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方法論記事

の適用

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DOI：

10.3791/50390

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2013年5月31日

 ,  , 
1Department of Bionanoscience, Kavli Institute of Nanoscience, Delft University of Technology

この記事について

サマリー

飢餓細胞（DPS）からDNA結合タンパク質は、細菌のストレスとの闘いにおいて重要な役割を果たしている。この記事での精製について説明 E.大腸菌の DPSとするためのプロトコル in vitroでアッセイは、活性酸素種による分解からのDNAのDPS媒介性保護を示す。

要約

酸化ストレスは好気性の生命の避けられない副産物である。酸素分子は、地上代​​謝に不可欠ですが、それはまた、生物内の多くの有害な反応に参加しています。生活のためのもう一つの重要な化合物であり、好気的代謝と鉄の組み合わせは、フェントン化学を通じてラジカルを生成し、細胞成分を分解するのに十分です。 DNA修復がはるか些細からそのままDNA分解は、間違いなく細胞内のラジカルを含むほとんどの有害なプロセスである。この記事で紹介したアッセイは、ラジカル媒介DNA損傷の分子と酵素の効果を測定し、可視化する定量的な手法を提供しています。

DNA保護アッセイは、タンパク質や化学物質の保護特性のin vitroでの特性のために、シンプルで迅速、かつ強力なツールです。それは有害な酸化反応にDNAをさらすと関心の化合物の種々の濃度を加算関与。化合物濃度の関数としてのDNA損傷の減少または増加は次いで、ゲル電気泳動を用いて可視化される。本稿では飢餓細胞（DPS）からDNA結合蛋白質の保護特性を測定することにより、DNA保護アッセイの手法を示す。 DPSは力強く環境ストレスに対抗するために300以上の細菌種によって利用されるミニフェリチンです。ここでは、DPS精製プロトコルとDPSによってDNA保護を評価するための最適化されたアッセイ条件を提示する。

概要

好気性生物は常にそれらのDNAだけでなく、他の重要な生体高分子を損傷する可能性が活性酸素種と競合しなければなりません。酸化的損傷の毒性を中和する一つの強力なツールは、飢餓細胞（DPS）からDNA結合性タンパク質である。飢えE.から1992年の発見以来大腸菌培養1、DPSは、細菌および古細菌2以上の300種で確認された。固定相の間のDPSの大量アップレギュレーションは、Eの最も高度に発現核様体関連タンパク質になります飢餓条件3、4アンダー大腸菌 。また、DPSは飢餓、高鉄濃度、UV光照射、熱ショック、および酸化ストレス5,6を含む多くの様々なストレスの間、細菌の生存率およびDNAの完全性の両方を維持することが示されている。

12モノマー、Wの安定したホモオリゴマー複合体へ構造的には、DPSは、自己関連付けHICHは、球状の中空シェルに組み立てる。 〜4.5 nmの全体の内部空洞は、小分子7の通過を可能に細孔を介して溶剤外部からアクセス可能であり、例えば鉄8石灰化などの金属を封鎖することができる。 DPSの保護効果は、非特異的DNA結合1、フェロキシダーゼアクティビティ、および鉄の貯蔵8を含むそのいくつかの生化学的活動から派生。

DPSの有益な生化学的な活動の詳細な研究では、最初にその精製を必要とします。 DPSは、だけでなく、他のタンパク質から分離するだけでなく、任意の結合したDNA 7からしなければならないとしてDPSの精製は、精巧な手順です。我々の最適化された精製プロセスは、2つのイオン交換カラムおよび硫酸アンモニウム沈殿工程からなる、多くの一般的な技術を使用する。高濃度のDPSが低塩条件下で溶液から析出ことができるように複数のバッファ交換が必要である。一度DPSタンパク質は、精製された、それは直接フェロキシダーゼ活性8、DNA結合化学量論9および10の鉄結合機構を測定するアッセイに適用することができる。精製されたDPSは、他の潜在的なアプリケーションを持っています。 DPSの安定した中空球状の構造は、12小説磁性ナノ粒子を合成するタンパク質キャビティ11内でも、反応室として疎水性粒子を格納するための足場として使用されている。

活性酸素種による損傷を媒介するDPSの防御能は明らかになり、直接DNA保護アッセイ13,14を用いて実証することができる。鉄はフェントン化学介してH 2 O 2分解を触媒するときに、このインビトロ手順において 、ラジカル種が生成される。これらのラジカルは直接反応に存在するDNAに損傷を与え、完全に高濃度で、それを分解することができます。 2つの重要なDPS活動は両方直接クエン酸フェンタニルの影響を打ち消すことが上の媒介ラジカル生産。 DPSは、プロセスで使用可能過酸化水素を消費し、石灰化触媒を介して鉄濃度を低下させる。さらに、DNAへの結合DPSは、潜在的にラジカルによるダメージから物理的にシールドと反応性の低い表面積の小さい容積にそれを凝縮することができる。これら二つの特性の組み合わせがよく、保護DPS活性を測定する目的に適したDNA保護アッセイを行う。

DNA保護アッセイは、非常に汎用性があり、DPS特性を越えて様々な用途に用いることができる。ラジカルによる損傷は、細胞内の応力の一般的な形態であり、多くの異なるタンパク質および化学物質は、それを打ち消すために使用される。ラジカルによる損傷のマーカーとしてDNAの完全性を用いたアッセイの一般的原理は、ほぼすべてのラジカル生成反応または反作用剤と組み合わせて使用​​することができる。中でも、アッセイは正常に抗酸化特性を決定するために使用されているK.の食品産業15で使用するためのカスミソウエキス、水酸基被害調停16日に尿酸の効果を特徴付けるため、そして毛皮転写調節蛋白質17の機能に新たな洞察を得るために。

論文におけるアッセイの多くの用途にもかかわらず、我々は初めて、多くの研究者のために不必要に骨の折れるプロセスについてのアッセイを設定するなりした、多くの最適化とトラブルシューティングの手順が必要であったことがわかった。我々はこの記事では、この議定書は、エントリのこの障壁を取り除くことを目指しています。

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プロトコル

1。 DPSの発現及び精製

高純度のタンパク質を得ることがDNA保護アッセイのための必須の最初のステップである。 DPSタンパク質の精製は、4〜5日で行うことができる。

  1. E.のプロテアーゼ欠損株を形質転換DPSタンパク質コード配列がクローニングされているにpETベクター（例えば、pET17など）を有する大腸菌 （例えばBL21（DE3）pLysSをなど）。
  2. ストリーク適切な抗生物質（例えば1.1で提供されていた例はアンピシリンとクロラムフェニコールなど）を含むルリア培地（LB）寒天プレートに細胞を変形させた。 37℃で一晩プレートをインキュベート℃に
  3. 適切な抗生物質を含むLB培地30ml中にプレートから単一コロニーを接種する。 200-250 rpmで振とうしながら37℃で一晩インキュベートする。
  4. 10ミリリットル一晩培養のそれぞれに適切な抗生物質を含む2×1 LのLB培地に接種。 OD 600に、振とうしながら、37℃で成長。 （著しく最終生成物の純度を損なうことなく、より高いODの増加、タンパク質収量に細胞を成長は）0.3mMの濃度になるようにIPTGを添加しDPSの発現を誘導し、振とうしながら37℃で3-4時間、インキュベートする。
  5. 15分間6,000×gで遠心分離により細胞を収穫。誘導細胞培養物1L当たりDEAE緩衝液A（50mMのHEPES-KOH、pH7.5の、100mMのNaCl、0.1mMのEDTA）、7.5 mlの細胞ペレットを再懸濁する。サンプルを液体窒素中で凍結し、必要に応じて、-80℃で保存することができる。手順は、次に4℃で水浴中でサンプルを解凍することによって継続することができる
  6. 過剰発現DPSの劣化を防止するために細胞懸濁液に、プロテアーゼ阻害剤（例えば、カルビオケムセットIIIプロテアーゼ阻害剤、細胞懸濁液1mlあたり0.167μlの時）の混合物を加える。
  7. フレンチプレスを使用した無細胞抽出液を準備します。 20ミリリットルDEAEバッファ（連続フロー·モデルを使用している場合）、その後disrupと総理はフレンチプレスT 20 KPSI二回サンプル。不溶性粒子を明確にするために4℃で35分間30,000 xgでライセートを遠心分離し、上清を保存します。必要に応じて上清を、液体窒素を用いて凍結させ、-80℃で保存することができる。
  8. FPLCを用いて、DEAEバッファーで30ミリリットルDEAEセファロースCL-6Bカラムを平衡化。背景の上に0.2 MPaで最大圧力1〜2 ml /分でカラムを通してバッファを実行します。カラムに無細胞抽出液をロ ​​ードし、OD 280シグナルがベースラインを超えて増加し始めたら、フロースルーを収集し始める。 DEAEバッファーでカラムを洗浄し、連続フロースルーを収集しながら、OD 280値は、ベースラインに戻るまで。フロースルーは、結合したDNAから無料DPSタンパク質の大部分が含まれているはずです。 100％緩衝液B（50mMのHEPES-KOH、pH7.5で、1MのNaCl、0.1mMのEDTA）でカラムを洗浄します。この溶出液は、DPS-DNA複合体並びに他のタンパク質を含有し、廃棄することができる。
  9. 広告を削除する硫酸アンモニウム沈殿を通じてditional混入タンパク質。プールされたフロースルーの音量を決定します。よく攪拌しながらゆっくり（10〜20分間かけて）4の62％飽和（溶液1mlあたり390 mg）を℃に乾燥小粒硫酸アンモニウムを追加します。完全な平衡を確保するために、硫酸アンモニウムの最後の部分を添加した後に、追加の20〜30分間混合物を攪拌する。混入タンパク質が溶液から析出する一方DPSは、可溶性のままになります。
  10. 4℃で30分間、20,000×gで遠心分離によって沈殿したタンパク質を除去°C、上清を保存する。
  11. 徐々に94％飽和に達すると完全に平衡を確保するために20〜30分間撹拌し、上清の1ml当たり227ミリグラムの追加の硫酸アンモニウムを追加する。 DPSと、この高い塩濃度で沈殿し、4℃で30分間、20,000×gで遠心分離によって回収することができるDPSは、ペレットになり、上清を廃棄することができます。ペレットを-80℃で保存することができる°CであればデIRED。
  12. 再懸濁バッファーでDPS含有ペレット（50mMのHEPES-KOH、pH7.5の、150mMのNaCl、0.1mMのEDTA）に再懸濁します。 2.5ミリリットルのサンプル量を調整します。
  13. 緩衝液交換は、PD-10ゲル濾過カラムを使用して、硫酸アンモニウムを除去した。 25ミリリットルの再懸濁バッファーでゲルベッドを平衡化。 PD-10カラムの一番上にDPSサンプル2.5mlのを適用し、それがフロースルーを捨てインチ浸ることができます。 3.5ミリリットルの再懸濁緩衝液で溶出することでDPSを収集します。
  14. °C任意の不溶性成分を除去し、6〜10ミリリットルの希釈緩衝液（50mMのHEPES-KOH、pH7.5で、0.1mMのEDTA）で希釈することを保証するために4℃で10分間、16,000×gで緩衝液交換サンプルを遠心塩濃度はDPSがSPセファロースカラムに結合するのに十分に低い。 DPSの特に集中したサンプルは、液体の濁りによって証明が、完全に小さな天羽の添加により再溶解することができ、低塩バッファーに希釈すると溶解しにくくなることがあります5 M NaCl溶液（追加10〜20 mMの）のNT。
  15. SPバッファーA（50mMのHEPES-KOH、pH7.5で、50mMのNaCl、0.1mMのEDTA）と30ミリリットルSPロースファーストフローカラムを平衡化。背景の上に0.3メガパスカルの圧力限界で1.5〜2ミリリットル/分でカラムに通してバッファを実行します。カラムにサンプルをロードします。ベースラインにOD 280トレース戻るまでSPバッファーで洗浄し、フロースルーを捨てる。 2ミリリットルの画分を収集しながら、0〜100％の緩衝液Bから150ミリリットル直線勾配を実行します。 10％の変動が可能ですが、DPSは、約50％Bでの鋭いピークに溶出します。
  16. 15％SDS-PAGEゲル上の溶出画分を実行し、分光光度計を用いてOD 260 / OD 280の比率を測定することにより、DNAの混入を確認してください。ゲルはわずか19 kDaの周り一つのバンドを示すべきであり、OD 260 / OD 280が 0.7典型的には約です。最も純粋なDPS画分をプール。と遠心フィルターユニット（例えばアミコンウルトラ濾過ユニットなど）を使用10K分子量がDPSを集中し、ストレージ緩衝液（50mMのHEPES-KOH、pH7.5で、50mMのNaCl）にそれを交換するためにカットオフ。アリコート精製DPSし、-80℃で保管するための液体窒素で凍結℃の

2。 DNAプロテクションアッセイ

アッセイは、複数の時間に敏感な手順が含まれますし、再現性のある結果を得るために、第二にタイミングを合わせる必要があります。非常に多くの食材やピペット操作関与している、ピペッティングの表は、（ 表1を参照）のステップとボリュームを追跡することをお勧めします。アッセイに必要な総時間は3つ以上の時間ではありません。

  1. 密閉バイアルに30ミリリットルの水を測定し、溶液から酸素を除去するために10分（2注射針、流体内の1つの、その上のいずれかを使用）をN 2で水を洗い流す。 2 mMのストック溶液を得るために、水に0.0168グラムのFeSO 4•7H 2 Oを追加します。バイアルを密封し、混ぜた後、より多くの5分間窒素でフラッシュします。ソリューションでなければなりません明確な、黄色のいずれかのヒントが検出可能であれば、新たな鉄の溶液を調製する。
  2. 100mMのH 2 O 2溶液（9.2MH 2の10.87μlの水1ml中にO 2）を作る;氷上に維持し、アルミホイルで包むことによって遮光。自発的崩壊に起因する製造後約1〜2時間のためにのみ使用します。過酸化水素株式は、部分的に適切な保管（暗闇の中で、4℃）することにより改善することがあり故障、同様に対象となります。 OD 240を測定することにより、ストック濃度の定期的なチェックをお勧めします。
  3. 室温の水浴中で急速にDPSの精製のアリコートを解凍し、氷上に保ち。沈殿凝集体テーブルトップpicocentrifugeで4,000×gで10秒間遠心します。分光光度計（OD 280 = 1.547 100μMモノマーDPSの濃度を示している）を使用して、遠心分離した後、濃度を測定する。
  4. 12倍反応バッファー（1を用いて高濃度在庫から線形DNAを希釈M MOPS-KOH pH7.0で、1 M NaCl）を100 ngの/μLの濃度に。直鎖状DNAを定量化を容易にするために使用されるが、プラスミドDNAを用いてもよい。
  5. PCRチューブにDNA緩衝液混合物のピペット1μlの。最終反応容積（マイナスSDS）を12μlのになるように反応に十分な水を追加します。この量は、ピペットテーブルを用いて予め算出されるべきである。 3μMの最終ドデカマー濃度にDPSを追加します。 DPSは、DNAに結合することを可能にするために室温で15分間インキュベートする。
  6. 所望の濃度に達するために十分なの2mMのFeSO 4水溶液を加える。典型的な実験では、0から1 mMののFeSO 4の濃度の範囲を使用しています。高い濃度は、より広範なDNA分解の原因となりますが、また第二鉄の形成反応混合物中に沈殿につながる可能性があります。迅速100mMのH 2 O 2溶液（10mMの最終濃度）を1μlを追加し、フェントンを可能にするために5分間室温でインキュベートする場所を取るために媒介分解反応。
  7. 20％SDS（ドデシル硫酸ナトリウム）の0.8μLを加える。ミックスとDPS-DNA複合体を混乱させるための5分間85℃でインキュベートする。 SDSは、DPS-DNA複合体を不安定と定量のしやすさを向上させるDNAに対する不要なゲルシフトを防ぎます。オプションのステップは、非毒性生成物に触媒的分解過酸化水素によって反応を停止することである。このプロトコルで記述された条件については、このステップは、DNA分解の広い範囲を取得する必要がない。
  8. 染料をロードする追加、1分間氷上でインキュベートし、アガロースゲルにロードします。ゲルを実行し、エチジウムブロマイドを用いたDNAのために染色。ゲルは、ゲル中のエチジウムブロマイドの配布に干渉するSDSを防止するために、ポスト電気泳動染色したのではなく、電気泳動の前になければなりません。

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結果

ここで説明DPSの精製プロセスは非常に再現可能である。 E.のL 2を用いて説明プロトコールに従って精製DPSと、出発点として、 大腸菌培養 、一般的に5〜12μMの濃度で12 DPSを含むタンパク質の2.5ミリリットルが得られます。長い誘導時間（4時間）は、このばらつきを軽減するように見える。 SDS-PAGEゲル（ 図1）から明らかなようにタンパク質の純度は99％以上で一貫している。 DNA汚染のレベルは、どちらのDNAおよびOD 260 / OD 280比について染色アガロースゲルによって証明、一貫して無視することができる。この値は変わることができますが、値は決して0.9を超えている、DNAの汚染レベルはよく5％を下回っていることを示している。

DNA保護アッセイの結果の再現性は、実行に大きく依存する。すべての成分の濃度を正確に測定している場合（特にタンパク質濃度ポストCENTRifugation）、およびサンプルのインキュベーション時間は...

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ディスカッション

この記事で説明したようにDPSの精製プロセスは非常に堅牢です。純度は一貫して（> 99％）高くなっている。他のタンパク質は、可視バンドとしてSDS-PAGEゲル上で表示されません。 DPSの非常に高い濃度でインキュベートしたときに、部分的DNA分解によって証明されるようにもかかわらず、いくつかの精製されたDPSバッチは、ヌクレアーゼ活性を有するように見える。これは、我々が浄化を通じて取り除くことができなかったことが、低濃度で高活性DNアーゼの存在を示している可能性があります。しかし、このDNA分解は、典型的には、 インビトロアッセイに使用されない濃度で観察されているので、通常は問題とならない。

この記事で紹介したようにDPS精製プロトコルは、いくつかの長所を持っています。タンパク質はアフィニティータグである必要はありませんので、機能に干渉する可能性は存在しません。精製されたタンパク質は、DNAフリーですので、in vitroアッセイ DNA結合特性が苦しむことはありませんが関与汚染の可能性のアーティファクトから。最後に、精製されたDPSは、...

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開示事項

我々は、開示することは何もありません。

謝辞

我々は有益な議論のためのMichelaさんデ·マルティーノ、ウィルフレッドR.ハーゲン、そしてKourosh Honarmand Ebrahimiに感謝しています。この作品はデルフト工科大学からの資金調達を起動によってサポートされていました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
BL21(DE3)pLysS コンピテントセルPromegaL1195
pET-17b DNAEMD-Millipore69663-3
LB ブロスパウダーSigma-AldrichL3022
アンピシリンナトリウム塩Sigma-AldrichA0166
クロラムフェニコールSigma-AldrichC0378
IPTGSigma-AldrichI6758
HEPESBDH441476L
水酸化カリウムメルク105033
塩化ナトリウムVWR443824T
EDTASigma-AldrichE9884
プロテアーゼ阻害剤カクテル セット IIIEMD-ミリポア539134
DEAE-セファロースSigma-AldrichDFF100
アンモニウムSigma-AldrichA4418
PD-10脱塩カラムGEヘルスケアLS17-0851-01
SP-セファローSigma-AldrichS1799
Amicon Ultra Centr.フィルター (10K MWCO)ミリポアUFC901024
硫酸第一鉄七水和物Sigma-AldrichF8048
過酸化水素溶液Sigma-Aldrich216763
MOPSCalbiochem475898
SDS 溶液バイオ・ラッド161-0418
臭化エチジウムSigma-AldrichE1510
静的インキュベーターHettichINE500
Shaking Incubator New Brunswick Sc.Inova 44
冷却遠心分離機Beckman CoulterAvanti J-E
卓上遠心分離機Eppendorf5424
細胞破壊器Constant Systems Ltd.TS2/40/AA/AA
FPLC 清浄機ゼネラル・エレクトリックAKTA
気密バイアルコール・パーマーEW-08918-85
シリンジ針BD305128
ピペットエッペンドルフZ683779-1EA, Z683795-1EA
硫酸ス

参考文献

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