心室の脳脊髄液（CSF）は、胚の初期に脳の発達の間に神経上皮および大脳皮質前駆細胞を浸す。ここでは、その生物学的機能を調べるために、異なる年齢の齧歯類の胚から心室CSFを分離するために開発された方法を説明します。加えて、我々は我々の大脳皮質植郭清および培地またはCSFの最小限のボリュームで外植片の成長を可能にする培養技術を実証する。
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この記事について
サマリー
要約
CSFは、開発全体と成人期の動的に変化するプロテオームを持つ複雑な流体である。胚発生時には、発生期のCSFは前方神経管の閉鎖時に羊水から区別します。 CSFのボリュームは、神経上皮前駆細胞は脳室と脈絡叢生成CSFを裏打ちするように、その後の日にわたって増加します。発達中の脳や脊髄の神経幹細胞の胚CSFの接点は心尖、心室表面。 CSFは脳の発達の拡大のための重要な流体圧を提供し、時間的に特異的に神経前駆細胞への促進因子の重要な成長を配布しています。 CSFの機能を調べるためには、血液や開発終脳組織からの汚染なしに胚CSFの純粋な試料を分離することが重要です。ここでは、使用することができる胚性心室CSFの比較的純粋な試料を分離するための技術を説明質量分析、タンパク質電気泳動し、細胞と一次移植片培養を含む実験アッセイの広い範囲。我々はメディアやCSFの減量化量を使用した開発皮質組織を成長させるために多孔質ポリカーボネート膜上に皮質の外植片を分析し、文化する方法を示しています。この方法では、実験は標的細胞上のプロテオームCSFの生物活性を調べるために、さまざまな年齢や条件からCSFを用いて行うことができる。
概要
CSFは開発上皮1-6を浴びると脳の発達のために8月12日手がかりを推進不可欠圧力7と成長を提供する複雑な流体である。脳の発達の過程でCSFを勉強するために、我々は6,9開発のさまざまな段階でラットやマウス胚の開発から心室CSFを単離するための技術を開発した。分離する従来の方法は、ガラスマイクロ針を使用し、マイクロインジェクター1,2を使用して脳脊髄液を分離する含まれています。我々の手法は、その先端の改善組織浸透のための超ポイントを作成するために引き出されたガラスマイクロキャピラリーピペットを使用しています。ガラスマイクロキャピラリーピペットは、その心室CSFのコレクションはプレッシャーの中で穏やかに変化を制御することができるように吸引器に接続されています。 CSF信号の幹細胞の影響を調べるために、我々は、大脳皮質の外植片を解剖ポリカーボネート膜の上に置き、適切なCUの上に浮くlture媒体は、CSF試料9を補った。この手法では、メディアの減量化量は、CSF 9の効率的な利用を可能にする、文化組織をするのに十分である。
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プロトコル
1。胚アイソレーション/準備
この手法は、マウスやラットのために使用することができます。このプロトコルでは、CSFの収集テクニックやマウス胎児脳と大脳皮質植郭清術を実証する。我々は一般的な手法の中に存在ラット対マウスの任意の重要な相違点についてコメントします。胎齢ステージングシステムでは、E1がラットのプラグの日のように分類されており、E0.5、マウスのプラグの日として分類されます。
- シルガードシリコーンエラストマーと顕微解剖皿を準備します。シルガード184シリコーンエラストマーは、2つの部分の液体成分は、パートとパートBパートAおよびパートBとして供給されている重量又は体積で10:1の比率で混合される。液体成分が混合された後、皿の全面を覆うようにペトリ皿にSYLGARDエラストマーを注ぐ。いくつかの気泡が硬化プロセス中に放散され存在していてもよい。上のシャーレのふたを置き、elastomを許可ERは、治すために。エラストマーは、24時間、またはそれ以上の温度（ 例えば 37℃）で速く硬化、室温で硬化させることができる。液体成分が固化したら、解剖皿を使用する準備が整いました。皿は、それが手順に従ってきれいに掃除されていれば、複数の実験のために繰り返し使用することができます。
- マイクロキャピラリーピペット（針）の調製。マイクロキャピラリーピペットは熱を加えることによって調製し、以下の設定でナリシゲPC-10垂直マイクロピペ....
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結果
CSFのコレクションは明確で、透明な液が得られるはずです。吸引とエッペンドルフチューブで、赤または黄色を帯びた流体によって実証されるように、血液からの汚染の証拠があってはなりません。また吸引とエッペンドルフチューブ内の組織の証拠があってはなりません。 CSFは遠心分離された場合、1はまた、汚染がないことを確実にするために顕微鏡CSFを評価することができます。汚染の兆候がある場合には、CSFは捨てられるべきです。 1 E14.5マウスごみから、1つは10から15μlのCSFを集めて予測することができます。 表1さまざまな胚年代から、マウスとラットの両方で平均リターサイズから収集されたCSFの平均的なボリュームを表しています。純粋CSFサンプルが収集されたときに、CSFは多数の異なる技術を用いて分析することができる。 図3は、マウスE14.5 CSFの2UGを使用して代表的な銀染色ゲルを示す。
大脳皮質外植片はウィットを成長させることができるhは、CSFのボリュームに加え、基礎培地全量が50μlであるように、.......
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ディスカッション
心室CSFの収集のための記載の方法は、細胞アッセイ9の数は安定したタンパク質組成と一貫性のある活動と胚CSFの比較的純粋な試料が得られている。良いコレクションのテクニックと10 E14.5マウスの産仔数と、1は、CSFの10から15μlを集めることを期待することができ、およびE16ラットのごみから、1は、CSFの50〜90μlのについて収集することが予想されます。このコレクションのテクニックは注意深い観察、遠心分離し、細胞破片や血液色合いの証拠を有するサンプルを捨てることによって、血液や組織からの汚染を最小限に抑えることができます。我々は、遠心分離後の脳脊髄液内細胞の破片やセルに対して評価する微視的流体を分析し、遠心分離後に全くペレットを持っていないサンプルは、携帯汚染から自由であることを発見した。発達中の脳組織のプロテオームへまたはCSF抽出のこの方法を使用して汚染されたCSF（データは示さず）のサンプルとは対照的に、質量分析計を用いて分析したときに6 CSFのプロテオームは、どのミトコンドリアのタンパク質が含まれていませんでした。
終.......
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開示事項
著者らは、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。
謝辞
我々は、NIH（受賞番号MKLにR00 NS072192、HD029178 AS.L.に、2 RO1 NS032457 CAWまで）からの支援に感謝しています。 MKLは、チルドレンズホスピタルボストンキャリア開発フェローシップ/ハーバードメディカルスクールショアフェローシップとアルフレッド·P·スローン財団のフェローの受賞者です。 CAWのは、ハワードヒューズ医学研究所の研究者でもある。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 試薬/材料の名称 | 会社 | カタログ番号 | 注釈 |
| Wiretrop IIキャピラリー針 | ドラモンド·サイエンティフィック | ＃5-000-2020 | |
| シルガード | エルズワースの接着剤 | 第184 SIL ELASTキット | |
| アスピレータチューブアセンブリ | シグマ | ＃A5177-5EA | |
| 使い捨てフィルター | ベンチュリまたは地元の薬局 | 利用できない | 標準的なタバコのフィルター |
| Roundstock眼科ナイフ（15度刺すナイフ） | 世界の精密機器株式会社 | ＃500250 | |
| 35mmのガラス底培養皿 | マテック（株） | ＃P35G-1.5-14-C | |
| 白金イリジウム線 | Tritech研究 | ＃PT-9010-010-3FT | |
| Nucleporeトラックエッチメンブレン | ワットマン | ＃09-300-57 | |
| ハンクス平衡塩溶液 | フィッシャー·サイエンティフィック | ＃SH30031.FS | |
| 虹彩切除はさみ | ファイン科学ツール | ＃15000から02 |
参考文献
- Dziegielewska, K. M., Evans, C. A., Lai, P. C., Lorscheider, F. L., Malinowska, D. H., Mollgard, K., Saunders, N. R. Proteins in cerebrospinal fluid and plasma of fetal rats during development. Developmental Biology. 83 (1), 193-200 (1981).
- Gato, A., Martin, P., Alonso, M. I., Martin, C., Pulgar, M. A., Moro, J. A.
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再版と許可
