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10.3791/50332

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2013年6月12日

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1Department of Cardiology, University of Heidelberg

この記事について

サマリー

単球由来のマクロファージは自然免疫系の重要な細胞である。ここでは、使用して簡単に説明する in vitroでモデル。勾配遠心分離、負ビーズ単離および特異的な細胞培養条件を使用して、単球由来マクロファージは、表現型および機能的研究のために生成することができる。

要約

単球由来マクロファージは自然免疫系の重要な細胞型を表す。マクロファージ生物学を勉強して、マウスのモデルは、マウスおよびヒト単球由来マクロファージの間で表現型および機能の違いに苦しんでいます。したがって、我々はここでin vitroモデル初代ヒトマクロファージを生成して勉強するについて説明します。簡単に言えば、前腕静脈から引き出さ末梢血の密度勾配遠心分離後、単球は、負磁気ビーズ分離を使用して末梢血単核細胞から単離される。これらの単球は、その後、マクロファージの分化又は異なる種類の偏光を誘導するように特定の条件の下で6日間培養する。モデルは使いやすく、マウスと人間の間に種特異的な違いに起因する問題を回避。また、不死化細胞株の使用よりもインビボ条件下に近い。結論として、ここで説明するモデルはmacrophag勉強するのに適している電子生物学は、病気のメカニズムと新規治療標的を識別します。にもかかわらず、完全に死後得動物やヒト組織を用いた実験を交換しない、ここで説明するモデルは、病気のメカニズムや様々なヒト疾患との関連性が高いかもしれない治療標的の同定と検証を可能にします。

概要

単球由来のマクロファージは自然免疫系の重要な細胞成分を表し、多くの急性または慢性炎症プロセス1に貢献しています。マクロファージは、アテローム性動脈硬化症や癌2のような多くの炎症性疾患において重要な役割を果たしている。マクロファージは、可塑性の高度を示し、局所微小環境3に応じて、異なる表現型を想定することができます。したがって、マクロファージの分化と異質性を研究することは、多くの疾患の病態生理学の知識を増大させるために不可欠であり、新たな治療標的とする新規治療法の開発の識別を可能にする。

多くの場合、マウスモデルは、特定の疾患の病態を研究するために使用される。しかし、マウスモデルを用いたマクロファージ生物学を勉強するいくつかの欠点が付属しています：（1）peripにおける白血球サブセット数の割合（ すなわち、単球および顆粒球）マウスやヒトのheral血がかなりマウスおよびヒトの病態生理における単球のさまざまな役割を示唆しているとは異なります。 （2）健康および疾患4の間に、それらの機能の実質的な差異を示唆するマウスおよびヒト末梢血単核球との間の遺伝子発現の実質的な違いがある。 （3）マウス単球およびマクロファージを識別するために使用されるマーカーの数（F4/80、LYC など ）、ヒト状況にマウスモデルにおいて調査結果の転送はむしろ困難になる、ヒト骨髄細胞には存在しない。

したがって、ヒトの疾患におけるマクロファージの分化と異質の理解を高めるために、我々は、ヒトマクロファージでの作業モデルを利用する必要がある。したがって、我々は、ここで使用することは簡単ですし、別のマクロファージPOの結果、様々な条件下でのin vitroでのヒト単球由来マクロファージの研究を可能にするヒト初代マクロファージ世代のモデルを記述larizationタイプ。いくつかの研究において、我々は、マクロファージ生物学および5-7ヒトアテローム性動脈硬化症への潜在的な関連性を分析するために単球由来の初代ヒトマクロファージのin vitroモデルにおいて使用している。

にもかかわらず、完全に死後得動物やヒト組織を用いた実験を交換しない、ここで説明するモデルは、病気のメカニズムや様々なヒト疾患との関連性が高いかもしれない治療標的の同定と検証を可能にします。

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プロトコル

1。プロトコル

  1. 次のようにバッファを準備します。
    1. PBMCの分離のためのバッファを準備します。PBS中= 0.02％EDTAを（使用0.5 M EDTA） "バッファを洗う"。
    2. 単離のためにバッファを準備します。 "MACSすすぎバッファ" = 0.5％BSA（250 mg）を+ 2mMのEDTA（200μlの）+ PBS（50ミリリットル）。ドガバッファ。
    3. "FACSバッファー" PBS中= 10％FCSと "固定バッファ" PBS中= 1％PFA：細胞のFACS染色および保管するためのバッファを準備します。
  2. 前腕静脈から30ミリリットルの全血を引く。抗凝固剤としてEDTAを使用してください。
  3. 次のようにPBMC（HISTOPAQUE）を単離：
    1. 2無菌の50mlチューブ（無ポリ - スチレン）を準備します。
    2. PBS 1:1でステップ2から血液を希釈します。
    3. + 25ミリリットルの全血/ PBSチューブあたり25ミリリットルのHISTOPAQUEを追加します。 HISTOPAQUEと血が混ざらないことを確認してください。
    4. RT、ブレーキなしで30分間400×gで遠心分離します。
    5. 血漿および廃棄を吸引。
    6. クリーンの50ml浴槽に不透明なインターフェイスとピペットを吸引電子。
    7. PBS中0.02％EDTAを20mlを加える。
    8. 4℃で5分間、250×gで遠心
    9. 上清を捨てます。
    10. PBS中0.02％EDTAを10mlを加える。
  4. 次のようにセルを数える。
    1. 10秒間ボルテックスでよく混ぜる。
    2. 200μlの細胞懸濁液+ 300μlのPBS中0.02％EDTA +トリパンブルー（200-500 cells/10正方形、そうでない希釈率を変更します）の500μLを取る。
  5. 次のように単球の負の分離を実行します。
    1. 10分、120×gのためにステップ3.10で得られた細胞を遠心分離。上清を捨てます。
    2. 10 mlのPBS + 0.02％EDTA、10分間、120×gで遠心を追加することで、細胞ペレット2倍を洗ってください。
    3. 1ミリリットル10X PBSを加え、3秒間9ミリリットル滅菌水を追加します。
    4. PBS + 0.02％EDTAでもう一度洗浄し、10分間、120×gで遠心。
    5. 遠心分離中数える。
    6. 5×10 7 / mlでEasySepバッファーに希釈します。
    7. 50ミリリットル/μlの単球濃縮コックを追加尾。
    8. 4℃で10分インキュベート
    9. 30秒間ボルテックスビーズ。
    10. 50μL/ mlのビーズを追加します。
    11. 4℃で5分間インキュベート
    12. 2.5ミリリットルの容積を完了するEasySepバッファーでいっぱい。解決策は今茶色がかった表示されます。
    13. 磁石に入れ。
    14. 室温で2.5分待ちます。この間磁気ビーズに結合した非単球細胞が管壁に移動し、そこに固執する。
    15. フレッシュ無菌チューブに非結合単球とバッファを注ぐ。このソリューションでは白っぽく見えます。
    16. PBS + 0.02％EDTAで一回洗浄し、10分間、120×gで遠心します。
  6. 0.5×10 6個/ cm 2の密度でプラスチックの皿または多層プレートのプレートの細胞。培地/ 1×10 6個の細胞を1 mlを加える。
  7. 6-14日間興味のある条件下での培養細胞。
  8. （詳細については表1を参照）は、新鮮なメディアでのメディアの50％を置き換えることにより、3日後にメディアを変更してください。
  9. 後の6日は、mRNAの分離、フローサイトメトリー、ウェスタンブロット法、 等のための細胞を回収。

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結果

上記のプロトコルを使用して、我々は日常的に25.1×10 6±2.2×10 6 monocytes/100 mlの血液を（26の独立した実験の平均値±標準誤差、 図1A）を取得。 CD14のためにフローサイトメトリー染色によって決定された単球純度は日常的に、95％以上（97.1±0.4％、3つの独立した実験、 図1Bからの平均±標準誤差）である。トリパンブルー染色により決定される新たに単離した単核細胞の細胞生存率は95％であった（データは示さず）よりも日常的に大きくなる。最初に細胞は丸い形とフロートですが、彼らは通常、数時間以内に付着し始める。密着性が"目玉焼き"や紡錘状（ 図2）に向かって形状変化に関連付けられています。酸化LDL（最後の24時間は100μg/ ml）を加えての有無にかかわらず、M-CSF（100 ngの/ ml）をとの文化の中で6日後、細胞の約80％がoxLDLのにさらされていないTREのに対し、実行可能であるoxLDLのとatmentは約70％の生存細胞（ ...

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ディスカッション

単球由来マクロファージは自然免疫系の主要な細胞型を表す。それらは、アテローム性動脈硬化症または癌2を含む多くの炎症性疾患において重要な役割を果たす。したがって、マクロファージ生物学を研究することは、多くの疾患の病態生理に知識を増大させるために不可欠であり、新規な治療法の開発を可能にする。

多くの研究は、マウスモデルの過剰発現を適用したり、興味のある特定の遺伝子を欠いた。単球由来マクロファージの場合、これはマウスおよびヒト単球および単球由来細胞4との間に実質的な違いがあるので、ヒトの疾患に関連するプロセスを研究するための最良の方法ではないと思われる。従って、一次ヒト細胞を利用して有効なモデルは、マクロファージの分化の疾患関連のメカニズムを研究するための優れた代替手段と思われる。

ここで紹介するin vitroモデルの明確な利点は、それがimmortaliに依存していないということですTHP-1や他の人のような14-15 ZED細胞株。細胞株は容易...

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開示事項

著者は利益相反を開示する必要はありません。

謝辞

私たちは、優れた技術支援のためナディーンのWambsganssに感謝。この作品は、CAGにイノベーション基金FRONTIER（ハイデルベルク大学）からの助成金によってドイツ学術振興（GL599/1-1）からの助成金によって部分的にサポートされていました

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
50 ml 遠心分離チューブ (滅菌)Fisher055398
D-PBS (1X)、液体 (カルシウムまたはマグネシウムなし)Invitrogen14190-250
EDTASigmaT9285
BSASigmaA-8806
FCSInvitrogen
EasySep Human Monocyte Enrichment KitStemCell Technologies19059
EasySep MagnetStemCell Technologies18000
FACS tubesFisher352008
Macrophage-SFM (1X)Invitrogen12065-074
ペニシリン-ストレプトマイシンSigmaP-4458
Nutridoma-SPRoche11011375001
human M-CSF 10 μgPeprotech300-25
細胞培養プレート 6-wellFisher07-200-80

参考文献

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