齧歯気道上皮における繊毛の運動性の高分解能イメージングのためのex vivo法

サマリー

気道繊毛運動と繊毛生成されたフローをマウス気管を使用して可視化し、定量化するための簡単​​で信頼性の高い技術が記載されている。この技術は様々な要因が薬理学的薬剤、遺伝的要因、環境曝露、及び/又は粘液負荷などの機械的要因を含む、繊毛運動性にどのように影響するかを決定するために変更することができる。

要約

粘膜毛様体クリアランス機能にとって重要な洞察繊毛運動機能を定量的に分析するための撮像マウス気道上皮ためのex vivoでの技術が確立されている。収穫されたばかりのマウス気管気管の筋肉を長手方向にカットしたガラス底皿に浅い薄肉チャンバー内に装着されている。気管サンプルは長手方向にカールする気管筋を活用するために、その長軸に沿って配置されている。これは全体の気管の長さに沿ってプロファイルビューで繊毛運動のイメージングを可能にします。 200フレーム/秒のビデオは繊毛ビート周波数と波形毛様体の定量分析を可能にするために微分干渉顕微鏡と高速デジタルカメラを用いて得られる。撮影時の蛍光ビーズを添加しても、流体の流れを生成繊毛を決定することができる。プロトコル時間は室の準備のために5分で約30分、サンプルの5〜10分間に及ぶ取り付け、およびビデオ顕微鏡のための10-15分。

概要

気道上皮における運動性繊毛機能の分析は、粘液線毛クリアランスと肺の健康¹に影響^を与えることができる遺伝的要因と環境要因を解明するための実験が重要である。イメージングのために開発されたシンプルなプロトコルマウス気道上皮は、変異とノックアウトマウスモデルで気道繊毛運動を尋問するために効率的な方法を提供し、マウス気管組織切開と高解像度ビデオ顕微鏡による気道繊毛運動のex vivoでのイメージングだけで基本的なスキルを必要とする。このプロトコルはheterotaxy ^2-5関連付けられた先天性心疾患を持つ変異体では運動性繊毛機能の迅速な評価（繊毛ビート周波数、繊毛ビート形状、繊毛生成されたフロー）を可能にするために大規模マウス突然変異誘発画面中に確立され、洗練された。

気道繊毛運動性を研究するために使用される現在の技術は、急性エクスビボ型またはイオンのいずれかに分類することができ試験管内実験的アプローチでゲル用語。急性実験は人間の鼻/気道ブラシ生検^6,7とシンプルな横気道セクション⁸の分析のex vivoでの可視化が含まれています。 インビトロのアプローチは、空気液界面培養物または気道の懸濁培養物^9-11と同様に分化繊毛上皮のシートを生成するために....

プロトコル

1。試薬のセットアップ

1.1解剖とイメージング媒体

リーボビッツのL-15培地（L15）は、FBS（10％）およびペニシリン - ストレプトマイシン（100単位/ mlのペニシリンGナトリウムと硫酸ストレプトマイシン100μgの/ ml）を補足される気管試料の収穫と撮像時の両方で使用されている。

2。浅い城壁文化チャンバアセンブリ

気管組織を保持するために使用される室は、 図1に示されている。室の床は35ミリ培養皿の底ガラスである。チャンバーの上面と側面をガラス皿の上に厚さ0.3mmのシリコーンシートの小片を配置することによって生成される。シートの縁部を丸底ディッシュに合わせてカットされ、中心がさらに（ステップ2.1〜2.3を参照）浅い中央チャンバを形成するようにトリミングされる。このアセンブリの上に18mmの円形のガラスカバースリップを撮像するのに適した密閉チャンバを生成するように配置されている。

1. 完全に0.3ミリメートルの厚さのシリコーンシートの二乗は18ミリメートルラウンドガラスカバースリップをカバーしています。
2. 標準鋭い解剖ハサミでカバースリップ（シリコーンシートの円形の層になる）のエッジの周りから余分なシリコーンシートを切り落とす。

結果

コントロール気道繊毛がはっきり見えるようにして調整された方法（ 補足ムービー1、ムービーの再生が15％をリアルタイムに減速されています）でビートに見えるはず繊毛ビート（ 補足作品2の方向に顕著な流れに、、ムービーの再生は100％ですリアルタイム）。繊毛映画の定量は、 図3に見られるものと同様の結果が得られるはず。蛍光ビーズの追跡は繊毛生成流速の測定（ 図3D）を可能にしつつ、高速DIC映画のコレクションは、可能な繊毛のビート周波数（ 図3C）の定量化を行い、繊毛ビート形状の定性的な評価のために良好な画像を提供しますと方向（ 図3E）。

私たちは、直線流のインデックスを与える方向性を使用しています。方向性は、蛍光ビーズ（ つまり最短で旅合計変位を割ることによって計算されます距離によってトレースの開始点と終了点）トレース全体にわたって蛍光ビーズが移動の間の距離。ストレ.......

ディスカッション

繊毛のビート周波数（CBF）の測定は、高電力顕微鏡対物レンズと高速画像集録ハードウェア^13,15を使用して比較的容易であり、かつCBF測定は健康と病気の間に粘液線毛クリアランスを調査するほとんどの研究の基礎を形成する理由を説明します。しかし、測定するのがより困難であり、どちらも毛様体、生成されたフローと繊毛ビート波形の両方の基礎と重要性を、無視CBF測定だけでは、粘液線毛クリアランスを理解するためのCBFの測定が不可欠であるが、しばしば無視され、CBFと相関しないことがあります。 CBFが増加繊毛生成流れに対応していない可能性が増加した方法の例は、DNAH11変異を有する患者の一部に見られる。 DNAH11は軸糸ダイニン重鎖タンパク質、粘膜毛様体クリアランス¹⁶との問題を引き起こすことが予想される多動（速い）繊毛ビート異常繊毛ビート波形の両方を引き起こすことが報告されているの変異である。 significa我々のプロトコルのNTの利点は、それが表面全体に繊毛ビート形状と繊毛生成流体の流れの高分解能イメージングに最適である繊毛のプロファイルビューを可能にし、繊毛ビート方向に対して直角に繊毛を簡単.......

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
リーボヴィッツ's L-15 Medium	Invitrogen	21083-027	フェノールレッドなし
ウシ胎児血清	Hyclone	SH30088.03
ペニシリン-ストレプトマイシン	Invitrogen	15140-122
2x 細かい鉗子	Roboz	RS-4976
解剖ハサミ	Roboz	RS-5676
マイクロ解剖ハサミ	Roboz	RS-5620
メス	Roboz	RS-9801-15
P1000ピペットマン	ギルソン社	F123602
P1000のヒント	Molecular BioProducts	2079E
18 mm丸型ガラスカバースリップ	フィッシャーサイエンティフィック	430588
プラスチック35 mm培養皿	コーニング	430588
ガラス底35 mm培養皿	ワーナーインスツルメンツ	W3 64-0758
シリコーンシート0.012インチ(0.3 mm)厚い	AAAアクメラバー株式会社	CASS-.012X36-63908
0.20 μmの直径 Fluoresbrite YG Carboxylate Microspheres	Polysciences	09834-10
倒立顕微鏡、100倍のオイル対物レンズとDICフィルター	Lecia	DMIRE2	ブランドは重要ではありません。
100ワットの水銀ランプ、落射蛍光FITC励起/発光	フィルターLecia		ブランドは重要ではありません。
顕微鏡ステージ インキュベーター	レシア	11521749	室温で繊毛をイメージングする場合は必要ありません
高速度カメラ 明視野	Vision Research	Phantom v4.2	ブランドは重要ではありません。125fps以上の速度でなければならない
高速蛍光カメラ	浜松	C9100-12	ブランドは重要ではありません。10 fps以上の速度である必要があります
映画解析ソフトウェア	国立衛生研究所	ImageJ と MtrackJ プラグイン