方法論記事

細胞の起源、タイプ、および相互作用の可視化のための蛍光組織移植に続いて定量的マルチスペクトル解析

DOI：

10.3791/50385

⸱

2013年9月22日

 ,  , 
1Department of Leukemia, MD Anderson Cancer Center, 2Wake Forest Baptist Medical Center, Institute for Regenerative Medicine

この記事について

サマリー

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複雑な組織塊、器官からの腫瘍に、種々の細胞成分から構成されている。我々は、タンパク質の発現に基づいて細胞起源だけでなく、電池特性を解読するスペクトルアンミキシングに続くマルチパラメータ免疫蛍光染色と組み合わせたマルチ蛍光標識トランスジェニックマウスを利用して組織内の細胞の表現型の寄与を明らかにした。

要約

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複雑な組織の発達への複数の細胞要素の寄与を理解する欲求と、そのような多数の組織の再生に関与する細胞型、腫瘍形成、又は脈管形成などを、我々は、腫瘍発生の多色セルラ移植モデルを考案細胞集団は、異なる蛍光着色レポーター遺伝子マウスに由来し、移植された移植された又は現像腫瘍および周囲に注入される。これらの着色次いで、細胞を動員し、腫瘍間質に組み込まれる。定量的に骨髄由来の腫瘍間質細胞を評価するために、我々はIACUCによって承認されたマウスを致死的に照射RFP発現するトランスジェニック全骨髄を発現するGFPを移植した。同所移植したマウスに注射した0ovarian腫瘍移植後6〜8週間を切除し、腫瘍関連を検出するために、骨髄起源（GFP）のマーカーならびに抗体マーカーについて分析したマルチスペクトル画像化技術を使用して、間質。次に、定量的にセルがいるから（元レポーター遺伝子ラベルに基づいて）起動集団、および4、5の非混合する当社の能力として来たラベルかを評価するためにfluoroprobesのマルチスペクトルアンミキシングを使用して、我々が多重細胞組成のMIMicc - マルチスペクトル尋問呼び出す方法論を適応スライドあたりに6個以上のスペクトルは、精度を高めるために細胞系譜や分化に関連する追加の免疫組織化学を追加しました。共局在して多重化された蛍光信号を検出するためのソフトウェアを利用して、腫瘍間質集団は、トレースさ列挙マーカー染色に基づいて特徴付けすることができる。1

概要

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組織の発生と修復を理解することは、創傷治癒、2,3再生医療、発生生物学および腫瘍生物学に参加して細胞成分の解明にとって重要である。修復の状況下では、多数の細胞型は、血管新生、ECM沈着、増殖および組織再構築を支援するために周囲の微小環境に浸潤する。細胞性因子および表現型マルチパラメータ、局在を同定することができる多重化マーカー、分化状態、調査微小環境内の細胞成分との相互作用に基づいて同定することができる。ここで、我々はマルチスペクトル画像化とスペクトルアンミキシング方法論が続き、この多色·多細胞移植モデルの典型例として、腫瘍発生について説明します。

腫瘍の進行は、A、増殖の増強が含まれるいくつかの買収能力によってマークされている多段階プロセスであり、、ntiapoptotic侵襲及び血管新生特性図4腫瘍の開発は、成長因子、構造マトリックス、血管網および免疫調節を提供するために、周囲の環境中に動員される非腫瘍細胞によって促進される。1,5,6この微小生息域は由来細胞からなる局所、隣接例えば脂肪などの組織、および血管および骨髄由来細胞1と遠隔の供給源。非腫瘍細胞取り込みの程度は、多くの場合、腫瘍の病期/グレードに対応する腫瘍からの需要に依存している。腫瘍微小環境の支援の役割を理解するためには、非腫瘍細胞集団の起源と分化能を理解する必要があります。

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プロトコル

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同系マウス骨髄移植（BMT）は、制度的IACUCプロトコルによって承認された（ 注：このプロトコルの成功は、マルチスペクトル解析の対象として任意の標識細胞タイプ（S）の利用を必要とし、下流の分析を容易にするためには、任意の遺伝性を利用することができますまたは安定な細胞性標識我々は任意の細胞、組織、または器官に被移植モデルに適用した研究が有用と認める移植として多くのユニークな標識された集団を含むことができることができることを示唆している。さらに、多標識セルラシステム例えば、ある種の病理学的状態の研究のための移植合併症を排除するように設計され、複数の系統制限された蛍光標識することができる集団を含有するトランスジェニックマウスで見られるもの。

  1. 致死的に四時間ドナー骨髄で再構成する前に、9.5 Gyの単回用量のBMTレシピエントマウスに照射される。 （BMT GFPの受信者は、生後6〜10週でな​​ければなりません）。
  2. クリッピングし、無菌手術用ハサミで後肢を露出させ、それをバック剥離する前に70％エタノールでマウスの毛皮を濡らす。仙腸関節の腸骨稜を含む足全体を削除します。ちょうど足首の上にカットして足を破棄して、徹底的に骨からすべての筋肉、靭帯、余分な組織を取り除きます。 PBS中の2％滅菌FBS（P​​BS-2）を使用して、23 G針で脛骨、fibiaと腸骨稜からのフラッシュ骨髄。 （BMTのRFPドナーは制度上の基準に従って犠牲にする必要があります。）

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結果

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我々のトランスジェニックBMTマウスモデルにおいて移植された腫瘍を分析するためにマルチスペクトル画像化技術を使用して、我々は、骨髄起源である腫瘍間質成分を識別することができる。初期BMTは、フローサイトメトリー（ 図1）により、移植後三週間確認された。同所は、BMTの生着確認が最初の腫瘍注射後6週間を切除し、ホルマリンで固定し、次のラベルのない卵巣腫瘍を注入した。パラフィン包埋腫瘍切片は<8μmのスライスに切断し、染色した。適切な単色コントロールスライドを背景自家蛍光のための1を含む各蛍光団のために作られました。 表1は、潜在的な種と2-7のパラメータの蛍光色素の組み合わせを含む。染色手順の後、画像はニュアンスカメラアタッチメントとニュアンスソフトウェアを使用して取得した。単色コントロールスライド（ 図2A）とのスペクトルライブラリを作成した後、我々はWEREできに対する「非混合」（抗体＃1）核DAPIおよび2他のマーカーと一緒にGFPの発現を示す撮影されたマルチラベル卵巣腫瘍切片の画像（抗体＃2と＃3）。以上のマーカーの（

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ディスカッション

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ここに、我々は腫瘍微小環境の骨髄由来間質成分を分析するために、多重化された細胞組成物のMIMicc - マルチスペクトル尋問として記述するマルチスペクトルイメージングのアプリケーションを記述し、しかし、この方法論や概念が複雑に構成する他の細胞要素を解読に適用することができこのような創傷治癒反応中または回生組織中に​​見られるような組織。これらの実験において、我々は、蛍光移植し、腫瘍微小環境内のホスト由来細胞からの骨髄由来細胞を区別するために、トランスジェニックマウスを利用するが、この技術は、任意のレポーター遺伝子標識された細胞の使用に向いている、遺伝子標識を発現する細胞に特に修正可能である、HA、FLAGタグ標識した細胞などを 11 -簡単なLacZを、グルクロニダーゼ、彼（6X）のように、免疫組織化学によって認識されています。

我々のモデルでは、次の移植されたマウスの犠牲は、腫瘍切片を処理し、細胞の起源を同定するための抗体で染色した。RFP +骨髄由来のドナーまたはGFP +宿主組織に由来する。 図2では.......

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開示事項

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FCM、CMB、およびELSは開示する競合とは何もない。

謝辞

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私たちは、博士からのディスカッション、指導·支援に感謝しています。マイケルAndreeff氏医学博士。、そしてジャレッドバークス博士号。 MDアンダーソンフローサイトメトリーおよび細胞イメージング基盤施設から。この作品は、FCMのための国立がん研究所（RC1-CA146381、CA-083639、R01NS06994、CA116199およびCA109451からの助成金によって部分的にサポートされていました。ELSも国防軍学科（BC083397）でサポートされています。

....

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
.2 μmフィルターフィッシャー09-740-35A
10mlルアーロックBD309604
25GニードルカーディナルBF305122
40nmフィルターBD352340
50mlコニカルチューブフィッシャー1495949A
アレクサー488-MS1ビトゲンA21121
レクサー594-RBinvitrogenA21207
Alexafluor 647-chInvitrogenA21449
BSASigmaA7906-500G
カバースリップCorning2940-243
CRI-NuanceCaliper Life Sciences
DapiInvitrogenD1306
DMEMCellGro10-017-CV
エタノールダルマコン4004-DV
FBSinvitrogen16000-044
GFP-ms1アブカムab38689
インスリン針BD329424
マレイン酸アクロス100-16-7
モイスチャーチャンバーボックスエバーグリーン240-9020-Z10
封入剤dakoS3023
ネイル硬化剤サリー・ハンセン2103
パップペンアブカムAb2601
ペン/連鎖球菌 L Glutinvitrogen10378016
Steril PBSinvitrogen14040-182
Trypsininvitrogen252000-56
ブロッキングバッファー <>
マレイン酸14.51 g
NaCl10.95 g
NaOHペレット(7.5pH)9+g
蒸留水250 ml
*2%BSA/2%FBSを含むブロッキングバッファー用の溶液に0.2%Tween-20を添加してください。攪拌してろ過します.
抗原賦活化バッファー:
Tris-EDTAバッファー
(10 mM Tris Base, 1 mM EDTA Solution, 0.05% Tween 20, pH 9.0)
Tris Base1.21 g
EDTA0.37 g
蒸留水1000ml(100mlで10倍、 50mlで20倍)
Tween 200.5ml
*RTで3ヶ月間、または4°Cで保存してください。C for longer
クエン酸ナトリウムバッファー
(10 mM クエン酸ナトリウム、0.05% Tween 20、pH 6.0)
三滴クエン酸ナトリウム (二水和物)2.94 g
蒸留水1000ml
HCl(pH6.0に調整)1N
Tween 200.5 ml
インア

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kidd, S., et al. Origins of the tumor microenvironment: quantitative assessment of adipose-derived and bone marrow-derived stroma. PLoS ONE. 7, e30563(2012).
  2. Quintavalla, J., et al.

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