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DOI:

10.3791/50409

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2013年7月6日

 ,  ,  , 
1ImmunoRhumatologie Moléculaire, INSERM UMR_S 1109, Centre de Recherche d'Immunologie et d'Hématologie, Université de Strasbourg

この記事について

サマリー

新生児のヒトサイトメガロウイルス（HCMV）感染症は、精神遅滞の重要な原因を表し、まだウイルス誘発病因につながる分子事象はまだよく理解されていない。脳の感染症のダイナミクスを調べるために、我々は全体の動物の適応イメージングルシフェラーゼ組換えウイルスに感染した新生児の経時的分析を実行する。

要約

ヒトサイトメガロウイルス（HCMVまたはHHV-5）は、免疫低下個体における生命を脅かす病原体である。先天性または新生児感染すると、ウイルスが難聴と精神遅滞を含む重篤な神経学的損傷を誘発する可能性がある、発達中の脳に感染し、複製することができます。症状の潜在的な重症度にもかかわらず、治療の選択肢は、ワクチンと特定抗ウイルス療法の有無を利用できないことによって制限されます。観測は主に感染した子供の剖検に由来するため、また、中枢神経系（CNS）の感染の間に発生する分子事象の正確な記述がまだ欠けている。このようなアカゲザルCMVなどのいくつかの動物モデルは、CNSにCMVの病因に重要な洞察力を開発し、提供されている。しかし、人間とその進化の接近にもかかわらず、このモデルは動物や短所を感染させるために使用頭蓋内接種法によって制限されていたistently CNSの感染症を誘発する。さらに、倫理的配慮は、マウスサイトメガロウイルス（MCMV）と生まれたばかりのマウスの新生児の感染は、最近大きな進歩につながっている、そのうち、別のモデルの開発を推進してきました。例えば、それをBalb / cの新生児にMCMVを腹腔内注射は、脳の特定の領域におけるニューロンおよびグリア細胞の感染をもたらすことが報告された。これらの知見は、マウスの実験的な接種が子供でHCMV感染によって誘導される赤字を繰り返す可能性が示唆された。それにもかかわらず、新生児のMCMV感染の動的解析は、古典的な手法は、ウイルス負荷および/または免疫関連のパラメータを分析するために異なる時点で動物はかなりの数の犠牲を必要とするため行うことは困難である。このボトルネックを回避するために、希少変異動物の将来の調査を可能にするために、我々はビラの経時的解析を実行する生体内画像化技術に適用C57BL / 6新生児にルシフェラーゼを発現する組換えMCMVの末梢注射時の脳内リットル普及。

概要

ヒトサイトメガロウイルス（HCMV/HHV-5）は、β-ヘルペスウイルスファミリーのメンバーである。 HCMVは、通常、無症候性感染1は早く生命の間に取得された高度に普及している、日和見病原体である。すべてのヘルペスウイルスと同様に、HCMVは、免疫システムしっかりウイルス複製を制御するホストの全生涯にわたって持続します。ウイルスの再活性化のエピソードはほとんど移植患者は、移植片拒絶反応2を防ぐために薬を受け取るなど、免疫不全の人に起こる。成人では、HCMVも神経膠芽腫3にリンクされています。さらに、HCMVは未熟免疫4-6と新生児のための著名な病原体である。発達中の胎児や新生児に初感染は深刻な結果を持つことができます。 HCMV感染症は先進国では先天性先天性欠損症と小児疾患の最も一般的な感染原因となっています。なお、新生児HCMV感染症の発生率は0.5から1パーセントプレーヤーに影響を及ぼしていると推定されるfは5〜10％がこのような小頭症や小脳の形成不全などの重篤な症状に悩まされますそのうち全て出生。また、無症候性ウイルス感染と感染児の10％が後損失、視覚的な欠陥や発作、てんかん7,8を聞いて 、精神遅滞につながる後遺症を開発する。

として注射9の異なる経路を経由してマウスに接種することができるような単純ヘルペス1（HSV-1/HHV-1）などの他のヒトヘルペスウイルスとは対照的に、サイトメガロウイルスの複製は種特異的である。この機能は、厳しくHCMVの異なる動物モデルで行われ病因（マウス、ラット、モルモット、アカゲザル）とそれぞれの本物のホスト固有CMVsの調査を妨げている。すべてCMVsは、ゲノムサイズと組織、組織親和性および遺伝子発現の調節の有意な類似性を示す。彼らはまた、それぞれのホストで同じような病態を引き起こす。ゲノムの多様性にもかかわらずであるトゥイーンHCMVおよびマウスサイトメガロウイルス（MCMV）（ORFの50％マウスCMVにおいて識別されるヒトウイルス中に存在する）は、マウスモデルは、最近ほとんど変異株は、ウイルスを制御する能力について試験することができるので、有利であることが証明されているin vivoでの複製。これは、このウイルスは、10〜 "resistome"を構成する成虫期で発現するマウス遺伝子の数の推定を可能遺伝学的スクリーニングにつながっている。要するに、これは、MCMV-感染マウスは、成人におけるホストウイルスの相互作用の研究のための魅力的なモデルを表して示している。人間とマウスの間に胎盤層組織の違いは、マウスにおけるウイルス感染の母に胎児伝送を損なうため、先天性CMV感染症の調査はより複雑です。最近では、妊娠12.5日に胎盤におけるMCMVの直接注入は、減損11聴力につながったマウス新生児の脳の感染を可能にしました。しかし、ほとんどの一nvestigationsは現在、潜在的に血行性脳の感染症につながる全身ウイルス普及、頭蓋内注射に比べてより関連性のあるモデルを提供するために4-20 HR-古い新生児の腹腔内注射を使用しています。このプロトコルは、CMVの病因に重要な洞察を提供し、より具体的には、マクロファージ12のような単核細胞で浸潤される炎症病巣部に位置ニューロンおよびグリア細胞におけるウイルス複製における新生児の結果とMCMV感染を実証した。このレポートには、減少粒状ニューロンの増殖と遊走と複数インターフェロン刺激遺伝子の誘導を伴う小脳の変化した形態形成を説明しました。中枢神経系におけるMCMVを制御するためのCD8 + T細胞の本質的な役割についても同じグループ13によって報告された。微生物の病理学的効果を分析する際に考慮すべき重要な側面は、感染のダイナミクスですイオン。 MCMVの場合には、将来の神経生物学的傷害の大きさを理解し、予測するために、発達中の脳へのウイルス伝播の進行を探索し、定量化することが特に重要である。伝統的に、感染の進行の定量化は、感染した動物の定期的な犠牲を、そうでなければアクセスできない脳などの組織中の病原体を、滴定する必要があります。プロトコルのこのタイプは、今必要な動物福祉の向上と3Rの（交換して、絞込み、リデュース）原則14によって挑戦されています。 生体内画像化技術において使用したインビボの感染実験において必要とされる動物の数の大幅な削減を可能にすることができる。ここでは、報告し、マウス新生児への腹腔内MCMVリュック·注入時に脳内にウイルスの普及の経時的分析について説明します。同じ動物を使用して、我々は強烈なVIのサイトを追跡し、 生体内で監視2週間の期間中にRAL複製。

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プロトコル

1。ウイルス懸濁液の調製

  1. ウルリッヒKoszninowskiの研究室からMCMV表現ルシフェラーゼのスミス株（MCMVリュック·15）を入手します。この組換え体では、ルシフェラーゼ遺伝子がゲノムのMCMV IE2遺伝子座に挿入されている。
  2. MCMV-リュックを増幅するために、16（MOI、0.001〜1）感染症の異なる多重度MCMVとマウス骨髄ストローマ細胞株（M2-10B4、ATCC＃CRL-1972）を感染させる。このために、37℃で無血清培地中で培養細胞にウイルスを加える℃で1時間後、上清を除去し、DMEMと交換し、10％ウシ胎児血清（FCS）を補充した。 5日後、さらに使用するまで-80℃で培地や店舗アリコート°Cを収穫。
  3. プラークアッセイによるウイルス懸濁液の滴定。
    1. ペニシリン（200 IU / ml）とsteptomycin（200 mg / mlのを含む10％FCSを添加したDMEM 1ml中24ウェルプレートに40,000細胞で/ウェルで3T3細胞（ATCC＃CRL-1658）スプリット）と37℃で24時間インキュベートする℃に
    2. DMEMでMCMV懸濁液のアリコートを連続希釈（10 -1〜10 -8）を準備し、細胞培養培地を除去した後、希釈液200μlで標的細胞（3T3）感染。 37℃で1時間インキュベート℃にトップ培地1 mlを加える（DMEM 3％FCS、2％（v / v）のゲンタマイシン、200 IU / mlのペニシリン、200 mg / mlのストレプトマイシン、8グラム/ Lカルボキシメチルセルロース）および37℃で5日間インキュベート℃で
    3. 各ウェルに200μlの10％ホルムアルデヒド（水で希釈ホルムアルデヒドの毒性吸入を避けるために、化学フード内で行われるべきである）を添加し、室温で6時間インキュベートすることによって、細胞を固定する。アウトピペットで培地+固定具を外し、200μlの細胞染色溶液（20％エタノール中1％のクリスタルバイオレット（重量/容量））を加える。使用前に、9部ミリQ水で1パートを希釈する。室温で2分間インキュベートし、水に浸して3〜4倍皿を洗う、双眼鏡とのプラーク数を乾燥し、カウントすることができます。
    4. <李>50μlの50 PFUsを取得し、さらに使用するまで氷上に残すためにDMEM中MCMV-リュックを希釈。新生児は、生後2〜3週間に到達する前に、より高いウイルスの接種を使用すると、致死を誘導する。我々の経験では、500 PFUsは注射後ごと新生児5〜7日で致死性を誘発する。

2。新生児の注射

  1. 新生児（4〜20時間齢のマウス）は母親にストレスと仔の拒絶反応を引き起こすであろう、 "外国の"匂いによる汚染を避けるために慎重に子犬を取り扱う前に手袋とゴミとケージの糞を操作し、利用可能な場合。
  2. 図1Aに示すように、インスリンシリンジ（29 G）を用いて腹腔内注射を行う。背部皮膚で新生児を保持します。腹側を上にして、前肢の下に針を導入し、優しく腹腔を（臍下少し）達成するために皮下に押し込みます。我々は現在DPBSで希釈し、1％メチレンブルーを注入し、pに生存を監視ウイルス感染を行う前にractice手法。メチレンブルーは、射出プロセス中にはっきりと見えているので、我々は腹腔内ウイルス懸濁液の適切な配信を保証するために、最初にこの "訓練"注射を行うことをお勧めします。
  3. ケージに新生児バックを発生し、配置することがあり小さな血滴をなくす。

（3） 生体内イメージングで

  1. 7日目に、同じように、前述の注意と新生児を扱う。各動物に50μlの腹腔内麻酔薬の混合物（4 mg / mlのケタミン、0.8 mg / mlのキシラジン）とルシフェリン（0.15ミリグラム/ gの体重）を注入。動物の平均体重は1〜2 gおよび麻酔あたり動物の用量です：ルシフェリンは排出の最大に達するまでケタミン40μgの、キシラジン8μgのは12-15分待ちます。これは、事前に決定されなければならないとルシフェリンプロバイダおよび使用される撮像システムに依存する。
  2. 子犬はanesthetiですがゼット、将来の識別のためにそれらをタグ付けし、変異動物が使用される場合、将来の遺伝子型決定のために使用することができる組織の小片を収穫。
  3. イメージングシステムで子犬を置き、全身から放射される光の買収を行う。七日間感染後、ウイル​​スは、肝臓、腎臓、肺や唾液腺などの標的臓器に多数のコピーに複製されているので、露出の期間は短くする必要があります。我々のケースでは、我々は10〜20秒（ 図1B）の取得を行う。撮像装置の取得室内のプラットフォームを麻酔した動物の体温の過剰な冷却を回避するために加熱する必要がある。また、買収の1ラウンド内のいくつかの動物の低解像度の画像を得るために有用である、その後、特定の動物や孤立臓器次郭清の一部に集中するために、プラットフォーム近いカメラレンズまで移動。ソフトウェアには、急速な変化を有効にする必要がありますパラメーター（露光時間、距離サンプル/レンズ、高感度）、関心とスナップショットイメージの将来の輸出の定義された領域の定量。
  4. 頭だけから光信号を取得するために、高いウイルス複製が発生した臓器のレベル（肝臓、肺、唾液腺）で放出された光子をマスクし、実行します厚い、濃い紙で横方向に横たわっている新生児の体をカバー5〜10分（ 図1C）の取得。同じ条件での動物の対向側の買収を実行します。
  5. ケージに子犬を再導入し、麻酔新生児の過剰な冷却を避けるために、上部の加熱ランプを配置。定期的にポスト麻酔回復を監視します。指示された用量で、麻酔は、現在30分続きます。
  6. 日9、11と14で同じ手順を繰り返します。日11と14日、麻酔薬の用量（6 mg / mlのケタミン、1.2 mg / mlのキシラジン）を変更。

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結果

代表的な実験は、 図1に示されている。 MCMV-リュックの50 PFUs（パネル針の皮下経路を可視化するためにメチレンブルーで行われた同様の注射を示しています）の腹腔内注射すると、新生児は麻酔し、同時にルシフェラーゼ基質（ルシフェリン、キャリパー）0.3mgのを受けた。 15分後、動物をIVIS 50の取得室（生体イメージングシステムでは、キャリパー）の腹側を上にして配置され、全体の動物から放出された光は、10秒露光中にキャプチャした。パネルBは、分析のための専用のスナップショット7日に撮影された画像、9、11および14ソフトウェアと（リビングイメージ3.2、キャリパー）を示しています。画像は、同じ設定で較正した：最大発光は10 7秒当たりの光子（π/秒）及び10 6で最小π/秒に設定されている。これらの写真から、それは全体の動物の中で全体のウイルス力価は時間の経過とともに減少することが表示されます。の定量化同じソフトウェアを用いて行っ発光がこの観察を確認する（図示せず）。次に、例えば肺、肝臓、腎臓、デジタルカメラで検出される唾液腺などの臓器によ...

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ディスカッション

マウス新生児にMCMV-リュックの普及を監視する生体イメージング技術で使用して、我々は、野生型とは対照的に、変異動物の脳にウイルスの拡散を観察することができました。脳の動物とex vivoイメージングのさらなる切開は、中枢神経系における発光ウイルスの存在を確認した。さらに、我々はまた、MCMV E1初期タンパク質に特異的な抗体と脳薄切片上（図示せず）免疫組織化学を行い、実際に、MCMVは、発光が検出されたものと同じ領域中に存在することが観察され、従ってと巨視的な視覚化を示す全体的に、生きて麻酔した動物によって放出された光は、実際に生体内で発生するウイルス感染の特徴を反映している。

このような分析は、広く発光細胞の移植により腫瘍増殖をモニターするために、例えば、成体動物のために使用されている。我々のケースでは、課題はneonaを使用することでした買収室内動物に配信イソフルランと気体の麻酔は、技術的な理由で不可能であったためにTES。したがって、私たちは、ケタミン/キシラジン注射を使用することを余儀なくされ、我々は...

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開示事項

著者らは競合する経済的利害関係を宣言しません。

倫理声明

動物は、学院のd'ImmunologieエトHématologieの動物のケア施設で無菌条件下で維持された。マウスと実験手順の処理は実験動物の保護のためのフランスの法律に基づいて実施された。手順は、承認番号、67から345の下にサービスvéterinaireデラ県デュバラン（フランス）により承認された。

謝辞

私たちは、ウイルス学研究所の動物施設を使用するための許可をMCMV·リュックとトーマスBaumert（INSERM U748、ストラスブール）を増幅し、滴定のためにリーTuddenham（IBMC、ストラスブール）に感謝。 INSERM、大学·デ·ストラスブールと通信社国立·デ·ラ·ルシェルシュ（ANR-08-MIEN-005-01）からの財政支援が認められている。彼らのマスタープロジェクト間にソニアBeroudとレティシアLelieurの初期の参加も認められている。

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材料

Equipment
この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
試薬/材料
DMEMフィッシャーサイエンティフィックW3523A
メチレンブルーシグマ アルドリッチ319112
インスリン針VWR613-4897
ケタミンCentraVetKet 201
キシラジン/ベトラナルシグマ アルドリッチ46995
DPBSDUTSCHERP0436500
LuciferinCaliper760504
gentamycinSigma AldrichG1272
ペニシリン/ストレプトマイシンGibco15070
カルボキシメチルセルロースSigma AldrichC4888
ホルムアルデヒドSigma AldrichF8775
クリスタルバイオレットシグマ アルドリッチC3886<
IVIS 50キャリパー/パーキン・エルマー
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参考文献

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