フライ：ハエにアルコールを管理

サマリー

ショウジョウバエは、アルコールに対する行動反応の細胞および分子基盤を解剖するための重要なモデル系として浮上している。ここでは、簡単に他の実験に適用することができ、学部、研究に適してい概日文脈におけるアルコール感度データの収集のためのプロトコルを提示する。

要約

ショウジョウバエ（ ショウジョウバエ ） は 、アルコール研究とサーカディアン生物学の両方のために確立されたモデルである。最近、我々は体内時計がアルコール感受性ではなく、耐性の形成を調節することが示された。ここでは詳細に我々のプロトコルについて説明します。アルコールはフライバーを使ってハエに投与される。このセットアップでは、飽和アルコール蒸気が設定割合で加湿された空気と混合され、同時に4本のチューブ中のハエに投与する。ハエは、反復間の変動を最小にするために標準化された条件下で飼育されている。異なる遺伝子型又は治療の三日齢のハエは、好ましくは、直接比較を可能とする2つの異なる時点（ 例えば 、CTおよびCT 17 5）のハエを照合することによって、実験に使用されている。実験中、ハエはアルコール蒸気と反射（LORR）を立ち直りの損失を示すハエの数が予め決めパーセンテージに1時間さらされているか、SEDATIONは5分毎にカウントされます。データは、3つの異なる統計的アプローチを用いて分析することができる。最初は、ハエの50％が彼らの立ち直り反射を失い、有意差が時間点の間に存在するかどうかを決定するために分散分析（ANOVA）を使用していた時刻を決定することである。二つ目はANOVA分析に続いて、指定した時間（分）、後にLORRを示し割合ハエを決定することです。最後の方法は、多変量統計を使用して全体の時系列を分析することである。プロトコルはまた、遺伝子型間の非概実験や比較のために使用することができる。

概要

キイロショウジョウバエこの薬^2,3に対する人間の応答に類似して、アルコール¹に対して二相性の行動反応を示しています。 、および鎮静（応答における運動活性の完全な欠如：アルコールの低濃度への初期暴露されると、運動協調性の欠如、姿勢制御の喪失と立ち直り反射（LORR立ち直り反射の消失）に置き換えられ、展示増加自発運動を飛ぶアルコールへの暴露のような）機械的刺激には^4-9進行する。内因性の概日時計は、マウス^10,11、ラット¹²で観察されたように、アルコール感受性と毒性の強い変調器であり^、13の人間。 ショウジョウバエ研究の最近の進歩により、体内時計が急性アルコール感受性ではなく、アルコール耐性^1を変調を示している。突然変異体の研究と空間のトランスジェニック操作によりショウジョウバエで利用できる強力な遺伝的アプローチおよび時間的な遺伝子発現は、複雑な動作の基礎となる細胞および分子メカニズムを識別するの急速な進歩を可能にするシステムを提供する。調査ツールとしてのショウジョウバエの使用が急速に哺乳類^14〜16に変換することができ、アルコール神経生物学を理解する上で実質的な進歩を可能にした。概日時計は、アルコール感受性を調節する分子メカニズムを介しての理解を容易にかつ均一に概日時点横切っ行動応答、暗赤色光の条件下で使用するのに適したアルコール投与プロトコルを測定するために必要とされる。 ショウジョウバエでは、アルコールは、慢性的暴露、または確実に急性曝露のための蒸気の形で、アルコールを投与通る食物の補給を介して投与することができる。ここでは、ロス·オブ·正向反射^（LORR）1の概日調節の評価のための適切なアルコールの管理プロトコルを記述するだけでなく、鎮静。

一定の温度で12時間LDサイクル、その後、実験の質問に応じて2〜5日間、制御された光政権に転送：ハエは12時間に同伴されています。ハエは、フライバーとして知られている装置でエタノール蒸気にさらされている。この装置では、空気の制御された量は、水及びアルコールにバブリングされ;蒸気は、次いで、バイアルハウジングハエに混入し向けられる。ハエ分ごとに5は反射神経立ち直りや鎮静になっている表示されない番号を記録する。各時点についてLORRパーセンテージは概日時間ポイント間又はハエの株の間で計算され、比較される。行動分析のオプションと組み合わせるフライバーアルコール配信を使用してアルコール配信のシンプルさと信頼性は、暗い条件下で実施概日の実験のための重要な利点を提供します。

プロトコル

フライの1。組み立て

根拠と概要：システムがハエにアルコール蒸気の制御された割合を管理するために設計されています。注： 図1は、フライの概略図にセットアップ三段階（アルコールと水のボトルの空気流、セットアップのアセンブリ、および観察バイアルの組み立て）は、以下に記載されるように提供する。要するに、安定した空気流は、それぞれ、アルコールと水を通して泡立て混合し、4観測バイアルに投与される2つの画分に分割される。

1. エアフローの組み立て
   1. Yコネクタを使用した一貫性のある空気の流れや分割を生成するために、建物の空気や水槽の曝気装置のいずれかに柔軟なシリコンチューブの短い部分を接続します。システム（4観測バイアル通常千ミリリットル/分）を通過する空気の総量をコントロールし、空気流量調節器への最初の分岐を接続します。
   2. 第二の管にクイックコネクタを挿入します空気流は、較正された空気の流れに影響を与えることなく、実験の開始時に中断することができる。 Yコネクタを追加し、気流調整器に、各分岐チューブを接続してください。
   3. 気流規制当局にチューブを接続し、2気流メーターを接続します。
2. アルコールと水ボトルのセットアップ
   1. 気流メートルの出口にフレキシブルチューブを追加し、チューブのそれぞれの長さの端部に90°曲げて細いガラス管（1ミリリットルのガラスピペットの各セクション）を挿入します。これは、水とアルコールのボトルへの入口空気流となる。
   2. アルコールと水で満たされたボトルにそれらを介して2穴にゴム栓を配置します。水浴を用いて周囲温度よりも高い一定温度2℃の両方のボトルを保管してください。水浴は27℃である間に我々の実験では、環境室を25℃に維持されている
   3. Aのストレートガラスピペットを挿入赤外線は、ゴム栓を介して入口とボトルの底から約1cmまでの流体中に延びている。
   4. ガラスの終わりはボトル内部ストッパーの下部と同じ高さになるまで、ゴム栓に残っている穴にガラスピペットの肘部分を挿入します。チューブのもう一つの長さが、この空気出口を挿入します。
   5. Yコネクタを使用して空気の流れを再結合し、2ツ穴ゴム栓を通して挿入曲げガラスピペットのセクションで空の混合フラスコやボトルを通る空気の流れを導くようにシリコンチューブの別の長さを使用しています。コンセント混合気流のためのシリコンチューブの別の長さを使用しています。
3. 観測バイアルの組立
   1. 複数の観測バイアルを各実験で使用できるように、空気の4または8より小さいストリームを得るために混合し、フラスコ2〜3倍から出てくる出口空気流を分割する。観察用バイアルへの柔軟なシリコンチューブを接続します。
   2. observatiを設定ガラス管は、アルコール蒸気のための入口および出口を提供する介して2つの孔を含有するゴム栓で密封し、空のバイアルを使用してバイアルに。
   3. ネッティングを有する第1のガラス管の端部を覆い、可撓性プラスチックチューブの小片を用いて所定位置にネッティングを保つ。それはバイアルの約半分の長さに伸びるまで、第1の穴を通って、このチューブを挿入します。必要に応じて、ぴったりとフィットを取得するためにテフロンテープを使用しています。
   4. それはゴム栓の内側の端と同じ高さになるまでネッティングでカバーの端にも第2のガラス管を挿入します。
   5. 暗赤色光条件下でハエとのコントラストを最大にするために白い紙の上に水平にバイアルを置きます。
   6. 気流の適当な画分を混ぜてアルコールに吹き込んや気流が水に吹き込ん。継続的に空気圧を監視し、空気流の所望の混合を維持するために必要に応じて調整を行う。
      注：連続運転小さな部屋で、平行または単一のアッセイで複数のフライバーアッセイのアルコール蒸気の顕著な蓄積につながることができます。潜在的に密閉された部屋で研究者に影響を与える可能性があり、アルコール蒸気の継続的なリリースを避けるために、適切なシステムが適切に実験中に生成されたアルコール蒸気を取り除き場所に置かれる必要がある。 、アルコール蒸気を除去し、各バイアルから突出する第2のガラス管にチューブの6-12インチのピースを接続し、それらをバンドルし、漏斗真空システムに向けるために。研究者はまた、実験的な試験室が適切に換気されていることを確認する必要があります。

実験動物の2。準備

根拠と概要：適切な文化やハエのハウジングは、データのばらつきを減らすことができます。これは、ハエが経験したストレスの標準化と最小化によって達成される。そのため、全く麻酔（CO ₂または代替）がドゥリを使用しないNGプロトコルの次のステップのいずれか。さらに、ハエは、年齢は学習と記憶の実験¹⁷を含む他の行動の分析のための標準である可変性を最小限にするために、実験および時点間で一致させる必要があります。

異なる光：暗い場所では、エタノールに対する行動応答した体内時計の機能を調べるために使用することができます。日周リズムが存在するかどうかを判断するために、実験は、特定のZeitgeberタイムズ（ZT）での性能を測定するために定義されたLDサイクル下で行うことができる。 ZT 12時間点灯が12時12分時間のLDサイクルでオフになっている間、ZT 0は、夜明けを表し、LDサイクルの下のライトの時間として定義されます。一定の条件下では、概日時間（CT）は、環境シグナルの非存在下で動物のための時間を計測する、すなわちフリーランニング時間、および前のLDエントレインメントサイクルに関連している。野生型のショウジョウバエでは、CTは、最初の数日の前のZTを反映している一定のフリーランニング概日期間などの条件やリズム中のSは、〜24時間である。暗サイクル実験前に恒暗条件（DD）に転送：概日変調を測定し、行動に急性光の影響を排除するために、ハエは光に連行される。概日の実験は、特定の概日時間（CT）でのパフォーマンスを測定するために、DDの二日目に行われる。

ショウジョウバエでは、連続光（LL）の条件は、不整脈自発運動^18〜21と不整脈短期記憶¹⁷によって証明されるように概日コア概日遺伝子の湿らまたは廃止分子振動機能障害や行動概日リズムの崩壊につながる。プロトコルは、概日試験のために最適化されており、他の実験のために簡略化することができる。チューブから12インチで使用される小型の赤いライト;すべての概日の実験は、暗赤色灯（周囲オーバーヘッド赤色光<作業台の上に1ルクスを使用して実施している〜1ルクス光）。

1. 暗い巻き込み条件（LD）：12時12時間の光の下で25℃、リアはハエ。
2. 1日目の日、明期の終わりに新鮮に孵化ハエを収集し、食品の粘着性を最小限に抑えるために、高濃度の寒天食品の少量を含むバイアルを保持している中で、LDの条件で24時間保管してください。注意：ヘルシー、正常に発達ハエを収集するようにするには、羽化が培養瓶の中に開始された後、最初の日以内に収集されたハエを使用しています。
3. （25〜35）は、約30のバッチを集めて光の期間の終わりに向かって2日目に吸引器を使用して飛行する、新鮮な保持バイアルに移す。
4. バイアルの遠端にハエを指示するために、強力な光源を使用してください。行動観察は、各実験の終わりに計数ハエの総数のパーセンテージで報告されるように、この範囲内で、各バイアル中のハエの正確な数は重要ではない。
5. 25°CのFOで、DD条件下でのハエを維持2日間R。
6. 実験の日に、さまざまな条件や実験前に少なくとも1時間室温での実験的な行動の部屋以外の保育器に収容されたすべてのハエを置く。順化は、温度や湿度の変化に変動性を低減します。
7. 行動の概日調節を試験するための6日目の時点（CT 1、5、9、13、17および21）で観測を行う。
8. 実験設計のロバスト性を増加させ、単一の実験に特異的な可変性を最小限にするために行動実験の単一のセット内の複数の時点を比較する。逆の明暗スケジュールの二つのインキュベータを同調するために使用される場合、例えば、CTおよびCT 13 1の観察とを同時に得ることができる。
   注：上記の手順は、一定の暗さの概日の条件で実施したアッセイのための実験動物の調製を記載する。別の明：暗条件は、時計の機能をプローブするために使用することができるアルコールに対する行動反応中。日周リズムが実験は、特定のZeitgeberタイムズ（ZT）での性能を測定するために、LDサイクル下で行うことができる存在するかどうかを判断する。さらに、プロトコルは、概日機能障害を試験する実験のための一定の光条件下で飼育ハエと共に使用することができる。光条件に収容されたハエをテストする別のプロトコルのために、行動アッセイは、まだ暗い条件下で実施されるべきである。ハエは、行動上の光の急性影響に対する行動のばらつきを最小化するために実験前に1時間、暗所に移送しなければならない。

3。行動観察

根拠と概要は以下のアルコール投与プロトコルは、暗赤色灯の条件下での観察に最適化されています。 2行動対策LORRと鎮静フライ酩酊2つの異なる点を表す。 LORRは、損失Oを組み込む酩酊の遅い点を表すFモータや姿勢制御、中毒の鎮静措置に対し、非常に遅く、終点。遺伝子型または概日調節が異なるこれら2施策に影響を与える可能性があり;従って、一方は両方を検査したい場合がある。要するに、ハエがバイアル中にロードされ、LORRを表示するハエや鎮静の数は、アルコール蒸気暴露中に5分ごとに記録しており、実験終了時にカウントされたハエの総数。

1. 実験を開始する前に、少なくとも10分間（空気は水とアルコールのボトルを通してバブリング）システムを介して空気を実行し、気流を較正するためにその時間を使う。
2. 空気の流れを停止するクイックリリースを外します。バイアル中にハエをロードし、空気の流れを再接続し、タイマーを開始します。注：応答しないか死んハエ、ハエ、保持バイアル中に残っている場合、これはストレス条件の指標とすることができる。一般に、これらの条件は、保持バイアルに少ないハエを収容又は僅かなを用いて食品の粘着性を減少させることによって緩和することができる調理中のLY高い寒天濃度。最適な行動解析と実験の間の最小の変動のために、ハエは実験前に、健康でなければなりません。
3. 正確な時間管理のために、アルコール暴露の総時間を追跡し、5分間隔をマークするために第2カウントバックタイマを使用する1つのタイマーを使用。
4. 特に暗赤色灯の条件下では、コントラストを向上させ、視認性を飛ぶためにバイアルの下に白い紙を置きます。
5. 一定のレベルを維持するために、実験中に定期的に空気の流れを確認してください。気流が安定した後、一般的に、彼らは実験期間中に安定した状態を保つ。
6. 1時間の期間ごとに5分に一度、その立ち直り反射を失ったハエの数を数える。アルコール感度が遺伝子型および遺伝的背景の間で変化するように、より頻繁な評価を実行したり、長時間の実験を行うことが望ましい場合がある。
7. バイアルslightlを持ち上げ表面からY、バイアルの背後に紙に向かって赤ライト懐中電灯からの光を演出します。暗赤色光条件下ですべての実験に1ルクスを超えない光レベルを維持するために、実験的なバイアルに少なくとも12インチの距離で、手持ちの赤懐中電灯を保管してください。
8. すべての実験のための基準を確立するために照度計を用いた光のレベルを測定します。
9. バイアルにしっかりとタップを適用することにより、その立ち直り反射を失ったハエの数を決定し、約4秒以内に自分を正しくすることができないどのように多くのハエ数える。 LORRを表示するハエはまだ彼らの足と羽を動かすかもしれないが、直立自らをオンにすることはできません。
10. セッションの最後に、各バイアル中のハエの総数を数える。
    注：実験バイアルにハエをロードする際に時折、単一のハエは、ストッパーとサイドの間に挟まれてもよい。これは暗所で行われているように、全麻痺をカウントする必要があるので、それは容易に気付かれなくてもよい正しくパーセンテージを計算するために実験終了時ハエの小胞体。

さらに、この手順は、異なる行動のエンドポイントを表しハエの鎮静を測定するために使用されてもよい。鎮静ハエが自分の権利反射を失ったが、鎮静、より大きなアルコール露出を必要とします。行動的に、鎮静はハエがバイアルにAA事務所タップ次のバイアル中に動か残りと見かけの運動活性の完全な欠如によって特徴づけることができる。鎮静のために、動かない足がバイアルをしっかりタップで次の配信を振っていないと残っているハエの数を数える。さらに、バイアルは、個々のハエはまだ彼らのグラブ反射を維持するかどうかを判断するために左右にロールバックすることができます。

4。データ解析

1. 各バイアル中のハエの総数に基づいて評価し、各時点での割合LORRを決定します。
2. calculatiによる概日時点または株の違いを推定するシグモイド曲線の直線部分内にある各サンプルの50％LORRを、（下の図2を参照）ngの。
3. 代替統計：
   1. 遺伝子型間の比較を計画している場合は、差が（ 図3）事後検定で有意であること時点の範囲を決定するために、反復測定ANOVAandを用いて全体の時間経過を分析することが望ましい。これらの試験のために、我々は0.001の値を使用することを好む。これは、個々の露光時間での差は、曲線の傾きの遺伝子型間の差異と同様に評価することを可能にする。
   2. 感度の差は、このようなグラフの直線部分（ 図4）から鎮静などの特定の応答のアルコール暴露の特定の時間のために決定することができる。
   3. 株または概日時点間の差異は、標準​​的なF-統計および事後検定を用いて推定することができる。

結果

マーカーとして50％LORRを使用してアルコール感度の概日調​​節。

日中のアルコール感度の概日変調を示す代表例を図2に示す。LORRはカントン-SにおけるDDの^第 2日の間に6の時点で測定し、50％LORRを各時点について決定した。 （：F _5,45 = 7.39、p <0.001、N = 6-10時間当たりの時点ANOVA）の分析は、一日の時間の有意な効果を示した。フィッシャーのLSD検定は、この結果は一貫している。CT5、CT13対CT5対CT1、CT17対CT5、コネチカット州21対CT5、CT13、CT17対CT9、およびCT 21対CT9対CT9との間に有意な差が認められた私たちの以前に発表された結果と^1。

野生型および変異ハエとの違い。

第二の例は、野生型カントン-SのハエとFLI間LORRおよび鎮静の違いを示すために時系列を使用してい...

ディスカッション

アルコール乱用と社会のアルコール依存症のコストは両方の²⁹人的·経済的コストの面で、途方もないです^30,31。 ショウジョウバエをモデルとして急速に多数の個体の行動反応を調べるため、高速で汎用性の高いシステムを提供しています、そのように広くアルコール^5,7,32-34及び概日研究^35-37の両方に使用されてきた。

ここでは、概日条件下では、成人のハエにアルコール蒸気の制御された投与のための簡単​​なプロトコルを説明した。

標準化された条件下で培養ハエは、その立ち直り反射を失ったハエの数は5分毎に記録している間、1時間、アルコール蒸気にさらされている。ここに説明されたプロトコルがあるため一定の条件の下で同調し、住宅に関するその他の要件の概日の実験のために最適化されています。様々なステップはsimplifiすることができます例えば、少なくとも1日または暗赤色光条件下で実験を行うための暗闇の中でストレージとして概日の実験のために...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
アルコール190プルーフ	さまざまな
エアレーター	地元のペットショップ		私たちはウィスパー60
シリコーンチューブ1/8 "	VWR	408060-0030
120°Yコネクタ	VWR	82017-256
ディスコネクトVWR		46600-048
プラスチックチューブクランプベル	アート製品	132250000	これまたは次の
ミニチュアエアレギュレータ	ーMcMaster-Carr	8727K11	これまたは前の
ミニチュアエアレギュレーター取り付けブラケット	McMaster-Carr	9891K66
ギルモントサイズ12流量計	VWR	29895-242
ツールクリップ	McMaster-Carr	1722A43	流量計を保持するため
バイアル	VWR	89092-722
2つの穴付きラバーストッパー	VWR	59585-186	バイアルに収まる
5 mm パイレックスガラス管	Trikinetics	PGT5x65	以前のストッパーテ
フロンテープ	金物店		必要に応じてストッパーにぴったりとフィットさせるには
2つの穴のあるゴムストッパー	VWR	59582-122	私たちのボトルに適合
使い捨てガラスピペット	VWR	53283-768	長さにカットし、加熱して曲げます
非常に細かいナイロンネット	VWR	さまざまな
15ワット電球	金物店		頭上の赤い光
写真、赤い安全ライト、			フィルター、オーバーヘッド、レッドライト
、赤いフィルター付きミニ懐中電灯	、マグライト

を使用していますクイックに最適に適合