方法論記事

の4Dのマルチモダリティイメージング

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DOI:

10.3791/50450

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2013年8月13日

 ,  ,  ,  , 
1MRC Centre for Molecular Bacteriology and Infection, Division of Cell & Molecular Biology, Imperial College London, 2Preclinical Imaging, Caliper- A PerkinElmer Company

この記事について

サマリー

マルチモダリティイメージングは​​、小さな動物モデルで細菌のコロニー形成を研究するための貴重なアプローチである。このプロトコルは、生物発光とマウスの感染症を概説シトロバクターrodentiumとの4Dムービーを作成するためにμCTイメージングと複合3D拡散光イメージングトモグラフィーを用いた細菌のコロニー形成の長手方向の監視 C. rodentium感染。

要約

このプロトコルは、縦方向に感染サイクルの4次元（4D）のムービーを生成するために統合されたμCT（DLIT-μCT）及びこのデータのその後の使用との複合3D拡散光イメージングトモグラフィーを用いた生物発光細菌感染を監視するために必要な手順の概要を説明します。 4D感染ムービーを開発し、IVISスペクトラムCTを用いた細菌感染症研究のためDLIT-μCTイメージングを検証するために、我々は生物発光C.感染を使用マウスで自己限定性大腸炎を引き起こすrodentium、。このプロトコルでは、生物発光C.によるマウスの感染を概説rodentium、毎日DLIT-μCTイメージングと8日間の糞便からの細菌の列挙によって植民地化の非侵襲モニタリング。

IVISスペクトラムCTの使用は、単一のイメージングプラットフォームを用いた光とμCTスキャンのシームレスな同時登録を容易にする。低用量μCTのモダリティは、マウスのイメージングを可能にする累積放射線からアーチファクトを引き起こすことなく、3Dで生物発光細菌の巣の詳細な解剖学的局在を提供する感染中の複数の時点、で。重要なのは、感染したマウスの4D映画がin vivoで細菌のコロニー形成のダイナミクスを監視するための強力な分析ツールを提供する。

概要

特に小さな動物モデルは、これらのマウスを利用して、日常的に細菌の病原性を調査するために、又は抗生物質、プロバイオティクス、プレバイオティクスおよびワクチン1-7などの感染のために介入戦略をテストするために使用される。小動物の感染症からの主な実験的な読み出しは病原体負荷、感染症の空間的および時間的局在、および感染した生物の免疫応答への変更である生体内光学イメージングでは感染症研究のための貴重なツールであり、複数の監視に使用できますレポーター遺伝子を使用することにより実験的読み出し（ルシフェラーゼ、蛍光タンパク質、β-ラクタマーゼ、等）、蛍光色素、ナノ粒子またはタンパク質、生物学的プロセス、又は微生物6に標的化学発光プローブ。

生物発光イメージング（BLI）が病原性bacteにより、例えば、マウス、ラットなどの小動物のコロニー形成を監視するために使用される光学撮像モダリティであるRIA 3,6,8,9。マウスはそのようなPhotorhabdusのluminescensからルクス CDABEオペロンとしてルシフェラーゼを発現する組換え細菌に感染している。これらの細菌は、その後vivoイメージングシステム3,6,9 に基づいてCCDを使用して光生成を介して検出することができます。重要なのは、唯一の代謝的に活性な微生物は、生存細菌細胞は、この方法論10,11によって検出される、つまり生物発光（BL）である。 2D BLI使用して、BL源の位置は、信号が発せられる動物8の表面から推測される。 in vivoでの BL病巣の正確な解剖学的局在は対照的に、臓器3,6,9のex vivoでの分析によって決定されなければならない、合成3次元拡散光トモグラフィイメージング（DLIT）はBLの定量的な3次元再構成をコンパイルするために使用することができるソース12。 DLITが定義狭帯域通過光フィルタを用いて撮影したBL画像を収集することによって行われ、その後、拡散光トモグラフィー3次元再構成アルゴリズム1,7,12,13にそれらを入力する。

現在のところ、マルチモダリティイメージングはex vivoでの解析を必要とせずに、in vivoで生物発光病巣の真の非侵襲的な解剖学的局在を得ることができる唯一の方法論です。最近、我々はDLITプロバイオティクス細菌7と予防的治療後にシトロrodentium（C.rodentiumの ）植民地化の動態を評価するためにμCTイメージングと共同で登録された組み合わせを使用していました。C. rodentiumは病原性とenterhemorrhagic 大腸菌 14とモデル、人間の感染に使用されたマウス特有の腸病原体である。Cでrodentium感染は一般的に軽度の体重減少、下痢、偏Th1型免疫応答と結腸陰窩の過形成など、明確な病理学的変化、及び取り付け、控えめ病変のformatiに関連付けられている、大腸炎を引き起こす14。これに加えて、C. rodentiumの病因は、徹底的にこの細菌マルチモダリティイメージング3,4,7での使用に理想的なモデル微生物作り、十分に文書化されているC57BL/6JマウスにBLIとその植民地化のダイナミクスを使って研究されてきた。

このプロトコルは、単一のマルチモダリティイメージングプラットフォーム、IVISスペクトラムCT、および非侵襲的に、この感染症の真の力学的な関係を示すの4D映画の生成を使用して細菌感染の統合DLIT-μCTイメージングのための方法論を概説する最初のものです。

プロトコル

1。マウスの準備

  1. 研究のために必要な18〜20グラムC57BL/6Jマウスを購入したり、十分に繁殖。
  2. マウスは外部のサプライヤーから購入された場合は、施設への輸送後に、腸内細菌叢を安定させるためにオートクレーブ食料と水で1週間のマウスを慣らす。
  3. 、耳のノッチを秤量し、ケージあたりのマウスの必要数を区切る。
  4. 感染前の日は、どんな麻酔を行う前に、手続きの期間中に十分な酸素とイソフルランがあることを確認してください。必要に応じて、より多くのイソフルランを追加したり、酸素ボンベを交換してください。その後、彼らは彼らの最初の使用以来、以上の50グラムを得ている場合、麻酔スカベンジャーの重量をチェックし、それらを破棄し、新鮮なスカベンジャーと交換します。
  5. 7分間Veetのを使用してXGI-8麻酔システムと脱毛の3％イソフルランを使用して麻酔をかけるマウス。
  6. 注：
    • 徹底した脱毛は特にで、必要不可欠である毛皮の中でメラニンのように黒いマウスはかなり生物発光信号3,15を減衰させる。
    • 毛皮は再成長を開始する前にマウスの脱毛は、通常8-10日続きます。関心領域は、撮像セッションのヌードになるように、必要な場合より長い期間にわたって4Dのマルチモダリティイメージングを実行するために、マウスを脱毛。
    • マウスは、生​​物学的安全性レベル2（BSL-2）封じ込め施設内に収容されている。

2。細菌の細胞調製

  1. 必要になるまで十分にカナマイシン[50μgのML -1] 4で勉強や店舗に必要な°Cで補充ルリアBurtaniブロスと寒天プレートを準備します。
  2. 感染前の日はCのクライオバイアルを解凍rodentium株 ICC180とすぐにはカナマイシン[50μgのML -1] 220 rpmで一晩と文化、37℃で補充1 cryobead〜15 mlのLBブロスを追加培地汚染の制御などの追加を準備カナマイシン[50μgのML -1] 220回転、37℃と文化℃のを補っ未接種15ミリリットルのLBブロス
  3. 翌朝（〜16時間）は、細菌の増殖の印として濁度用培地コントロールをチェックします。コントロールがクリアされている場合は、ファルコンチューブにICC180文化を転送し、4,000 rpmで遠心。その後、PBSで細菌ペレットを洗う。を1.5 mlのPBS（カナマイシンを添加したLBの元の体積の1/10）に再懸濁および細菌の接種を作成するために徹底的に混ぜる。
  4. ICC180が適切に培養し、画像1以前に説明したように生きているイメージ4.3.1ウィザードでBLIおよび自動設定を使用してIVISスペクトラムCTで接種を、前のマウスの感染生物発光でされたことを確認する。
    注：
    • ひずみICC180、野生型Cの生物発光誘導体であるrodentium ICC169 2。この菌株は、Kを含むルクス CDABEオペロンを持つanamycin耐性遺伝子は、染色体2におけるxylEの偽遺伝子に挿入。
    • 標準的な無菌技術を使用して、すべての細菌の培養を行い、必要に応じてどちらかの滅菌消耗品/試薬を購入したり、使用前にオートクレーブ。
    • ステップ2.4において、生物発光の読み取り（P / S / cm 2の / SR）をマウスの感染前の細菌数を推定することができる。

3。生物発光C.によるマウスの感染rodentiumと細菌のコロニー形成の評価

  1. 感染する前に、手続きの期間中に十分な酸素とイソフルランがあることを確認してください。必要に応じて、より多くのイソフルランを追加したり、酸素ボンベを交換してください。その後、彼らは彼らの最初の使用以来、以上の50グラムを得ている場合、麻酔スカベンジャーの重量をチェックし、それらを破棄し、新鮮なスカベンジャーと交換します。
  2. XGI-8 Anaestheを使用して3％のイソフルランで麻酔をかけるマウス人道的な自制を提供するために、SIAシステム。
  3. 徹底的に細菌の接種材料を混ぜ、シリンジに0.2ミリリットル（約5×10 9 CFU ICC180）を描く。
  4. しっかりと親指と人差し指で首の後ろの皮膚をつかんで、時間と首筋彼らに麻酔システム1からマウスを外します。
  5. 口の屋根に向かって、舌の上に、と食道下胃管針を押して、胃に細菌の接種を注入。
  6. マウスの強制経口投与後、細菌の接種が肺に配信されたこと徴候である可能性があります苦痛の徴候のための彼らの歩行と呼吸を監視します。肺に接種されているすべてのマウスを安楽死させる。
  7. ステップ3.1〜3.6で説明したように、車両制御として200μlのPBSで強制経口感染マウス。
  8. 強制経口投与が正しく行われたことを確認するには、IVISスペクトラムCTの画像感染とモック感染マウスは、リビングにBLIおよび自動設定を使用して画像4.3.1ウィザードは、以前に1に記載。
  9. PBSで段階希釈により接種における生菌数を決定し、カナマイシンを添加したLB寒天上に三重にスポッティング[50μgのML -1]。
  10. そこに約5-50コロニーがあり、その希釈で各スポットからのコロニー数をカウントし、コロニーでカウントされたことを記録して希釈希釈を見つけることによってICC180 CFU / mlの数を計算します。その後、CFUの平均数を（3つのスポットから）計算し、希釈係数50（各スポットは、元、1mlの試料を20μlのです）とコロニーをCFU / mlとを与えて、上でカウントされた希釈することにより、この値を掛けます。
  11. 予め秤量エッペンドルフチューブ（微妙なバランスを圧迫）に各マウスから糞便を集めることによって、毎日マウスの植民地化を監視し、サンプルの重量（0.1グラムミリリットル-1）に基づいてPBSで1/10に希釈します。
  12. 内生菌の数を決定するシリアルPBSで希釈し、カナマイシンを添加したLB寒天上に三重にスポッティングによって糞[50μgのMLを-1]。
  13. ステップ3.9に従って、糞便グラムあたり生菌数を算出し、CFU / gを得0.1グラムのPBS溶液-1（ステップ3.10）における糞便希釈係数によってCFU / mlの数を掛ける。
  14. マウスは純粋ICC180文化と、コロニーのすべてが生物であることを接種したことを決定する。ステップ3.8から寒天プレートを取り、目のいずれかによって細菌のコロニー形態を評価したり、プレートから代表コロニーをピックアップし、光学顕微鏡で分析します。必要であれば、細菌の同定は、培養の純度を評価するために、特定の菌株のコロニーPCRによって行うことができる。続いて、画像は、BLIを使用IVISスペクトラムCTにおけるプレートは、ステップ3.7に記載されており、プレート上のコロニーの100％が生物であることを確認してください。
    注：
    • 強制経口投与針を挿入ステップ3.4では、抵抗を感じる場合、これは肺に行くために接種を起こすように、強制経口投与針を無理に押し込まないでください。その代わりに、針を再挿入し、優しく、再試行してください。
    • ステップ3.1はオプションで、マウスは麻酔が機関動物福祉政策に依存せずに経口強制経口投与することができます。
    • スツールは、それらが収集された日をメッキされている必要があります。Cでrodentium PBS で 4℃で一晩残っていても成長するとCFU / gの便の定量が不正確であることが原因となります。

4。感染マウスのμC​​Tイメージングとの日常コンポジット3D拡散光イメージング断層撮影（DLIT-μCT）

動物福祉の考慮事項：DLIT-μCTは、固定化動物の高速、低放射線線量μCTスキャン（2つのマウススキャン〜23ミリグレイ、マウスのシングルスキャン〜53ミリグレイ）と統合DLIT光学イメージングを伴う。この用量は、各イメージングセッションに蓄積し、その目的は、用量LOとしてキープですできるだけW（といつもうまくLD 30分の50以下）はまだ研究を達成しながら。マウスの従来のBLI走査における感染の兆候がない場合、いくつかのケースでは、μCTスキャンがさらに線量を最小限に抑えるために回避することができる。放射線被曝についての懸念がある場合は用量を長期の研究では、可能な限り低く保たれているにもかかわらず、マウスは有害な症状の最初の兆候でμCTまたは撮像期間の終了時にカリングされる。

  1. イメージングの前に、IVISスペクトラムCTを初期化し、X線の安全​​インターロックが作動し、加熱されたステージは、イメージングのための適切な温度（37℃）であるとされていることを確認。その後、麻酔システムと麻酔スカベンジャーの重量isoflouraneのレベルを確認してください。必要に応じて、より多くのイソフルランを追加し、スカベンジャーが彼らの最初の使用以来、以上の50グラムを得ている場合は、それらを破棄し、新たなスカベンジャーと交換します。
  2. CTはその撮像パラメータそのそのスペクトルを設定リビングイメージ4.3.1で自動露出機能を実行イメージング細菌ルシフェラーゼに最適化されています。編集]> [設定]> [取得と自動露光窓を選択します。次に>レンジ値>経験を選択します。時間（秒）と>マックスを設定します。 300Sへ。最後に、>ターゲットカウント（最小）>発光を選択して、10,000カウントに設定されています。
  3. 麻酔にスペクトラムCTに1マウスイメージングプラットフォームを挿入し、垂直それ。
  4. X線安全インターロックのスイッチを入れ、IVISを初期化します。
  5. IVISスペクトラムCTが初期化されると、人間的な拘束を提供することXGI-8麻酔システムを用いた3％イソフルランをマウスに麻酔をかける。
  6. それはDLIT-μCTスキャンを実行するために必要であるかどうかを判断するには、BLIを使用プレイメージマウスは、マウスを一回のイメージングプラットフォームで、以前に1に記載。強い信号が得られた場合には、マウスDLITイメージングに適している。 1マウスイメージングplatforで麻酔マウスを残すBLIスキャン後のM DLIT-μCTの準備が整いました。
  7. DLIT-μCTスキャンを設定するために生きているImageソフトウェア4.3.1でのイメージ作成ウィザードを使用してください。イメージングウィザードが自動的にFOV、DLITの露光時間、F-ストップとビニングとFOV、露光時間、ノイズ比に最高の信号を与えるためにμCTイメージング用フィルターセットとビニングを決定します。イメージ作成ウィザードが表示されたら、唯一の560、580、600、および620 nmの発光フィルターが含まれており、マウスを一回μCTスキャンを選択します。クリック>イメージングを開始するために取得します。
  8. イメージング後にケージに麻酔マウスを返し、スペクトラムCTから一マウスのイメージングプラットフォームを削除して、1％のトライ遺伝子を用いて消毒する。必要に応じて、マウスがマウスの間の交差汚染の危険性を最小限にするために配置されていることを発泡パッドを交換してください。
  9. 毎日4D MOを作るために必要な縦方向の画像データを生成するように手順を4.1から4.8に記載されてDLIT-μCTを、使用して8日目、感染後（PI）への画像マウス感染の争う。
    注：
    • ステップ4.7では、我々は画像細菌生物発光に560から620 nmの発光フィルターの使用をお勧めします。細菌の生物発光のピークが組織光学系に起因する485 nmの（マウス組織による青/緑の光子の大幅な減衰）を中心ですが、彼らは信号の深さの計算を容易にするように、それは、3D再構成のためのオレンジ/赤光子を使用することが重要です。
    • DLITためのリビングイメージ4.3.1の "オート"露光設定は、キャプチャされた光子の量および各フィルタセットに使用される最大撮像時間を最適化するために調整する必要がある。
    • 研究者は、新しい感染モデルを用いて、例えば検出可能な生物発光信号が存在するかどうか不明である場合、ステップ4.6で説明したBLIプレ撮影を実行するためにのみ必要である。

5。 DLIT-μCTイメージングデータの3次元再構成

  1. オープンリビングImageソフトウェア4.3.1を選択>; DLIT-μCTファイルを含むフォルダをブラウズして開きます。
  2. 例えばCで 、リビング画像ブラウザでDLIT-μCTファイルを開きますロード]をクリックしてrodentium 1 日目PI。
  3. ツールパレットを選択>表面トポ>ヌードマウスでは、しきい値を調整してから、クリック>表面を生成します。表面再構成が成功した場合、表面の輪郭は、3Dビューウィンドウに表示されます。
  4. 3DビューウィンドウでレンダリングμCTスキャンを表示するには、（> 3D光学ツールと解除>ディスプレイサーフェスオブジェクトをクリックします）表面のアウトラインを非表示にしたり、（> 3D光学ツールをクリックし、> [不透明度のスライダバーを調整して）表面の不透明度を下げる。
  5. 3D DLIT再建の詳細な解剖学的局在そうマウスだけのスケルトンが表示されていること、それが最適なコントラストを持っている3Dボリュームデータ（μCTスキャン）を変更する必要がありますを提供する。 > 3Dマルチモダリティツールを選択>対数ヒストグラム、Gをクリックradientイルミネーション、品質とノイズ除去。最後に、右にヒストグラムスライダを調整し、3次元ボリュームデータの変化のコントラストを見る。唯一の骨がはっきりと見えるようになるまでデータを調整してください。所望であれば、ヒストグラム上での伝達関数ポイントの色を変更する。
  6. 次にセレクト> DLIT 3Dツールパレットで復興だけ560は、580、600、および620 nmのin vivoでのイメージング細菌ルシフェラーゼに必要とされるフィルタセットは、選択されていることを確認してください。クリック>スタート。データのプレビューウィンドウメニューが2Dで画像化したマウスからのスペクトルフィルタリングBL信号を示す表示されます。これらの信号は、ソフトウェアによって自動的に閾値処理されますが、メニューの一番下にあるタブを使用して、必要に応じて手動で調整することができます。しきい値は、再構成のデータとして含まれる最小データ強度（画像信号における最大のパーセンテージとして表される）を決定する。
  7. 次にセレクト> DLITの3Dツールパレットで復興DLIT再建に用いられる光学特性が正しいことを確認します。 > [プロパティ]タブを選択し、ソーススペクトルを細菌に設定されている、組織のプロパティの設定は、マウス組織に設定されていることを確認してください。
  8. クリック> DLIT再建を実行するために再構築。
  9. DLIT-μCT3D映画のクリックを生成するには>ツール> 3Dアニメーションを選択>プリセットアニメーション> CCW Y軸、>合計時間> 10秒（毎秒25フレーム）。一度3Dアニメーションの設定が正しいプレス>レコードであり、別のフォルダに実験グループと時点で標識。aviファイルとしてDLIT-μCT3D再構成を保存します。
    注：
    • リビングイメージ4.3.1とインストールされたサービスパッケージ1とし、PCはマルチモダリティイメージングソフトウェアを実行するために適したグラフィックスカードを持って、そのPCを使用するようにDLIT-μCTデータの3次元再構成を実行するとき、それは重要です。木曜日ソフトウェアをダウンロードすることができており、GPUの仕様は、リリースノート（に含まれていhttp://www.caliperls.com/support/software-downloads.htm ）。
    • DLIT-μCT3D再構成が保存された後、後方に表示される場合は、お使いのコンピュータは、そのグラフィックドライバの古いバージョンを実行している、これは、メーカーのWebサイトからアップデートをダウンロードして修正することができます。
    • ステップ5では、私たちは3D DLIT-μCT再構成を生成するための私たちの好みの設定を提示します。しかし、このプロトコルで説明されていないパラメータを変更することができ、3D再構成中に複数のポイントがあります。リビングイメージ4.3.1を使用して3D再構成するための包括的なガイドについては、メーカーの取扱説明書をご参照ください。
    • それは、彼らが同等になるようにマルチモダリティイメージングツールで同一の設定を使用した3D再構成を作成することが重要です。に加えてこれは、DLIT-μCT3D再構成を作成するときに、それ以外の4D映像のタイミングは均質ではなく、動画番目と合計時間当たりのフレーム数（長さ）と同じ番号を使用することが重要である。

6。 C.の4D映画の世代rodentium感染

  1. 明らかに簡単にアクセス可能なフォルダで正しい実験、時点とグループとDLIT-μCT3D再構成のすべてのラベルを付けます。
  2. のWindows Liveムービーメーカーで新しいファイルを作成し、ステップ6.1で準備フォルダから[ツール]タブを使用して1日目PIから時系列順にDLIT-μCT再建を挿入します。
  3. 適切DLIT-μCTビデオを選択し、[ホーム]を選択して例えば1日目PIため、時刻を記述するすべてのビデオの先頭にキャプションを追加する>キャプションを追加します。テキストボックスには、適切な伝説が追加された画面で、上に表示されます。 DESなどのフォントサイズ、スタイル、色、および正当性を調整ソフトウェアツールバーのMicrosoft Wordに同じタブを使用して赤外発光ダイオード。最後に、ビデオの左上隅にキャプションを移動します。
  4. DLIT-μCTビデオのすべてのためのステップ7.3を繰り返します。
  5. タイトルページを追加し、例えばC.ホーム>タイトルをクリックしてrodentium感染日1-8。テキストボックスには、適切なタイトルが空白のスライドに追加された画面に表示されます。フォントサイズ、スタイル、色、およびソフトウェアのツールバーのMicrosoft Wordに同じタブを使用して、必要に応じて正当化を調整します。
  6. ムービーメーカーのプロジェクト映画のタイトルとの適切なフォルダに* MMPとしてプロジェクトを保存します。あなたが映画を改正したい場合は、このステップが不可欠です。
  7. 。wmvファイルとしてムービーを保存します。ムービーメーカーのメニューをクリック> [コンピュータのムービー>を保存します。
  8. 。aviファイルまたはコンピュータと互換性が別の適切なファイルタイプへのファイルコンバータを使用してムービーメーカーのファイルを変換します。
    注：

結果

5×10 9 cfuのC.とC57BL/6Jマウスの感染rodentiumはよく説明し、細菌感染モデルと自己限定胃腸感染の結果である日6-8感染後の間に3〜4週間2,14間続く ​​ピーク。感染症は、マウス免疫系によって腸管腔に限定されており、結果として、細菌が絶えず糞便中に流されている。 C.によるマウスの植民地化rodentiumは糞、または生物発光イメージング2,3から直接細菌の列挙によって非侵襲的に監視することができます。

本稿では、Cの 3Dと4Dのマルチモダリティイメージングを実行するための最適化されたプロトコルを概説感染中の細菌負荷およびローカリゼーションを監視するマウス内rodentium。 図1に示した結果が成功の4Dイメージングのために必要とされる制御を示す。それを阻止することが不可欠であるマウスの感染に先立ち使用される細菌の接種は、生物発光（ 図1A）であることを鉱山とその生物発光Cとマウスの強制経口投与後に信号は動物の胃の中ではなく、肺（ 図1B）16で観察できることrodentium、。

生物発光イメージングを使用して細菌のコロニー形成を監視することに加えて、それは糞便中の細菌数を定量化することをお勧めだ、胃腸粘膜の細菌定着の間接的な測定として使用される図2 8 C57BL6 / Jから取ら糞便中の典型的な細菌負荷を示しています。 〜5×10 9 CFU ICC180に感染し、約5×10 10 CFU / gであり、一日6-7どこで感染ピーク日まで2 PIから8日間のPI植民地の上昇のために監視されているマウス 以前の報告2,3,17に沿ったです。

評価の重要性を強調するにはティンシングルマウス、 図1b及び3と同様に、 ビデオ1での感染の広がりが C以下同じマウスから生成されています上述したようにrodentium感染 、。毎日DLIT-μCT、解剖学的基準としてスケルトンを使用して、このマウス内の生物発光細菌の空間分布を評価した。 図3は、少なくともPI 3キーの時点でICC180に感染したC57BL/6JマウスのDLIT-μCT再構成を示してい3日目PI小さな生物病巣は空間分布の変化が少ないと5日目PIによる生物発光強度の緩やかな増加を示す結腸で観察することができる。 7日目PIで私たちは生物発光の大幅な増加と結腸全体にわたる生物病巣の広がりを観察した。

ビデオ1日からICC180と1-8 PI 3D DLIT-μCT再建の集大成であり、Cを示しています日で細菌病巣は結腸全体をカバーする7 PIピーキングまで大腸内細菌の数字は拡大4-6 PI日から3日目のPIで大腸に広がる日1-2 PIの間に近位消化管内rodentium。 8日目PIのみで二つの異なる細菌の巣には、近位および遠位結腸に存在している。時系列順に各時点で完全な3D再構成を表示する機能は、ホスト病原体の相互作用を分析するための強力なツールを表し、同じデータセットの3D静止画より解釈が容​​易である。

figure-results-1
図1の2次元生物発光イメージング）生物発光C. rodentium ICC180接種と接種200μlで強制経口投与後にB）マウス。アローヘッドは（>）生物発光C.を示しrodentium em>の胃である。

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図2。C. rodentium植民ダイナミクス℃の定量8日間PIのため糞からrodentiumコロニー形成単位

figure-results-3
図3。生物発光Cの拡散光イメージングトモグラフィー-μCTスキャン3日目、5と7 PIアロー（>） で監視1マウスからrodentium感染は結腸植民地化を示しています。 より大きい数字を表示するには、ここをクリックしてください 。

ビデオ1。P :/ / www.jove.com/files/ftp_upload/50450/LAB_MEDIA_50450_Frankel_Video1.wmv "ターゲット=" _blank ">映像を表示するには、ここをクリックしてください。 日1から8までのPIを監視1マウスからC.rodentiumの感染の 4D映画

ディスカッション

細菌感染の4D映画は、迅速かつ容易にマルチモダリティイメージング、大量のデータを視覚化し、解釈するための有用なツールを提供しています。この手法は、感染症は、個々のマウスを介して拡散し、縦断的研究7時にホストまたは細菌遺伝子または特定の介入戦略の効果細菌負荷、流通、ローカライズの方法削除を調査するために使用する方法の詳細な分析を容易にします。これらのビデオにも便利教材や国民に情報発信の手段を提供します。

DLIT-μCTイメージングと感染の4Dのビデオをコンパイルする機能から得られたデータの品質に影響を与える可能性があり、このプロトコルにはいくつかの重要なステップがあります。このプロトコルの最も重要な部分は、C.を有するマウスの正常かつ均質な感染症であるrodentium。これは、研究のために使用されるマウスは18〜20グラムの間で、そのあることが不可欠であるbacteリアル接種は、新たに調製し、約5×10 9 cfuのは、前述2,3に記載されている。以前はマウスの感染に、それは接種はスペクトルCTを使って、一度接種が準備されている生物であることを確認することが重要であるそれぞれのマウスがマウスが同じような感染量を受け取ることを保証するために強制経口投与する前に、それが継続的に均質化されている必要があります。マウスのDLIT-μCTイメージングは​​リビングイメージ4.3.1ソフトウェアの自動露出機能が自動的にうまくノイズの上になるように信号用に最適化された撮像パラメータを決定するように最適化されています。ただし、自動露光機能が手順で説明したように変更する必要がユーザ設定及びパラメータに依存している。これを怠ると、自動露出のためのスペクトラムCTの工場出荷時の設定は、撮像腫瘍が発現するためにプログラムされると、感染の明らかな進行をもたらさないことを集めた光子の数が少ないと悪いイメージになりますホタルルシフェラーゼ。復元は、560から620 nmのシミュレートと測定データとの間の最良の合意を与える使用して実行し、そのため、復興に含めるより信頼性の高いデータである。

DLIT-μCTの使用に制限はμCTスキャンからの電離放射線は、縦断的研究18の累積である亜致死放射線損傷の原因となります。亜致死放射線露光は、DNA損傷、および内臓19におけるアポトーシスを引き起こす免疫応答を弱めることができる。電離放射線のためのLD 30分の50はマウスのマウス系統や年齢に応じて、5〜7 Gyの間で18,20,21を使用され、超過した場合に最終的に、累積致死放射線損傷は、死を引き起こす可能性があります。包括的な原則は、保守的に線量を推定することであるため、電離放射線の分子損傷のいくつかは、癒すことができますが、これは一般的に研究計画では占めていません。その代わりに、目的はずっとベルとして滞在することですできるだけOWはこれらの制限はまだ研究の目標を達成しながら。これは、感染に対する正常な免疫応答のこの研究において特に重要である、画像化、およびトランスジェニック動物を免疫構成され、又は頻繁に感染しているという事実の周波数は、電離放射線の影響をより受けやすいかもしれない。

感染の4Dムービーを生成する実験を計画するとき、それは実験の長さを考慮することが重要である、μCT数が使用されているマウス系統に対して電離放射線のために、この期間中に必要とLD 30分の50スキャンします。これは細菌の検出限界とイメージング時間に影響を与えるとしてDLIT-μCTに別の潜在的な制限は、使用されている菌株内レポーター発現の強さです。 BLIのために以前に実証されるようにこれは非常に、研究者が完全に病原性である菌株を検証し使用することをお勧めしますが、最大のルクスオペロンの発現のために最適化され2,3。

4Dイメージングの現在の設計の一つの注意点は、それぞれのムービーが異なる光子スケーリングを持つ個々のDLIT-μCTスキャンで構成されているということです。 BL病巣の局在、またはその強度に変化は微妙である場合、これは解釈が画像を困難にすることができたり、複数の弱巣に囲まれた1激しいBLフォーカスが存在する場合。したがって、長手方向の視覚化のために、それは時間ポイント間のカラーバーの一貫性を保つことが重要である。

感染の4D映画の概念は、任意の適切に標識された細菌性病原体に適用することができる。この技術の今後の展開は、感染に対する宿主応答を調査する赤外線プローブ近い蛍光生物発光細菌性病原体および注射の組み合わせを使用して、感染に対する宿主応答の調査を容易にするために、蛍光イメージング断層撮影（FLIT）ならびにDLITを使用することを目指します。さらにこれに、このプロトコルで我々だけ感染の4Dムービーを作成するための生物発光細菌の使用を記載している。しかし、いくつかの例では、生物発光レポーター、感染時にホスト遺伝子を調査するために使用することができるので、IRFPでタグ付けされ、例えば、蛍光標識された細菌を使用する必要があるかもしれない。重要なのは、DLIT / FLIT-μCTを組み合わせたマルチモダリティイメージングの使用は、私たちは非侵襲的に削減、洗練、および科学研究における動物の使用の交換に大きく貢献する細菌感染症、間に複数のパラメータを調べることができますNC3Rのイニシアチブ（に概説されているようhttp://www.nc3rs.org.uk/ ）。

開示事項

この記事への生産とフリーアクセスは、パーキンエルマーが主催しています。

著者はケビン·P、フランシス、ジェフMeganckとChaincy郭はキャリパー·パーキンエルマー社の従業員です。

全ての動物実験は、動物科学手続法1986に従って実施され、地元の倫理審査委員会によって承認された。

謝辞

インペリアルカレッジにおけるin vivoイメージング施設で MRCによって資金を供給された。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
生物発光 C. rodentiumFrankel labICC180Wiles et al., 2004
VeetBoots最適な脱毛時間は7分です。
イソフルオラン(100%v / v)アボットB506 
医療用酸素BOC メディカルサイズFシリンダー <ストロング>注: 適切なレギュレーターが必要です。
Luria Bertaniブロスメルク1.10285.050025 g1L脱塩水。
Luria Bertani 寒天ク1.10283.050037 g 1L 脱塩水。
硫酸カナマイシンSigma (Fluka)60615 
50 mlポリプロピレン円錐形ファルコンチューブBD(ファルコン)352070 
ユニバーサルコーニング(ゴセリン)E5633-063 
1mlシリンジBD(Plastipak)300013 
経口投与針(16G x 75 mm)湾曲Vet TechDE005 
マイクロバンクス(クライオバイアル)Pro-Lab DiagnosticsPL.170/Y 
IVIS Spectrum CTCaliper- A PerkinElmer Company133577 Rev A/ Spectrum CT&nbsp;
6kVA UPSキャリパー - PerkinElmer社 
XGI-8麻酔システムキャリパー-パーキンエルマーカンパニー118918 
XAF-8麻酔フィルターチャコールキャリパー-パーキンエルマーカンパニー118999/00 
Living Image v4.3.1 SP1Caliper- PerkinElmerの会社 
卓上振盪インキュベーターNew Brunswick ScientificInnova 44 

メル

参考文献

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