出芽酵母の蛍光タイムラプス作品を取得し、移植片を使用したシングルセルダイナミクスの解析

サマリー

我々は、単一セルの時系列データを抽出するために蛍光成長酵母細胞の顕微鏡ムービー、GUIベースのソフトウェアパッケージを取得する単純なプロトコルを提示する。分析では、目視検査と追跡対象データの手動キュレーションと統合され自動化された系統と分裂時間の割り当てが含まれています。

要約

蛍光タイムラプス顕微鏡は、単一細胞レベルでの多くの生物学的過程の研究の強力なツールとなっています。具体的には、遺伝子発現の時間依存性を示すムービーは、その規制のダイナミクスへの洞察を提供するが、単一細胞の蛍光ムービーを取得し、分析する多くの技術的課題がある。ここでは、そのようなデータを生成するために市販のマイクロ流体培養装置を用いた単純なプロトコル、およびMATLABベースのグラフィカル·ユーザー·インターフェース（GUI）系蛍光画像を定量化するためのソフトウェアパッケージを説明する。ソフトウェアセグメントとトラックセル、ユー​​ザが視覚的にデータのエラーをキュレーションすることができますし、自動的に系統と分裂時間を割り当てます。 GUIはさらに、全細胞トレースならびにそれら第一及び第二の時間導関数を生成するために時系列を解析する。ソフトウェアはS.のために設計されましたが出芽酵母は、そのモジュール性と多様性は、それトン許可する必要がありますいくつかの変更を他の細胞型を研究するためのプラットフォームとしての役割を果たす、Ø。

概要

遺伝子発現の単一細胞解析は遺伝子調節の多くの側面の我々の理解を進めたた。フローサイトメトリーまたは顕微鏡を用いて蛍光レポーター発現の静的なスナップショットは、単一セルの発現の分布に有用な情報を提供するが、直接遺伝子発現動態を通知するために必要な時系列データの履歴と進化を欠いている。蛍光タイムラプス顕微鏡は、単一セルの測定とその歴史の両方を取得する手段を提供します。種々の実験および解析技術は、このような遺伝子調節機能洞察を付与する、蛍光レポーター発現の映画を取得し、定量化するために開発されている（概説^1を参照）は、セル間のばらつき^2,3、細菌persister形成^4、転写として開始と伸長^5、6,7を破裂転写、細胞周期依存性^8,9、および遺伝^10。しかし、OBTaining品質単一細胞蛍光時系列は、培養の重要な技術的課題に制御環境で、取得した蛍光映画のハイスループット定量化における細胞の単層を伴う。ここでは、Sの蛍光ムービーを取得し、分析するための手順を説明細胞培養装置の製造における、またはソフトウェア開発の経験のない必須（ 図1） セレビシエ 。

まず、我々は詳細例プロトコルを一つ以上の蛍光レポーターを表現する出芽酵母用蛍光時系列ムービーを生成する。カスタマイズされたマイクロ流体....

プロトコル

1。マイクロ流体商工会議所で成長シングル酵母細胞の蛍光顕微鏡のビデオを入手

1. 新たに成長しているプレートから細胞を1ミリリットルSC培地（2％グルコースとアミノ酸の完全な補完と合成定義されたメディア）を接種し、一晩培養をインキュベート〜30時ころドラム上16時間℃の最後のOD _600nmの初期_の対数増殖期のために〜0.1であるような文化を準備します。
2. OD _600nmの = 0.1にスターター、必要に応じて文化や新鮮な試験管で再生する1ミリリットル追加の6-8時間を希釈。これは、マイクロ流体デバイスへのロードに適し密度で栄養豊富な定常状態で成長して細胞を提供する。 （代わりに、実験に必要な細胞を調製するために必要な手続きと手順1.1から1.2を交換してください。）
3. CellAsicからY04Cマイクロ流体培養プレートを準備します。出荷ソリューションを削除;滅菌水で井戸をすすぎ、そしてONIX灌流システムフローを使用チャネルをフラッシュする5分間6 psiで井戸1-6を通る水。その後、10秒（ローディングチャンネルがはるかに高い流量を持っており、別々にフラッシュする必要があります）のために6 psiでうまくロード8からの流れ。
4. すべての井戸から水を取り出して、よく8ロードセ​​ル内の入口で250μlのSC井戸1-6とステップ1.2からの培養液50μlと交換してください。 （代わりに、異なる条件....

結果

正常に実行され、分析実験は、現実的に割り当てられた芽の出現と分割時間を持つ単一の細胞全体のために主に連続的な時系列が得られます。例として、我々は表4、Y47の成長とグローバルな表現は、単一の細胞で、経時的に変化するかを観察するために構成的ADH1プロモーターによって駆動セルリアン蛍光タンパク質（CFP）（の統合されたコピーを表現ハプロイド酵母株と上記のプロトコルを実行）。我々は、時間をかけて全細胞（ 図7A）測定値を得るために時系列解析を実行し、および⁹に見られるように、細胞周期に依存して、ボリュームおよび発現の両方に現れる。芽の形成後、総合計体積（母+芽）タンパク質濃度、または平均強度ながら^、（8,16と整合）芽の出現以前よりもより迅速に増加し、（ 図7Bおよび7C）わずかに減少。組み合わせた統合の上昇テッドタンパク質（この場合はボリュームをx濃度）また、出芽（ 図7D）の後に加速します。単独母領域（ 図7.......

ディスカッション

上記のプロトコルでは、マイクロ流体、またはソフトウェア開発の限られた経験を有する蛍光時系列データを取得して分析するための簡単​​な方法が記載されている。バーテン追跡および系統の割り当て;、関連するセルサイズおよび発現測定値を抽出し、それは1つは、単一の酵母細胞の経時蛍光ムービーを取得することができ、市販のマイクロ流体培養装置を用いて、時間と汎用性の高いグラフィカルユーザ上で細胞全体の挙動を解析するインタフェース（GUI）。実験、セグメンテーション、およびトラッキングのステップは様々な方法以前に^11,13,14でアプローチしてきたが、上記の手順は、生物学コミュニティの広いサブセットにこれらの技術をよりアクセシブルにするために設計されています。上記の手順は、特定のマイクロ流体培養装置用に最適化されている間、全体的な分析がより安価でカスタマイズ可能になる既製のマイクロ流体培養技術など同様のデバイスに適合させることができる。 Fundamentally、我々は採用セグメンテーションと地域の測定アルゴリズムは、既存の方法^13,14に似ていますが、移植片ソフトウェアは視覚的に地域の追跡および系統の割り当て.......

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
Y04C 酵母灌流プレート	CellAsic	Y04C-02
ONIX マイクロ流体灌流プラットフォーム	CellAsic	EV-262
Axio Observer.Z1 顕微鏡	ツァイス
プランアポクロマート 63x/1.40 オイル DIC 対物レンズ	ツァイス	440762-9904-000
カスケード II EMCCD カメラ	フォトメトリクス
Lumen 200メタルハライドアークランプ	PRIOR Scientific
トリプルバンドパスダイクロイックフィルターキューブと励起および発光フィルターセット	Chroma Technology Corp	set #89006	YFP (Venus/Citrine)、CFP (Cerulean)、RFP (mCherry/tdTomato)
MAC 5000 コントローラーおよびフィルターホイール	Ludl Electronic Products
MATLAB R2011a	Mathworks		64ビット版は32ビット版よりも大容量データファイルに対応

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