGSMを移す。 PLエース37℃のインキュベーター内チューブ5％CO ₂で一晩。
6. 200 xgで組織を遠心分離し、上清を捨てる。リン酸緩衝生理食塩水（PBS）（組織ペレットを乱さないでください）​​で洗ってください。
7. 再懸濁する組織に0.2％コラゲナーゼ（DMEM/F12で）を追加します。 1時間穏やかに揺れて37℃でインキュベートする。
8. 精力的に渦消化組織三回、それは均質な単一細胞混合物となり、コラゲナーゼを中和するDMEM/F12培地+ 10％FBS + 1％P / S + 1％NEAA + 1nMのR1881を追加するまで。
9. 200×gで遠心分離した後、HBSSでUGSM細胞を再懸濁することにより洗浄し、完全にUGSMを洗浄を3回繰り返します。最後DMEM/F12に間葉細胞を中断し、血球や細胞計数装置を用いて細胞を数える。
10. Accutase消化（;ビルリカ、MAミリポア）を使用して; mTeSR1メディア（バンクーバー、BC電池技術を幹）とのフィーダーフリーのプロトコルを使用して培養ヒトES細胞を解離する。ヒトES細胞を洗浄暖かいDMEM/F12メディアで彼らの成長のログインフェーズ中に、その後暖かい1X Accutaseソリューションを追加して、単一の細胞がコロニーから一様に解離されるまで15〜20分間37℃でインキュベートする。 Accutaseを中和し、穏やかにピペッティング上下細胞塊を混合し、分割するために、1xの定義されたトリプシンインヒビター（グランドアイランド、NYインビトロジェン）の等量を追加します。ピペット200×gで3分間遠心チューブと遠心分離機への細胞、およびDMEM/F12メディアで再懸濁細胞ペレット。 200が再びxgで3分間、チューブを遠心し、上清を除去し、次いで、所望の音量で冷たいHBSSまたはDMEM/F12で再懸濁する。
11. ヒトES /間葉系細胞の1:2.5比hES細胞を追加します^。3これは、10ミリリットルの注射あたり4E ⁴ヒトES細胞と1E ⁵ UGSM細胞（シングルラットUGS 2E ⁶間葉細胞について通常利回り）の細胞組成になります。 5分間200×gで遠心分離した後、上清を捨てる。 75％マトリゲル（BD Biosciences社、と再懸濁サンノゼ、カリフォルニア、扱いやすくするために25％の冷たいHBSSと混合）とサブ腎カプセル注入のため氷の中にチューブを置きます。

3。腎被膜の下に組換え組織の移植

1. 無菌手術領域を準備します。
2. ケタミン/キシラジンIPを持つ男性の無胸腺ヌードマウスを麻酔、ケタミンの1時01分08秒の比率を含む新鮮なミックスを使用：キシラジン：生理食塩水。投与は100 mg / kgでケタミンおよび2.5 mg / kgをキシラジンなります。つま先ピンチに反応しない動物は、完全に20〜30分間の下でなければなりません。
3. 外科ベタジン溶液及び外科用ドレープを適用することにより、続いて70％のアルコールの3交互ワイプでクレンジング、手術部位を（ヌードマウスを使用していない場合）シェービングでマウスを準備します。
4. 麻酔中の乾燥を防ぐために、マウスの目に目水分軟膏（Altalube眼軟膏）を置きます。
5. 手術中に、マウスの呼吸速度および中核体温が監視される。呼吸速度笙40-90回/分以内に安定して維持される自民。中核体温は、粘膜と足の裏ピンクの色を観察して監視される。
6. 背面に1.0センチメートル長い縦皮膚切開を行います。 0.5センチメートル縦切開で腹壁をカットし続けています。
7. 優しく腹部の腎臓を絞り出す、滅菌生理食塩水の滴を使って腎臓の表面を湿った状態に保つ。
8. そっと穿刺空の27ゲージ注射針を使用して腎カプセル。非常に浅い穿刺で十分です。あなたの携帯電話、混合物を注入するためにあなたの鈍針を挿入してここは次のようになります。
9. あなたの細胞混合液10μlと28ゲージの鈍注射針を埋める。ゆっくり穿刺部位を挿入し、腎被膜下の領域に到達するために腎臓実質貫通している。腎被膜下に腎臓にボーラスを形成する細胞の混合液10μlを注入します。撤退針。
10. ABDOに腎臓を返す端末空洞。 4-0ナイロン縫合糸で腹膜の筋層を固定します。
11. 縫合糸またはステープルのどちらかで皮膚を閉じます。
12. 滅菌生理食塩水を使用して皮膚から血液をきれいにします。

4。術後鎮痛とモニタリング

1. 術後の痛み、37 1mlのを管理するためにブプレノルフィン（0.1 mg / kgを12時間毎）、又はケトプロフェン（生理食塩水で3〜5 mg / kgを12時間毎）で動物を注入℃の生理食塩水を腹腔内に動物を暖かく保つために脱水を防ぐ。
2. 清潔なケージに動物を入れて、マイルドな加熱パッドの上に置きます。
3. 彼らは意識を取り戻し、ケージ内で移動された後、動物の部屋に戻って動物を送信します。
4. 次の3日間、病気や感染の予想外の兆候を毎日動物を観察します。マウスは、食料や水術後1日のアクセスを含むケージでの活動の観察と監視されています。マウスが少ない活動を表示すると、ケトプロフェンは腹腔内広告です一日一回再び仕え。
5. 皮膚ステープルまたは縫合糸2週間後に手術を取り外します。
6. 異種移植組織は8週間後の手術は早くも収穫することができる。異種移植片は、小動物超音波（ 図2A）と、固定組織を用いたin vivoで画像化することができる免疫組織化学（ 図3）を用いて種々のタンパク質のための切片で染色することができる。

結果

、私たちの研究室では、一般的に使用されるH1（NIH-指定WA01、遺伝的に男性）は、ヒト胚性幹細胞株を用いて移植プロトコルを開発してきましたが、この行は厳密に品質管理のためにテストされています^1。テイラーらの刺激的な報告書に構築および核型正常である^13が適切に培養し、ヒトES細胞を維持拡大し、フィーダーフリー培養法（幹細胞技術を経由して、市販のフィーダーフリーシステム、バンクーバーBC）を使用して未分化多能性の状態で凍結保存することができます。図^14は、当社のプロトコルは、E18ラットUGSMの単一細胞懸濁液と組み合わせると成人男性免疫不全マウスの腎被膜下に注入されたヒトES細胞の単一細胞懸濁液を採用しています。重要なコントロールとして、USGMはヒトES細胞はUGSMフォーム大奇形腫（ 図2B）せずに移植しながら、識別可能な成長をもたらしていないだけでは移植した。我々の経験では^15を 、インプラント組織の80％以上との時間の80％（1ミリメートルから5ミリメートル〜8週間のサ...

ディスカッション

UGSMを用いて組織の組換えは、前立腺および前立腺癌の開始につながる分子事象の開発を調査するために非常に便利なテクニックです。 UGSMの誘導電位が前立腺研究の多くの用途に用いられてきたが、これらは増強腫瘍間質上皮相互作用を研究し、異種間前立腺組換え体を形成し、前立腺細胞株および腫瘍を取る含むUGSMの^7,17-20適切な製剤。しかし、げっ歯類上皮は腺形成になり、結果を混乱させることができます汚染などの実験成功に不可欠です。したがって、UGSEからUGSMの分離（ステップ2.4​​）遠くて、プロトコルの中で最も重要で、最もトリッキーなステップです。このような汚染を制御するには、種間で識別する技術を使用することを強く奨励し、同様にされて蜂巣からの腺形成を文書化しないために単独UGSMを使用して、追加の実験的なアームrの汚染物質¹²

フィーダーフリーのhES培養試薬および方法の最近の開発は純粋な集団ヒトES細胞は、培養された拡張および凍結保存することができます^。14はまた、レンチウイルス遺伝子送達の利用拡大は、目的の遺...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ハンク平衡塩溶液 (HBSS)	GIBCO	14170
DMEM/F12	GIBCO	11330
R1881	Sigma	965-93-5	エタノール中 1 ug/ml に混合 (1,000x ストック)
NEAA	GIBCO	11140
Pen-Strep Solution	GIBCO	15070	100x stock
Matrigel	BD Biosciences	354230
KETASET(塩酸ケタミン)	Fort Dodge Animal Health	NDC 0856-2013-01	100 mg / ml;滅菌生理食塩水
AnaSed(キシラジン)	VET-A-MIX、Inc.	NADA 139-236	20 mg/ml; 滅菌生理食塩水で希釈 1:10
Trypsin	BD Biosciences	215240
コラゲナーゼ	Sigma	C2014
Ketoprofen	Fort Dodge	NDC 0856-4396-01	100 mg/ml; 滅菌生理食塩水で希釈 1:1,000
Altalube eye ointment	Altaire Pharmaceuticals, Inc.	NLC 56641-19850
ライカ MZ16 F 実体顕微鏡	ライカ		どんな良い解剖スコープでも使用できます。
バンナススプリングはさみ	ファインサイエンスツール	15001-08
シリンジ	ハミルトン	84855
ハミルトンニードル、スモールRN、28ゲージ、0.5インチ、ポイントスタイル#3(鈍い)	ハミルトン	7803-02	カスタムニー
ドルエタノール準備パッド	フィッシャーサイエンティフィック	06-669-62
滅菌ガーゼパッド	ッシャーサイエンティフィック	22-415-469
Ethicon Vicryl 縫合糸 (4-0 FS-2)	MedVet International	J392H	ニードルイン、溶解性縫合
オートクリップ 9 mm 創傷クリップ	ベクトン・ディッケンソン	427631
PVP ヨウ素準備パッド	フィッシャー・サイエンティフィック	06-669-98
鈍い端付きディセクターはさみ	ファインサイエンスツール	14072-10
デュモン ファインチップ鉗子	ファインScience Tools	11252-50
はさみ付きニードルホルダー	Science Tools	12002-14