細胞の起源、タイプ、および相互作用の可視化のための蛍光組織移植に続いて定量的マルチスペクトル解析

Summary

複雑な組織塊、器官からの腫瘍に、種々の細胞成分から構成されている。我々は、タンパク質の発現に基づいて細胞起源だけでなく、電池特性を解読するスペクトルアンミキシングに続くマルチパラメータ免疫蛍光染色と組み合わせたマルチ蛍光標識トランスジェニックマウスを利用して組織内の細胞の表現型の寄与を明らかにした。

Abstract

複雑な組織の発達への複数の細胞要素の寄与を理解する欲求と、そのような多数の組織の再生に関与する細胞型、腫瘍形成、又は脈管形成などを、我々は、腫瘍発生の多色セルラ移植モデルを考案細胞集団は、異なる蛍光着色レポーター遺伝子マウスに由来し、移植された移植された又は現像腫瘍および周囲に注入される。これらの着色次いで、細胞を動員し、腫瘍間質に組み込まれる。定量的に骨髄由来の腫瘍間質細胞を評価するために、我々はIACUCによって承認されたマウスを致死的に照射RFP発現するトランスジェニック全骨髄を発現するGFPを移植した。同所移植したマウスに注射した0ovarian腫瘍移植後6〜8週間を切除し、腫瘍関連を検出するために、骨髄起源（GFP）のマーカーならびに抗体マーカーについて分析したマルチスペクトル画像化技術を使用して、間質。次に、定量的にセルがいるから（元レポーター遺伝子ラベルに基づいて）起動集団、および4、5の非混合する当社の能力として来たラベルかを評価するためにfluoroprobesのマルチスペクトルアンミキシングを使用して、我々が多重細胞組成のMIMicc - マルチスペクトル尋問呼び出す方法論を適応スライドあたりに6個以上のスペクトルは、精度を高めるために細胞系譜や分化に関連する追加の免疫組織化学を追加しました。共局在して多重化された蛍光信号を検出するためのソフトウェアを利用して、腫瘍間質集団は、トレースさ列挙マーカー染色に基づいて特徴付けすることができる^。1

Introduction

組織の発生と修復を理解することは、創傷治癒^、2,3再生医療、発生生物学および腫瘍生物学に参加して細胞成分の解明にとって重要である。修復の状況下では、多数の細胞型は、血管新生、ECM沈着、増殖および組織再構築を支援するために周囲の微小環境に浸潤する。細胞性因子および表現型マルチパラメータ、局在を同定することができる多重化マーカー、分化状態、調査微小環境内の細胞成分との相互作用に基づいて同定することができる。ここで、我々はマルチスペクトル画像化とスペクトルアンミキシング方法論が続き、この多色·多細胞移植モデルの典型例として、腫瘍発生について説明します。

腫瘍の進行は、A、増殖の増強が含まれるいくつかの買収能力によってマークされている多段階プロセスであり、、ntiapoptotic侵襲及び血管新生特性^図4腫瘍の開発は、成長因子、構造マトリックス、血管網および免疫調節を提供するために、周囲の環境中に動員される非腫瘍細胞によって促進される^。1,5,6この微小生息域は由来細胞からなる局所、隣接例えば脂肪などの組織、および血管および骨髄由来細胞^1と遠隔の供給源。非腫瘍細胞取り込みの程度は、多くの場合、腫瘍の病期/グレードに対応する腫瘍からの需要に依存している。腫瘍微小環境の支援の役割を理解するためには、非腫瘍細胞集団の起源と分化能を理解する必要があります。

このプロトコルは、細胞成分を、骨髄由来の両方の可視化を介して腫瘍の進行の解釈を助けるために設計され、局部組織DERIVされている細胞を編蛍光レポーター遺伝子を発現するトランスジェニックマウスを利用して、我々は、致死的に照射RFP（赤色蛍光タンパク質）をマウスにGFP（緑色蛍光タンパク質）の骨髄を移植した。成功した骨髄移植に続いて、同系腫瘍細胞株を同所に注射し、4〜8週間のために移植するために許可されています。得られた腫瘍をマウスから切除し、間質の成分を可視化するために免疫蛍光染色（IF）のために処理される。多重マーカーIFはかなりの最適化^7-9が含まれ、一般的に使用される技術である、しかし、マルチスペクトル画像/アンミキシング·プラットフォームを使用すると、スペクトルの重なりを持った蛍光マーカーの組み合わせの可能性を向上させます。ここに我々はMIMicc - マルチスペクトルセルラー起源を分析するために染色し、単一のスライド上の腫瘍セクション内の8のマーカーまでを分析するために多重化細胞組成の尋問、細胞分化ST呼ぶ手法を提示のATUと腫瘍微小環境内の構成要素の細胞 - 細胞相互作用。この簡単な例は、抗体を利用した5つ、6つ、またはそれ以上のマーカーまたは細胞内プロモーター駆動の蛍光発現。 表1考慮する適切な種との潜在的な蛍光抗体染色の組み合わせを分析するために、上に展開される可能性を有する。

Protocol

同系マウス骨髄移植（BMT）は、制度的IACUCプロトコルによって承認された（ 注：このプロトコルの成功は、マルチスペクトル解析の対象として任意の標識細胞タイプ（S）の利用を必要とし、下流の分析を容易にするためには、任意の遺伝性を利用することができますまたは安定な細胞性標識我々は任意の細胞、組織、または器官に被移植モデルに適用した研究が有用と認める移植として多くのユニークな標識された集団を含むことができることができることを示唆している。さらに、多標識セルラシステム例えば、ある種の病理学的状態の研究のための移植合併症を排除するように設計され、複数の系統制限された蛍光標識することができる集団を含有するトランスジェニックマウスで見られるもの。

1. 致死的に四時間ドナー骨髄で再構成する前に、9.5 Gyの単回用量のBMTレシピエントマウスに照射される。 （BMT GFPの受信者は、生後6〜10週でな​​ければなりません）。
2. クリッピングし、無菌手術用ハサミで後肢を露出させ、それをバック剥離する前に70％エタノールでマウスの毛皮を濡らす。仙腸関節の腸骨稜を含む足全体を削除します。ちょうど足首の上にカットして足を破棄して、徹底的に骨からすべての筋肉、靭帯、余分な組織を取り除きます。 PBS中の2％滅菌FBS（P​​BS-2）を使用して、23 G針で脛骨、fibiaと腸骨稜からのフラッシュ骨髄。 （BMTのRFPドナーは制度上の基準に従って犠牲にする必要があります。）
3. スライスやそっとでは、メスとピンセットを用いてフラグメントに残りの骨を粉砕した後、私は300 rpmで37℃、1時間、3μg/ mlのコラゲナーゼで50ミリリットルコニカルチューブを配置します。
4. PBS-2でチューブの締めくくりと新しいチューブに上清を回収し、フラッシュの細胞と結合します。 4℃で5分間250rpmでのスピンダウン
5. PBS-2に細胞を再懸濁し、40 nmのセルフィルタを通して濾過する。この時点で、細胞をfluorescenために標識することができるtは1がBMTのための特定の集団を操作したい場合選別（FACS）細胞を活性化した。
6. マウスあたり100μlのPBSあたり2×10 ⁶の細胞を、再懸濁します。全身尾または眼窩後静脈ベベル側を上向きで照射のGFPレシピエントマウスに注入するために29ゲージ針を使用してください。唯一の生着の対照として100μlのPBSで1マウスを注入する。注射の前に血管を拡張し、注射すると尾静脈注射の拘束を使用するように加熱ランプを使用してください。テールポスト噴射に光圧力を加えるために滅菌ガーゼを用意します。
7. 三週間は、BMTを投稿血液眼窩を収集し、GFPの循環細胞の存在およびRFP循環細胞が存在しないことを確認するために、フローサイトメトリーによって分析する。対照マウスは、この時点で死亡しているでしょう。

2。機関動物実験委員会のガイドラインによると、腫瘍の生着

1. 前の生体内注入（1×10 ^6℃〜in vitroでの ID8卵巣マウス腫瘍細胞を増殖させるマウス当たりのエル）。注射の日、トリプシン処理細胞は、100μLあたり1×10 ⁶個の細胞でPBSにPBSで洗浄し、再懸濁する。
2. マウスのintaperitoneal腔に腫瘍細胞を注入し、針はベベル側を上向きにする必要があります。 70％エタノールで注入視力を滅菌する。 （頭蓋少し雌マウスの腹部乳首の下位集合に外側から内側）腹部の左下または右下の象限に注入、臓器を打つことは避けてください。首筋でつかみ、小指や薬指で尾を保持することによって、マウスを抑制する。マウスは、この手順のためのイソフルランで麻酔することができます。
3. このような軽度の腹部膨満感などの腫瘍の生着の兆候は、明らかであるとき、マウスを生け贄に捧げる。これは4月12日週間にわたって行われます。
4. IPキャビティから物品の腫瘍。空洞内の腫瘍は、臓器の表面および周囲に白い結節のようになります。メスで、腫瘍を除去し、24時間固定し、10％ホルマリン管/瓶内に配置。組織学的P試薬および材料は、パラフィン包埋し、スライドの準備のために容易に入手できない場合は、賠償金は、アウトソースさ病理/組織学コアにすることができます。その後の染色手順のためのスライドガラス上5-8ミクロンスライスにセクション組織。

3。マルチパラメータ免疫蛍光染色

1. 実験に利用され、すべての蛍光プローブのための単一のカラーコントロールスライドを準備します。このシナリオでは、4つの色が使用される。そのため、個々の色のための4つのスライドだけでなく、バ​​ックグラウンドノイズ制御と完全な組み合わせ染色のため、最終的に1スライドの1のスライド。 （合計スライド= 6）全てのスライドを実験変動を最小限にするために同一の方法で並べて処理される。
2. 1時間56℃でパラフィン切片を焼く。
3. 洗ったスライドをキシレンに10分を3倍。
4. 洗浄を2×5分間、100％エタノール。
5. 洗浄1×3分間95％エタノール
6. 1X 2 min90％エタノールを洗う。
7. 1X 2 min70％エタノールを洗う。
8. 水洗い1X 2分。ゆっくりと水の10倍の内外染色ラックを浸す。
9. 最後の洗浄シリーズの間に、2分（高に対するマイクロ波）の事前沸騰クエン酸ナトリウム緩衝液。 （使用中の抗体によってはトリス-EDTA緩衝液で置き換えることができます）
10. クエン酸ナトリウム緩衝液（10％のパワーオンまたは圧力釜中でマイクロ波）で20分間、スライドを沸騰させる。バッファが沸騰したら、電子レンジをオフにして放置します。
11. 熱源から外し、スライドを冷却するクエン酸ナトリウム緩衝液中で30分間休ませ。
12. 5分間水中でスライドを洗浄します。
13. マーク·パップペンで腫瘍切片の周囲に、1時間ブロッキングバッファーの2％BSA / 1％FBSマレイン酸を入れた。彼らは、このステップの間に乾燥させないように、個々のスライドを準備します。
14. ブロッキングバッファー中、最適な希釈率で一次抗体を準備します。 （使用中の抗体は、異なる種の全て（またはIgGチェーン変動-EXしている場合：同じ種のIgG2aのVSのIgG1）彼らが中に混合して使用することができるイングルの潜伏期間。抗体種が重複した場合は、インキュベーションは、抗体交差反応を最小限にするために連続して行われなければならない。）
15. この時点では、唯一のブロッキングバッファーで2のスライドにしておきます。これら2スライドは染色していないコントロールや核染色コントロールとして機能します。他の単一色のコントロールは、個々の一次抗体と共にインキュベートする。唯一の分析スライドは一次抗体の組み合わせを持つことになります。
16. でスロー回転シェーカー上で水分室ボックスに一次抗体とスライドをインキュベート4℃で一晩（〜16〜20時間）（ 注：4 +蛍光体、連続染色または直接結合を操作する場合は、抗体交差反応を最小限にする必要があるかもしれないすべての抗体をスライドに適用されるまで。このような状況下でのステップ1.16から1.21を繰り返します。）
17. そっとシェーカー上、PBST中で10分間（2回）のためのスライドを洗う
18. ウォッシュが起こっているが、最終希釈のためにアレクサ488、594と647の二次抗体を調製ブロッキング緩衝液中1:1,000の。 （これらの抗体および希釈液をバッチ間で、時間をかけて蛍光を維持するために、常に4℃で、暗所に保管していることを確認します。）
19. 単色制御スライド上で、使用される一次抗体の種に一致する単一のアレクサ希釈液を配置。全ての二次抗体は、分析スライド上に配置される。無染色と核染色コントロールスライドは、この手順全体をブロッキングバッファーに残ります。
20. 室温で2時間ゆっくりと回転シェーカー上（露光を避けるために、アルミホイルで覆われた）水分室ボックスにインキュベートする。
21. そっとシェーカー上、PBSTで5分間（2回）のためにスライドを洗浄します。光から保護するためにアルミホイルでカバーしています。
22. DAPIのみのスライドと分析スライドに1分間、DAPI（1:10,000）を追加します。光から保護するためにアルミホイルでカバーしています。他のスライドは、洗浄容器内に覆われて残されてもよい。
23. 2 DAPIインキュベートを洗うDAPI染色で他のスライドを汚染しないために、最初の5分の洗浄のための別々の容器内にスライドする。第2の5分間の洗浄のために、スライドは（すべての洗浄は、シェーカー上で行われるべきである）PBSTで組み合わせることができる。光から保護するためにアルミホイルでカバーしています。
24. カバー滑り（蛍光を維持するために、水性マウントメディアと1.5厚）前に水で簡単にディップスライド
25. 室温暗所で乾燥3時間をしてみましょう。
26. 爪硬化剤とカバースリップの端をシールします。 （アセトン、蛍光シグナルを消光可能性があるのマニキュアを使用しないでください）​​。
27. すぐにスライドを分析したり、将来の分析のために4℃で保存する。

4。マルチスペクトル画像

1. データ収集のためのニュアンスソフトウェアとOLYMPUS X-63正立顕微鏡に（液晶チューナブルフィルタを含む）ニュアンスEXカメラを利用したマルチスペクトル画像を収集。
2. 解像度を高めるために、オイル対物レンズを用いて画像を収集する。
3. イニシアLのセットアップは、使用中の各蛍光団のスペクトル範囲を設定することが含まれています。
   1. 4色の場合：
      1. DAPI：420-480nmの
      2. AF488：490-580nmの
      3. AF594：590-640nmの
      4. AF647：650-720nm
4. スペクトル範囲の各々に対して適正な露光時間を得るために分析スライドの初期画像を取る。
5. ソフトウェアは、互いにフルオロフォアの信号対雑音比及びバックグラウンド信号を識別し、分離するために使用することを「スペクトルライブラリー」を作成する。 （ 注：各蛍光色素は、データセットの適切な分析を確実にするために適切な波長曲線とスペクトルライブラリを組み立てるために、独自の単色コントロールスライドを持っている必要があります。例：3蛍光団= 4コントロールスライド、5蛍光団= 6コントロールスライド。）。
   1. 最初の画像未染色スライドを 。このスライドは、スペクトル図書館（室）内で指定される背景として、Y>
   2. 画像DAPIのみの第二スライド 。このスライドは、「描く」ツールを使って、DAPI染色された核を示すために使用され、DAPIなどのスペクトルライブラリ内に保存されます。>
   3. 画像AF488のみの第3のスライド 。このスライドは、「描く」ツールを使ってAF488染色した領域を指定するために使用され、AF488などのスペクトルライブラリ内に保存されます。>
   4. 画像AF594のみの第四スライドさせます 。このスライドは、「描く」ツールを使ってAF594染色した領域を指定するために使用され、AF594などのスペクトルライブラリ内に保存されます。>
   5. 画像AF647専用五スライドさせます 。このスライドは、「描く」ツールを使ってAF647染色した領域を指定するために使用され、AF647などのスペクトルライブラリ内に保存されます。>
   6. それぞれの個々のスペクトル成分の収集に続いて、スペクトルライブラリとプロトコルを保存します。>
6. スペクトルライブラリが完了したら、顕微鏡での分析スライド上に関心領域を見つけて、画像を保存/収集します。>

5。マルチスペクトル画像の定量分析

1. ソフトウェアに通知用いて取得ニュアンス·イメージの代表品揃えをインポートします。
2. プログラムの指示に従って保存されたスペクトルライブラリを開く
3. 分析しようとする目的の組織領域を特定します。 （脂肪組織に対して例えば、腫瘍組織）。
4. DAPI染色に基づいて個々の細胞を同定する。細胞質は核の形状に基づいて自動的に定義される。
5. 各蛍光パラメータのための選択の蛍光強度の読み出しを選ぶ（ 例えば平均、標準偏差）
6. バッチの画像を取得し、提案されたアルゴリズムを使用して、ソフトウェアのプロセスをしてみましょう。
7. 画像処理が終了すると、マージ結果ファイル。
8. Excelでの結果（または任意の他の分析ソフトウェアパッケージ）を開き、X-Y軸にお互いに対して2の蛍光強度をプロットします。各蛍光強度は、セルごとに与えられます。二重陽性細胞は、右上の象限に表示されます。ユーザーは、ベースラインの蛍光強度を定義する必要があります。

Results

我々のトランスジェニックBMTマウスモデルにおいて移植された腫瘍を分析するためにマルチスペクトル画像化技術を使用して、我々は、骨髄起源である腫瘍間質成分を識別することができる。初期BMTは、フローサイトメトリー（ 図1）により、移植後三週間確認された。同所は、BMTの生着確認が最初の腫瘍注射後6週間を切除し、ホルマリンで固定し、次のラベルのない卵巣腫瘍を注入した。パラフィン包埋腫瘍切片は<8μmのスライスに切断し、染色した。適切な単色コントロールスライドを背景自家蛍光のための1を含む各蛍光団のために作られました。 表1は、潜在的な種と2-7のパラメータの蛍光色素の組み合わせを含む。染色手順の後、画像はニュアンスカメラアタッチメントとニュアンスソフトウェアを使用して取得した。単色コントロールスライド（ 図2A）とのスペクトルライブラリを作成した後、我々はWEREできに対する「非混合」（抗体＃1）核DAPIおよび2他のマーカーと一緒にGFPの発現を示す撮影されたマルチラベル卵巣腫瘍切片の画像（抗体＃2と＃3）。以上のマーカーの（

Discussion

ここに、我々は腫瘍微小環境の骨髄由来間質成分を分析するために、多重化された細胞組成物のMIMicc - マルチスペクトル尋問として記述するマルチスペクトルイメージングのアプリケーションを記述し、しかし、この方法論や概念が複雑に構成する他の細胞要素を解読に適用することができこのような創傷治癒反応中または回生組織中に​​見られるような組織。これらの実験において、我々は、蛍光移植し、腫瘍微小環境内のホスト由来細胞からの骨髄由来細胞を区別するために、トランスジェニックマウスを利用するが、この技術は、任意のレポーター遺伝子標識された細胞の使用に向いている、遺伝子標識を発現する細胞に特に修正可能である、HA、FLAGタグ標識した細胞などを ¹¹ -簡単なLacZを、グルクロニダーゼ、彼（6X）のように、免疫組織化学によって認識されています。

我々のモデルでは、次の移植されたマウスの犠牲は、腫瘍切片を処理し、細胞の起源を同定するための抗体で染色した。RFP +骨髄由来のドナーまたはGFP +宿主組織に由来する。 図2では...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
.2 μmフィルター	フィッシャー09-740-35A
10mlルアーロック	BD	309604
25Gニードル	カーディナル	BF305122
40nm		フィルターBD352340
50mlコニカルチューブ	フィ	ッシャー1495949A
アレクサー488-MS1	ビトゲン	A21121
レクサー594-RB	invitrogen	A21207
Alexafluor 647-ch	Invitrogen	A21449
BSA	Sigma	A7906-500G
カバースリップ	Corning	2940-243
CRI-Nuance	Caliper Life Sciences
Dapi	Invitrogen	D1306
DMEM	CellGro	10-017-CV
エタノール	ダルマコン	4004-DV
FBS	invitrogen	16000-044
GFP-ms1	アブカム	ab38689
インスリン針	BD	329424
マレイン酸	アクロス	100-16-7
モイスチャーチャンバーボックス	エバーグリーン	240-9020-Z10
封入剤	dako	S3023
ネイル硬化剤	サリー・ハンセン	2103
パップペン	アブカム	Ab2601
ペン/連鎖球菌 L Glut	invitrogen	10378016
Steril PBS	invitrogen	14040-182
Trypsin	invitrogen	252000-56
ブロッキングバッファー <> マレイン酸 14.51 g NaCl 10.95 g NaOHペレット(7.5pH) 9+g 蒸留水 250 ml *2%BSA/2%FBSを含むブロッキングバッファー用の溶液に0.2%Tween-20を添加してください。攪拌してろ過します. 抗原賦活化バッファー: Tris-EDTAバッファー (10 mM Tris Base, 1 mM EDTA Solution, 0.05% Tween 20, pH 9.0) Tris Base 1.21 g EDTA 0.37 g 蒸留水 1000ml(100mlで10倍、 50mlで20倍) Tween 20 0.5ml *RTで3ヶ月間、または4°Cで保存してください。C for longer クエン酸ナトリウムバッファー (10 mM クエン酸ナトリウム、0.05% Tween 20、pH 6.0) 三滴クエン酸ナトリウム (二水和物) 2.94 g 蒸留水 1000ml HCl(pH6.0に調整) 1N Tween 20 0.5 ml