方法論記事

ミツバチにおけるRNAiによる二重遺伝子ノックダウンと味覚知覚測定（

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DOI：

10.3791/50446

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2013年7月25日

 ,  , 
1School of Life Sciences, Arizona State University , 2Department of Chemistry, Biotechnology, and Food Science, Norwegian University of Life Sciences

この記事について

サマリー

このプロトコルでは、我々は同時に、ミツバチの二つの遺伝子（二重遺伝子ノックダウン）を抑制の2つの戦略について説明します。その後私たちはミツバチ味覚知覚に二重遺伝子ノックダウンの効果を研究するために口先拡張応答（PER）アッセイを使用する方法を提示します。

要約

このビデオでは、二本鎖RNA（dsRNA）注射を用いたミツバチで同時に二つの遺伝子をダウンレギュレートするRNA干渉（RNAi）の新規技術を示しています。また、味覚の知覚を測定するための口先拡張応答（PER）アッセイのプロトコルを提示します。

RNAiによる遺伝子ノックダウンは、標的遺伝子の発現をダウンレギュレーション有効な技術である。この技術は、通常、単一の遺伝子操作に用いられるが、それは相互作用と遺伝子との接合効果を検出するための限界​​を有している。このビデオの最初の部分で、我々は、同時に2つの遺伝子を（二重遺伝子ノックダウンと呼ばれる）をノックダウンするための2つの戦略を提示する。我々は両方の戦略が効果的に規制のフィードバックループにある2つの遺伝子、ビテロゲニン（VG）とピラクル（USP）を抑制することができますを示しています。この二重の遺伝子ノックダウンのアプローチは、遺伝子間の相互関係を分析するために使用することができ、容易に適用することができ異なる昆虫種。

このビデオの第二部は、二重遺伝子ノックダウンの治療後のミツバチで口先拡張応答（PER）アッセイのデモンストレーションです。 PERアッセイは、ミツバチ、ミツバチの行動の成熟がどれほど速いの鍵な予測因子であるの味覚の知覚を測定するための標準的なテストです。巣ミツバチの大味覚認識は、多くの場合、花粉の特化を餌と餌の発症に早い年齢に関連付けられて増加した行動の発展を示している。また、PERアッセイはミツバチに飽食か飢餓の代謝状態を識別するために適用することができます。最後に、1アッセイあたりミツバチも広くミツバチの学習と記憶研究のために使用されているエアコンに異なる匂い刺激をペアリングと組み合わせる。

概要

RNA干渉（RNAi）は、真核生物の多種多様に発生するRNAベースの転写後遺伝子サイレンシングである。 RNAiのプロセスは、内因性又は外因性の二本鎖RNA（dsRNA）前駆物質によって引き起こされる。 dsRNAは、結合して小さな断片（20〜25塩基対）へのdsRNAを切断するリボヌクレアーゼタンパク質ダイサーを活性化する。 dsRNAのガイドの、小さな断片アルゴノートタンパク質による補完的なmRNAの認識と切断、RNA誘導サイレンシング複合体（RISC）1の触媒成分。哺乳類では、30ヌクレオチドより長いdsRNAはは、RNA転写産物2の非特異的な劣化につながる抗ウイルス応答（インターフェロン応答、IFN）を活性化する。しかし、長いdsRNAは、このIFN 3の不足しているため、昆虫に有効かつ特異的であることが証明されている。

長いdsRNAは、異なる昆虫種の標的遺伝子の下方制御に使用されてきた。ミツバチは、パイオンの一つです発達や行動の多くの重要な遺伝子の機能がdsRNAは4,5を使用することによって明らかにされているEER昆虫生物。いくつかのdsRNAの発送方法はミツバチで行われています：dsRNAをインジェクションはミツバチの胚4と成体ミツバチ7,8の遺伝子ノックダウンのための効果的なアプローチであるのに対し、dsRNAを送り、効率的に、ミツバチの幼虫6に標的遺伝子の発現を下方制御する。

昆虫へのdsRNAを適用することにより、展示遺伝子ノックダウン効果は一過性とローカライズされています。研究では、腹部のdsRNA注射胸部のdsRNA注射の両方を効果的に昆虫9,10の腹部脂肪体細胞において標的遺伝子の発現を抑制することが示されている。 dsRNAは、細胞が10を浴びている血リンパからのdsRNAを取ることができている腹部や胸部の空洞や脂肪体細胞内に注入される。しかし、そのような卵巣や脳などの他の臓器、の遺伝子のいずれかが対象とすることはできません腹部や胸部注射。ミツバチの脳内の遺伝子を標的とするためには、dsRNAの脳の注入は効果的局所脳領域11内の標的遺伝子の発現に影響を及ぼす、行われている。ここで、我々は唯一の、より一般的に成人のミツバチで使用されている腹部のdsRNA注入を文書化します。

RNAiは、主に単一遺伝子を標的とするために使用されており、遺伝子の機能を明らかにするための強力なツールとなっている。しかし、任意の遺伝子は他から絶縁されていません、それは複雑な制御ネットワークである。生物学的プロセスを理解するための鍵は、遺伝子が複数の遺伝子の同時操作ではなく、単一の遺伝子ノックダウンを必要とする、どのように相互作用するかを詳細に分析することである。哺乳動物細胞株において、科学者は、送達システム12またはマルチマイクロRNA（miRNAの）ヘアピンのデザイン13を用いて同時に阻害する二、三の遺伝子に成功した。しかし昆虫で、複数の遺伝子ノックダウンはまだ未検証です。ここでは、プレゼンテーション二重の遺伝子ノックダウンを達成することができますトンの異なる注入戦略。卵黄タンパク質前駆体をコードしてビテロゲニン（VG）、及び幼若ホルモン（JH）のため推定受容体をコードし、ミツバチにJH 14への応答を仲介する転写因子として働くことができるピラクル（USP）：我々は2つの遺伝子をターゲットにしています。 VGとJHは、フィードバックループ15でお互いを調節し、ミツバチの行動規制9に関与している。二重の遺伝子ノックダウンを使用して、我乱すVgを両方とJH経路、そして、彼らが共同でミツバチの行動と生理機能とどのようにVG、USPとJHは9対話にどのように影響するかを発見する。

味覚認識はミツバチ社会的行動のための16の行動予測因子である。高い味覚認知と行動の発達、巣のミツバチ行動成熟速く、通常人生の早い段階で飼料の観点と花粉16,17を収集することを好む。ものの規制M味覚認識を根底echanismsはまだ不明で、研究は味覚知覚は内部エネルギー代謝9、ホルモン分泌18,19及び生物遺伝アミンにリンクされていることが示されている20の経路。 VgはとJHの両方が変調味覚認知7,21重要なホルモンのレギュレータです。研究室では、ミツバチで味覚知覚の変化が異なるショ糖溶液に口先拡張応答（PER）をテストすることによって評価することができます。各蜂、0.1、0.3、1、3、10、30％スクロースの上昇濃度系列に続いて、水の液滴と彼女のアンテナの両方に触れることによってテストされる。水またはスクロースの液滴は、各アンテナに触れたときのハチが完全に彼女の口吻を拡張する場合は正の応答が注目される。ソリューションに対する肯定応答の数に基づいて、各個体の味覚知覚レベルが16を決定することができる。しかし、PERの適用はグラム測定に限定されるものではないustatory認識。 PERはまた、このような飽食対飢餓としてミツバチの代謝状態をテストするための有効な方法である。ショ糖へのより大きな応答とミツバチは、一般的にハングリー（王とAmdam、未発表データ）である。また、PERパラダイムはミツバチに連想学習と記憶にも使用することができます。このケースではミツバチは臭気とショ糖水の存在を関連付けるために訓練されます。ミツバチが関連を学ぶとき、臭気の唯一の存在は、スクロース22,23とそれらを報いることなく、正口先応答を呼び起こすことができます。このビデオでは、我々は以前の研究9でVGとUSPダブルノックダウンで接続された味覚の知覚を評価するために、PERを実行する方法を示しています。

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プロトコル

パート1：RNAiによる二重の遺伝子ノックダウン

1。 dsRNAを合成

  1. VG、USPとミツバチのゲノムに含まれていない緑色蛍光タンパク質（GFP）をコードする制御遺伝子を標的dsRNAをの設計プライマー：プライマーはオンラインフリーソフトウェアPrimer3のを（使用して設計されたhttp://frodo.wi.mit.edu/ ） 。
  2. VG、USPとGFPのためのdsRNA合成：in vitro転写用プロメガからの使用RiboMax T7 RNAの生産システム。
  3. dsRNAの精製：
    1. 変性および再生：85への熱のdsRNAを℃で5分間、それを1時間室温で冷ましてみましょう。
    2. のDNase I処理：それぞれのdsRNA反応に1μlのDNアーゼIを追加し、チューブをフリックでそれらをミックス。 37℃で15分インキュベート
    3. 各反応にLS、そして優しくINVでそれらをミックス - 150μlのヌクレアーゼフリー水と750μlのトリゾールを追加チューブerting。 30℃で5分のためのサンプルをインキュベート
    4. 各サンプルに200μlのクロロホルムを追加します。 20秒間激しく混ぜる。 4℃12,000×gで15分間サンプルを遠心℃に
    5. 各新しいチューブに上清位相を移し、各チューブに500μlのイソプロピルアルコールを追加します。反転チューブでそれらをミックス。 -20℃で20分間混合物をインキュベート4℃で12,000×gで10分間、それを遠心
    6. 上清を除去し、ペレットを洗浄するために1,000μlの75％エタノールを使用しています。 C、空気乾燥したdsRNAはペレット4℃で7,500×gで5分間チューブを遠心分離した後、ペレットを溶解するヌクレアーゼフリーの水を使用しています。遺伝子の効能ダウンレギュレーションを確保するためには、dsRNA濃度は9 -10μgの/μlの周りでなければなりません。

2。 dsRNAは腹部注射

1）単回注射：ミックス二つの遺伝子のdsRNAと麟蹄二重遺伝子ノックダウンのために、2つの戦略がありますカラットは、混合物、2）2日間注射：初日に一つの遺伝子を標的とする最初のdsRNAを注入し、二日目の同じ蜂に第二のdsRNAを注入。

  1. 寒さは、新たに1〜2分のために4℃冷蔵庫にミツバチを浮上した。ミツバチが固定化されている場合、それらの腹部とthoraxの複数形の間で交差虫ピンで固形ワックスの完全ペトリ皿上で並列に3-4ミツバチをマウントします。
  2. 4℃の冷蔵庫に再びミツバチを冷やす。ミツバチは完全に不動であることを確認してください。それは、約1〜2分かかります。ミツバチが緩んでいるはずです。ミツバチが丸まったりねじ曲げなった場合、それは彼らがあまりにも長い間避けるべきであるどの冷やしていることを意味します。なごむはあまり高い死亡率の原因となるが、どんな動きが傷や死亡のサイズが大きくなりますように、完全な固定化は重要です。
  3. ハミルトンマイクロシリンジで使い捨て30 G針（BD）を入れます。 3μlのdsRNAのを取ると、シリンジ内に気泡がないことを確認してください。針は玉を避けるために、腹部の側面に挿入される内臓パトン。 dsRNAは、吸収されるように徐々にシリンジプランジャを押す。 dsRNAは、非常に粘性があるので、それは完全にシリンジから追放する2-3秒かかります。完全にプランジャーを押し下げた後、4,5秒のために傷口に針を残す。注射後3-5秒間ミツバチを観察します。傷口から血リンパ液滴が漏れた場合は、蜂を捨てる。
  4. さまざまな治療法に対応した彼らのthoraxの複数形をマークするために異なる色を使用してください。シングル注入戦略が使用された場合、この時点で、蜂、1時間の観察の後にコロニーに戻って配置することができる。しかし、2日間の注入戦略は最初のdsRNAを注射された後、使用された場合、ミツバチは蜂蜜シリンダメッシュケージに置かれるべき側に供給され、34のインキュベーターで保たれる℃、湿度80％ 。
  5. 二日目は、メッシュケージにミツバチを冷やし、ワックスプレートにマウントするためのステップ2.2および2.3に従ってください。それはdescriあるように、第2のdsRNAで注射を行うステップ2.4​​のベッド。
  6. ミツバチが1時間室温で回復し、植民地にそれらを紹介しましょう​​。

注：ノックダウン効果を定量的RT-PCR（定量RT-PCR）およびウェスタンブロットによって検出することができる。一般的には、ノックダウン効果が変化し、多くの要因に依存する。我々の研究では、二重の遺伝子ノックダウンは7日、シングル注入と二日間の注射後に検出することができます。

パート2：テングザル拡張応答（PER）アッセイ

1。ハイブから集めるミツバチ

注射後6日目に、喫煙者を使用せずに、コロニーからの処理ミツバチを収集します。金属メッシュシリンダーケージでミツバチを収集します。各ケージに3ミツバチを保つ。

2。 PER用取付ミツバチ

彼らが完全に固定化されている°Cまで4でミツバチを冷やす。特別にPERのために設計プラスチックチューブに垂直各蜂をマウントします。ボイジャーによって管内腹部を保つgの二つの小さなテープ片、チューブから突き出頭を維持。小さなプラスチック製のカラムの2行を持つラックにチューブを入れて、ID番号で各チューブ（蜂）を割り当てます。その後、インキュベーター（34℃、湿度80％）にラックで治療ミツバチを入れて、2時間インキュベーターに保管してください。

3。ショ糖水溶液のシリーズの準備

0％、0.1％、0.3％、1％、3％、10％及び30％スクロース水溶液を調製し、15〜20 G針とシリンジにソリューションを読み込む。

4。アッセイPER

0.1％、0.3％、1％、3％、10％および30％スクロース水溶液に続いて0％溶液（水）の液滴と蜂のアンテナをタッチします。最初に水ですべてのミツバチをテストし、各ソリューション間の間隔として、少なくとも2分が使用されていることができます。したがって、我々は、通常、各試験のために少なくとも20蜂を持っている。ハチが完全に彼女の口吻を拡張する場合、肯定応答がカウントされます。

5。データ管理

味覚応答スコア（GRS）のために、個々の総陽性反応をまとめる。データに適切な統計分析を実行します。

パート3。遺伝子ノックダウンの検証

脂肪体は7日齢扱わミツバチの別のセットから解剖されています。標準トリゾール手順は、DNアーゼI処理24が行われるRNA抽出のために使用される。Vgとし、USPの遺伝子発現は二段階定量RT-PCRによって分析される。 アクチンは、それが、異なる組織で安定した式を有するので、参照遺伝子として用いられるミツバチの。 VG及びUSP遺伝子の公表リアルタイムPCRプライマーは、24本実験で使用されている。データは、デルタデルタCT法25を用いて分析される。

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結果

シングル注入と2日間注入戦略大幅VG（一方向ANOVA、P <0.001）（ 図2A）とUSP（一方向ANOVA、P <0.001）（ 図2B）ミツバチにおける転写レベルを減少させ、両方のdsRNAを注入した6日後。 dsRNAの混合物およびVG第一および第二のUSP（VG / USP）と2日間の注射で単回注射を使用してUSP転写の抑制がUSP第一および第二のVG（USP / VG）で2日間の注射よりも有意に低かった（事後分析、P 混合対USP / VG = 0.013、P VG / USP対USP / VG = 0.019）。

ダブルノックダウンミツバチでGRSは、GFPコントロール<...

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ディスカッション

我々の研究は、同時に成虫に二つの遺伝子をノックダウンするための最初の取り組みです。我々の結果は、dsRNAを注射（単回注射と二日間の注射）の2つの戦略は、二重遺伝子抑制に有効であることを示している、とVGとUSPの同時遺伝子サイレン蜂8,9に6日間dsRNAを注射した後にテストすることができます。しかし、遺伝子ノックダウンの効果は、細胞や臓器によって標的遺伝子、タンパク質の代謝回転率とdsRNAの取り込み効率の転写レベルに応じてさまざまな昆虫種が異なります。また、RNAiはの効果は用量依存的である。私たちは、新たに出現し蜂はよく4μlのdsRNAをを受け入れることが見つかりましたが、以上の4μLのdsRNAを注入した場合、死亡率が急速に増加しています。したがって、2日間の注入戦略は、注入量のより高い量を必要とする実験のための単一の注入よりも適切であり得る。

ここでは、二重の遺伝子ノックダウン9 我々は、2つのレギュレータの共同効果を研究するために使用することができます開発しました。ま...

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開示事項

開示するものは何もありません。

謝辞

著者は、実験を支援するエリンFennernに感謝したいと思います。この作品は、ノルウェーの研究評議会（180504、185306及び191699）、ピュー慈善トラスト、および国立老化研究所（NIA P01 AG22500）によって賄われていた。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
GE Healthcare PCR ビーズ 96ウェルプレートGE Healthcare27-9557-01
QIAquick PCR 精製キットQiagen28104
RiboMax T7 RNA産生システムPromegaP1300
Trizol LSInvitrogen10296028
Chloroform:Isoamyl alcohol 24:1Sigma-AldrichC0549
イソプロピルアルコールSigma-AldrichI9516
Hamilton micro syringeHamilton80301
30G BD 使い捨て針BD Biosciences305106
スクロースSigma-Aldrich84097
1 ml シリンジBD Biosciences30960
ステレオ解剖顕微鏡ライカマイクロシステムS6D
昆虫ピンファインサイエンスツール26000-25
ワックスプレート

参考文献

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